CN104706599B

CN104706599B - 一种携带膜海鞘素化合物的冻干粉针剂

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Publication number: CN104706599B
Application number: CN201310667141.4A
Authority: CN
Inventors: 王成; 管华诗; 于广利; 吕志华; 刘延凯; 李明
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2013-12-11
Filing date: 2013-12-11
Publication date: 2020-10-02
Anticipated expiration: 2033-12-11
Also published as: CN104706599A

Abstract

本发明属于海洋药物新剂型和纳米药物制备技术领域，特别是涉及一种携带膜海鞘素化合物的冻干粉针剂及其制备方法和应用。本发明的膜海鞘素化合物冻干粉针剂，可以加水复溶成为纳米级的粒子，极大降低此类药物的毒副作用，同时提高其疗效，动物实验显示较目前已进入临床实验的药物如法马马公司研制的

Description

一种携带膜海鞘素化合物的冻干粉针剂

技术领域

本发明属于海洋药物新剂型和纳米药物制备技术领域，特别是涉及一种携带膜海鞘素化合物的冻干粉针剂及其制备方法和应用。

背景技术

Rinehart在美国专利5,294,603中对含有与药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂混合的膜海鞘素的药用组合物提出权利要求。提供了大量的研究以测试生物活性，特别提供了对细胞毒性和抗病毒的检测结果。法马马公司于CN1170586C中膜海鞘素化合物的制剂做了专利陈述，其产品也进入了II期临床，但仍未有效解决此类药物的水溶性及毒性问题，在临床上存在极大毒副作用。

本发明解决了膜海鞘素化合物的水溶性问题，使其临床使用时不需要加入有机溶媒，极大降低其毒副作用，同时所成型的制剂，以纳米级的粒子存在，静脉给药后，被动聚集肿瘤部位，极大提高疗效。本发明所述的膜海鞘素化合物，包括膜海鞘素和膜海鞘素衍生物，如去氢膜海鞘素、降膜海鞘素(nordinemnins)膜海鞘素同源物(didemnin congeners)和膜海鞘素类似物。本发明特指有限水溶性的膜海鞘素。并以脱氢膜海鞘素B(Aplidine，Dehydrodidemnin B)为例对其发明历程、方法、用途以及与其现有制备方法、制剂、疗效等进行详细对比，以陈述本发明的创新、优势，但应当理解，下述以aplidine为例仅仅用于阐述和解释本发明，而并不限制本发明的范围。对于本发明中提及但没有详细说明的方法、步骤、装置、仪器、材料等，普通技术人员可以采用本领域熟知的相应方法、步骤、装置、仪器、材料等，或者按照本领域的常规知识和技术获得。

脱氢膜海鞘素B(Aplidine，Dehydrodidemnin B)最早是从地中海海鞘Aplidiumalbicans中分离的环状缩肽。

有关aplidine的信息可以在以下文献中找到，例如：WO91/04985中称作aplidine的Dehydrodidemnin B；WO02/2596中公开的化合物，CN101575363A，CN1761480B，CN1423564A，WO91/9485、WO98/1352、WO99/42125、WO0176616、WO01/35974、WO02/30441和WO02/2596中找到，以及如下文献：

Jimeno，J.，“Exploitation of marine microorganisms and invertebrates：Anticancer drugs from marine origin”，IBC conf Discov Drugs from Nat NovelApproaches New Sources(Dec8-9，London)1944，1944

Faircloth，G.et al.，“Dehydrodidemnin B(DDM)a new marine derivedanticancer agent(MDA)with activity against experimental turnour models”，9thNC1-EORTC Symp New Drugs Cancer Ther(March12-15，Amsterdam)1966，Abst111.

Sakai，R.et al.，“Structure-activity relationships of the didemnins”，Journal of Medicinal Chemistry1996，39(14)：2819

Urdiales，J.L.et al.，“Antiproliferative effect of dehydrodidemnin B(DDB)，a depsipeptide isolated from Mediterranean tunicates”，CancerLetters1996，102(1-2)：31

Faircloth，G.et al.，“Preclinical characterization of aplidine(APD)，anew marine anticancer depsipeptide(MADEP)”，Proc Amer Assoc Cancer Res1997，38：Abst692.

Depenbrock，H.et al.，“In vitro activity of aplidine，a new marine-derived anti-cancer compound，on freshly explanted clonogenic human tumourcells and haematopoietic precursor cells”，Bristish Joumal of Cancer1998，78(6)：739.

Faircloth，G.et al.，“Aplidine(aplidine)is a novel marine-deriveddepsipeptide with in vivo antitunour activity”，Proc Amer Assoc CancerRes1998，39：Abst1551.

Faircloth，G.et al.，“Preclinical development of aplidine，a novelmarine-derived agent with potent antitumour activity”，10th NCI-EORTC Symp NewDrugs Cancer Ther(June16-19，Amsterdam)1998，Abst129.

Mastbergen，S.C.et al.，“Cytotoxicity and neurocytoxicity of aplidine，anew marine anticancer agent evaluated using in vitro assays”，10th NCI-EORTCSymp New Drugs Cancer Ther(June16-19，Amsterdam)1998，Abst131.

做为在此处使用的术语aplidine涵盖任何药学可接受的盐、酯、溶剂合物、水合物或前体药物化合物，在使用它们后能给接受者提供(直接或间接地)化合物aplidine，盐或其它衍生物以及前体药物的制备，可以采用本领域已知的方法实施。目前体外、I期和II临床研究已经证实Aplidine具有与抗癌剂一样的用途，显示有效的抗人肿瘤固体细胞系，特别是抗IC50值分别在0.18nM和0.45nM上的非小细胞肺肿瘤和结肠肿瘤细胞的体外活性(Fairocloth等，1995，Proceedings8^th ECCO Congress，Paris，Abstranctno.122，529；Lobo等，1997，Anticancer Res，17，333-336)。国立癌症研究所(NCI)的人体外小组已证实对非小细胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、卵巢癌和结肠值肠癌细胞系的选择性(Faircloth等，1996，Ann Oncol.，7，34).儿科的白血球过多症的I期实验已经完成了(Jimeno J.et al.，2002，AnnOncol.，13(suppl.5)，Abst.65P)。aplidine还可以抑制编码血管内皮生长因子(VEGF)受体的基因(FLT1)表达，可以严重抑制由肿瘤细胞产生的VEGF蛋白；此外aplidine还可以调节细胞中的钙离子通道功能(CN1423564A)。其主要作用方式，包括阻断VEGF分泌、抑制蛋白质的合成和信号转导以及诱导G1细胞周期停滞等。

然而由于Aplidine疏水性，其临床使用受到限制，西班牙法马马有限公司在CN14235664A，WO99/42125，CN1761480B，US2006172926A1，US20090298752A1以及

J.A.Maroun.et al.，“Phase1study of Aplidine in a daily×5one-hourinfusion every3weeks in patients with solid tumors refractory to standardtherapy.A National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group study：NCIC CTG IND115”

Sandrine Faivre，et al.，“Phase I and Pharmacokinetic Study ofAplidine，a New Marine Cyclodepsipeptide in Patients with AdvancedMalignancies.”

“

Data Presented at Multiple Myeloma Research FoundationMeeting”等均提到将aplidine制备成无菌冻干产品供应和储存的。其实施方案采用含有25mg/mL D-甘露醇作为膨胀剂的注射用水(WfI)中40％(V/V)叔丁醇溶解的500mg/mL的aplidine溶液进行冻干。每管瓶含500mg aplidine和25mgD-甘露醇作为膨胀剂的原型在溶解性、冻干循环长度和临床研究的剂量要求方面是最优配方。发现最优重建溶液为15/15/70％(V/V/V)Cremaphor EL/乙醇/WfI(CEW)。重建产品和重建产品的生理盐水稀释液(最多到1：100v/v)至少在制备后24小时是稳定的。储存数据表明此配方在4℃下暗处储存时至少可以在1年内保持稳定。临床使用时，根据计算所得的每个病人的剂量的重建溶液体积，将所需重建溶液体积缓慢注射到含有100-1000ml0.9％氯化钠的输液袋或瓶中，缓慢手工摇动使其混匀。Aplidine输注溶液应静脉内给予，越快越好，在制备后48小时内进行。然而其制剂存在如下问题，aplidine的冻干粉制备使用叔丁醇，增加对冻干设备的要求，同时叔丁醇的残留也给样品复溶，临床使用带来风险。并且由于稀释液含有大量的有机溶媒乙醇和Cremaphor EL，静脉注射具有溶血风险，且易发生神经毒性，轻者可出现头痛、震颤、失眠、梦魇、畏光、感觉迟钝等，重者可出现运动不能、缄默症、癫痫发作、脑病等，加重患者的痛苦。

本领域技术人员一直致力于开发海洋药物，解决海洋药物的毒副作用，或提高其在靶器官的药物浓度，以期更好的发挥疗效，但是目前尚无有效解决aplidine或其药用盐在临床抗肿瘤时遇到的难题。

发明概述：

针对aplidine本身药物特性，以及目前aplidine现有组合物的缺陷，我们经过多种尝试，开发了aplidine新型冻干粉针剂，涉及包含作为活性成份的aplidine的药物制剂，以及其制备方法，临床使用时，加注射用水于aplidine冻干粉针剂稀释溶解，就会自组装成粒径在10nm-200nm之间的粒子，aplidine或其药用盐被包裹于粒子中，基于“EPR”效应，可以将aplidine更多的蓄积于肿瘤组织中，提高疗效，降低毒副作用，我们通过动物实验发现我们制备的aplidine冻干制剂较西班牙法马马有限公司所制备的冻干制剂具有更大的耐受剂量及疗效；且由于只使用注射用水溶解，无乙醇和Cremaphor EL，因此极大降低刺激性及毒副作用；aplidine的抗肿瘤效果有剂量依赖关系(Maroun JA，et al.2006，CousueloGajate，et al.2003)，因此提高aplidine给药剂量，可以更有效抑制癌细胞；然而现有法马马公司的冻干制剂由于毒性限制其给药剂量，而我们研发的aplidine冻干制剂由于毒副作用降低，最大耐受剂量提高，肿瘤组织靶向性提高，在适当增加给药剂量的前提下，显示出较法马马公司制备的aplidine冻干制剂更好的肿瘤组织聚集及抑瘤效果。

Aplidine或其药用盐与可降解的嵌段聚合物的重量配比为：Aplidine或其药用盐1份、可降解的嵌段聚合物1.5～99份。进一步的，重量配比为：Aplidine或其药用盐1份、可降解的高分子材料3～80份。更进一步地，重量配比为：aplidine或其药用盐1份、可降解的高分子材料5～50份。

其中，原料药优选采用aplidine。

生物可降解的嵌段共聚合物其亲水性嵌段(A)选自聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇或α-羧基-ω-羟基聚乙二醇，疏水性组份(B)选自聚乳酸、聚(ε-内酯)、聚乙醇酸、聚(乳酸-乙醇酸)、以及它们的混合物，优选聚乳酸和聚(ε-内酯)。其组成嵌段共聚物是A-B、A-B-A或B-A-B型嵌段共聚物，亲水性组份和疏水性组份的重均分子量分别是1500-3500道尔顿和1000-4000道尔顿。

本发明aplidine冻干粉针剂，可采用下述方法制备：

(1)将聚合物和Aplidine化合物溶于有机溶剂如无水乙醇或叔丁醇或乙腈等，得到澄清溶液A；而后通过喷雾或减压抽真空等方式除去有机溶剂，得到共分散物B；往共分散物B注入注射用水，使其溶解，过滤，得溶液C；加入含有稀释剂的注射用水稀释到所需浓度，并通过pH调节剂调pH值至合适范围，而后将溶液过滤、分装、冻干，即Aplidine化合物的冻干粉针剂。临床使用时，加注射用水或生理盐水或注射用葡萄糖用水稀释溶解即可。

该制备工艺较西班牙法马马公司制备工艺存在如下优点：①有机溶媒通过喷雾、冻干2次工序，彻底清除干净，②制成的冻干制剂加注射用水即可溶解，不需要添加任何有机溶媒如乙醇和增溶剂Cremaphor EL等，降低毒副作用；③所复溶的aplidine溶液，aplidine被包裹在粒径10-200nm的纳米粒子中，在静脉给药过程中，减少药物对血管组织的刺激性，同时基于“EPR”效应，较高浓度聚集于肿瘤部位，随着药物从粒子中扩散及载体降解，缓慢释放起效。④极大降低药品成本。

(2)将聚合物和Aplidine化合物或稀释剂、pH值调节剂共溶于叔丁醇或叔丁醇与水的混合物，得到澄清溶液E；将溶液过滤进行冻干制成Aplidine化合物的冻干粉针剂。临床使用时，加注射用水或生理盐水或注射用葡萄糖用水稀释溶解，过滤即可。

该制备工艺较西班牙法马马公司制备工艺存在如下优点：①制成的冻干制剂加注射用水即可溶解，不需要添加任何有机溶媒如乙醇和增溶剂Cremaphor EL等，降低毒副作用；②所复溶的aplidine溶液，aplidine被包裹在粒径10-200nm的纳米粒子中，在静脉给药过程中，减少药物对血管组织的刺激性，同时基于“EPR”效应，较高浓度聚集于肿瘤部位，随着药物从粒子中扩散及载体降解，缓慢释放起效；③极大降低药品成本。

化合物aplidine可以与其它化合物共同形成统一的复方冻干粉针剂或者本发明的aplidine冻干粉针剂与其它药物合用，从而提供结合治疗。对其他药物的特征没有特殊限定，适当的候选物包括：

a)具有抗有丝分裂作用的药物，特别是定位于细胞骨架元件的药物，包括微管调节剂如taxane药物(如紫衫酚、紫杉醇、泰素帝、多西他赛)，鬼臼毒素或长春碱类(长春新碱、长春花碱)；

b)抗代谢药物(如5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、吉西他滨、嘌呤类似物如喷司他丁、氨甲碟呤)；

c)烷化剂或氮芥(如nitrosoureas、环磷酰胺或异环磷酰胺)。

d)具有靶DNA的药物，如antracycline药物多柔比星、阿霉素、表阿霉素或表柔比量；

e)具有靶拓朴异构酶的药物，如依托泊苷；

f)激素和激素协同剂或拮抗剂如雌激素、抗雌激素(他莫苷芬和相关化合物)和雄激素、氟他胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林、cyprotrone或奥曲肽；

g)定位于肿瘤细胞信号传递的药物，包括抗体衍生物如herceptin。

h)烷化剂如铂类药物(顺铂、卡铂、奥沙利铂、paraplidineatin)或nitrosoureas。

i)潜在影响肿瘤转移的药物如基质金属蛋白酶抑制剂。

J)基因治疗和反义试剂。

K)抗体治疗

L)其它海洋来源的生物活性化合物，著名的有kahalalide F或ecteiascidins如et-743.

M)骨骼肌保护剂如肉碱补充物。

O)其它对抗aplidine副作用的药物如止吐剂。

P)mTOR抑制剂西罗莫司或其同系物，埃坡霉素类化合物及其衍生物如埃坡霉素B的半合成类似物(Ixabepilone)，天然埃坡霉素B(Patupilone)，埃坡霉素类似物(KOS-1584)，沙戈匹隆(Sagopilone)等。

q)更常用的药物，允许aplidine以推荐剂量给药和控制毒性。

其中与aplidine一起包裹于纳米载体的药物优选紫杉烷药物如紫杉醇、多烯紫杉醇，西罗莫司，埃坡霉素类化合物及其衍生物如Ixabepilone，Sagopilone等

附图说明

图1为aplidine-Z-1冻干粉针剂用注射用水复溶后的性状照片。

图2为aplidine-Z-1冻干粉针剂注射用水复溶后所测粒径。

图3为aplidine-Z-1冻干粉针剂注射用水复溶后所测透射电镜照片。

图4为aplidine冻干粉针剂(aplidine-Z)与按照法马马公司处方工艺制备的冻干制剂(aplidine-R)在同等给药剂量下，肿瘤组织中aplidine的定量测定柱形图。

图5为aplidine冻干粉针剂(aplidine-Z)与按照法马马公司处方工艺制备的冻干制剂(aplidine-R)分别在同等给药剂量，不同给药剂量下(Aplidine-Z由于提高了耐受剂量，所以临床可以提高给药剂量)，种瘤小鼠的肿瘤体积曲线。

图6.为aplidine冻干粉针剂(aplidine-Z)与按照法马马公司处方工艺制备的冻干制剂(aplidine-R)分别在同等给药剂量，不同给药剂量下(Aplidine-Z由于提高了耐受剂量，所以临床可以提高给药剂量)，给药后小鼠生存期曲线

图7.为aplidine冻干粉针剂(aplidine-Z)与按照法马马公司处方工艺制备的冻干制剂(aplidine-R)分别在同等给药剂量，不同给药剂量下(Aplidine-Z由于提高了耐受剂量，所以临床可以提高给药剂量)，给药后小鼠肿瘤照片

具体实施方式

以下是本发明中所用材料的中文名及对应简称的说明：

1、二嵌段聚合物：聚乙二醇-聚乳酸，简称MPEG-PLA，或MPEG-PDDLA

聚乙二醇-聚(ε-己内酯)，简称MePEG-PCL，或MPEG-PCL。

2、三嵌段聚合物：聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸，简称PLA-PEG-PLA，PDDLA-PEG-PDLLA。

聚(ε-己内酯)-聚乙二醇-聚(ε-己内酯)，简称PCL-PEG-PCL，或PCEC。

3、甲氧基聚乙二醇，简称MePEG，或MPEG。

4、聚乳酸：PLA，PDDLA

5、聚(ε-己内酯)，简称PCL。

6、聚乙二醇，简称PEG。

7、aplidine，简称AP

实施例1

(1)将MPEG-PDDLA与aplidine按一定质量比(9g：1g)共溶于100mL无水乙醇中，超声溶解加入喷雾干燥仪中，快速干燥，收集干燥后粉末，加950ml14％(W/V)蔗糖注射用水溶液，振摇超声溶解后，调pH值至5.0，补加14％(W/V)蔗糖注射用水溶液至1000ml刻度，0.22um加压过滤，滤液分装，1ml/瓶，置冻干机中快速冷冻至-40℃，预冻4h，升华干燥，得到aplidine冻干粉(aplidine-Z-1)，备用。使用时，取1瓶aplidine-Z-1冻干粉加2ml注射用水或0.9％氯化钠注射用水或葡萄糖注射用水，振摇溶解，待气泡消散后，汲出加入500ml生理盐水或葡萄糖注射用水中，静脉输注。

实施例2

(2)将MPEG-PDDLA与aplidine按一定质量比(9g：1g)共溶于100mL无水乙醇中，超声溶解加入喷雾干燥仪中，快速干燥，收集干燥后粉末，加950ml14％(W/V)蔗糖注射用水溶液，振摇超声溶解后，调pH值至6.0，补加14％(W/V)蔗糖注射用水溶液至1000ml刻度，0.22um加压过滤，滤液分装，1ml/瓶，置冻干机中快速冷冻至-40℃，预冻4h，升华干燥，得到aplidine冻干粉(aplidine-Z-2)，备用。使用时，取1瓶aplidine-Z-2冻干粉加2ml注射用水或0.9％氯化钠注射用水或葡萄糖注射用水，振摇溶解，待气泡消散后，汲出加入500ml生理盐水或葡萄糖注射用水中，静脉输注。

实施例3

(3)将MPEG-PCL与aplidine按一定质量比(9g：1g)共溶于100mL无水乙醇中，超声溶解加入喷雾干燥仪中，快速干燥，收集干燥后粉末，加950ml14％(W/V)蔗糖注射用水溶液，振摇超声溶解后，调pH值至5.0，补加14％(W/V)蔗糖注射用水溶液至1000ml刻度，0.22um加压过滤，滤液分装，1ml/瓶，置冻干机中快速冷冻至-40℃，预冻4h，升华干燥，得到aplidine冻干粉(aplidine-Z-3)，备用。使用时，取1瓶aplidine-Z-3冻干粉加2ml注射用水或0.9％氯化钠注射用水或葡萄糖注射用水，振摇溶解，待气泡消散后，汲出加入500ml生理盐水或葡萄糖注射用水中，静脉输注。

实施例4

(4)将PDDLA-PEG-PDLLA与aplidine按一定质量比(9g：1g)共溶于100mL无水乙醇中，超声溶解加入喷雾干燥仪中，快速干燥，收集干燥后粉末，加950ml14％(W/V)蔗糖注射用水溶液，振摇超声溶解后，调pH值至5.0，补加14％(W/V)蔗糖注射用水溶液至1000ml刻度，0.22um加压过滤，滤液分装，1ml/瓶，置冻干机中快速冷冻至-40℃，预冻4h，升华干燥，得到aplidine冻干粉(aplidine-Z-4)，备用。使用时，取1瓶aplidine-Z-4冻干粉加2ml注射用水或0.9％氯化钠注射用水或葡萄糖注射用水，振摇溶解，待气泡消散后，汲出加入500ml生理盐水或葡萄糖注射用水中，静脉输注。

实施例5

(5)将MPEG-PDDLA与aplidine按一定质量比(9g：1g)共溶于100mL叔丁醇中，超声溶解加入喷雾干燥仪中，快速干燥，收集干燥后粉末，加950ml14％(W/V)蔗糖注射用水溶液，振摇超声溶解后，调pH值至5.0，补加14％(W/V)蔗糖注射用水溶液至1000ml刻度，0.22um加压过滤，滤液分装，1ml/瓶，置冻干机中快速冷冻至-40℃，预冻4h，升华干燥，得到aplidine冻干粉(aplidine-Z-5)，备用。使用时，取1瓶aplidine-Z-5冻干粉加2ml注射用水或0.9％氯化钠注射用水或葡萄糖注射用水，振摇溶解，待气泡消散后，汲出加入500ml生理盐水或葡萄糖注射用水中，静脉输注。

实施例6

(6)将MPEG-PDDLA与aplidine按一定质量比(9g：1g)共溶于100mL叔丁醇中，超声溶解加入喷雾干燥仪中，快速干燥，收集干燥后粉末，加950ml14％(W/V)蔗糖注射用水溶液，振摇超声溶解后，调pH值至6.0，补加14％(W/V)蔗糖注射用水溶液至1000ml刻度，0.22um加压过滤，滤液分装，1ml/瓶，置冻干机中快速冷冻至-40℃，预冻4h，升华干燥，得到aplidine冻干粉(aplidine-Z-6)，备用。使用时，取1瓶aplidine-Z-6冻干粉加2ml注射用水或0.9％氯化钠注射用水或葡萄糖注射用水，振摇溶解，待气泡消散后，汲出加入500ml生理盐水或葡萄糖注射用水中，静脉输注。

实施例7

(7)将MPEG-PDDLA与aplidine按一定质量比(9g：1g)共溶于1000mL叔丁醇中，超声溶解，0.22um加压过滤，滤液分装，1ml/瓶，置冻干机中快速冷冻至-40℃，预冻4h，升华干燥，得到aplidine冻干粉(aplidine-Z-7)，备用。使用时，取1瓶aplidine-Z-7冻干粉加2ml注射用水或0.9％氯化钠注射用水或葡萄糖注射用水，振摇溶解，待气泡消散后，汲出加入500ml生理盐水或葡萄糖注射用水中，静脉输注。

实施例8

(8)将MPEG-PDDLA与aplidine按一定质量比(9g：1g)共溶于pH5.5的1000mL(4：6注射用水：叔丁醇)混合溶剂中，超声溶解，0.22um加压过滤，滤液分装，1ml/瓶，置冻干机中快速冷冻至-40℃，预冻4h，升华干燥，得到aplidine冻干粉(aplidine-Z-8)，备用。使用时，取1瓶aplidine-Z-8冻干粉加2ml注射用水或0.9％氯化钠注射用水或葡萄糖注射用水，振摇溶解，待气泡消散后，汲出加入500ml生理盐水或葡萄糖注射用水中，静脉输注。

实施例9

(9)将MPEG-PDDLA与aplidine按一定质量比(9g：1g)共溶于pH6.5的1000mL(4：6注射用水：叔丁醇)混合溶剂中，超声溶解，0.22um加压过滤，滤液分装，1ml/瓶，置冻干机中快速冷冻至-40℃，预冻4h，升华干燥，得到aplidine冻干粉(aplidine-Z-9)，备用。使用时，取1瓶aplidine-Z-9冻干粉加2ml注射用水或0.9％氯化钠注射用水或葡萄糖注射用水，振摇溶解，待气泡消散后，汲出加入500ml生理盐水或葡萄糖注射用水中，静脉输注

实施例10

(10)将MPEG-PDDLA与aplidine按一定质量比(9g：1g)共溶于pH6.5的14％(W/V)甘露醇1000mL(4：6注射用水：叔丁醇)混合溶剂中，超声溶解，0.22um加压过滤，滤液分装，1ml/瓶，置冻干机中快速冷冻至-40℃，预冻4h，升华干燥，得到aplidine冻干粉(aplidine-Z-10)，备用。使用时，取1瓶aplidine-Z-10冻干粉加2ml注射用水或0.9％氯化钠注射用水或葡萄糖注射用水，振摇溶解，待气泡消散后，汲出加入500ml生理盐水或葡萄糖注射用水中，静脉输注

实施例11

(11)将MPEG-PDDLA与aplidine按一定质量比(9g：1g)共溶于pH6.5的14％(W/V)乳糖1000mL(4：6注射用水：叔丁醇)混合溶剂中，超声溶解，0.22um加压过滤，滤液分装，1ml/瓶，置冻干机中快速冷冻至-40℃，预冻4h，升华干燥，得到aplidine冻干粉(aplidine-Z-11)，备用。使用时，取1瓶aplidine-Z-11冻干粉加2ml注射用水或0.9％氯化钠注射用水或葡萄糖注射用水，振摇溶解，待气泡消散后，汲出加入500ml生理盐水或葡萄糖注射用水中，静脉输注

实施例12

(12)将MPEG-PDDLA与aplidine按一定质量比(9g：1g)共溶于100mL无水乙醇中，超声溶解加入喷雾干燥仪中，快速干燥，收集干燥后粉末，加950ml14％(W/V)乳糖注射用水溶液，振摇超声溶解后，调pH值至5.0，补加14％(W/V)乳糖注射用水溶液至1000ml刻度，0.22um加压过滤，滤液分装，1ml/瓶，置冻干机中快速冷冻至-40℃，预冻4h，升华干燥，得到aplidine冻干粉(aplidine-Z-12)，备用。使用时，取1瓶aplidine-Z-12冻干粉加2ml注射用水或0.9％氯化钠注射用水或葡萄糖注射用水，振摇溶解，待气泡消散后，汲出加入500ml生理盐水或葡萄糖注射用水中，静脉输注。

实施例13

(13)将MPEG-PDDLA与aplidine按一定质量比(9g：1g)共溶于100mL无水乙醇中，超声溶解加入喷雾干燥仪中，快速干燥，收集干燥后粉末，加600ml注射用水溶液，振摇超声溶解后，调pH值至5.0，补加35％(W/V)乳糖注射用水溶液至1000ml刻度，0.22um加压过滤，滤液分装，1ml/瓶，置冻干机中快速冷冻至-40℃，预冻4h，升华干燥，得到aplidine冻干粉(aplidine-Z-13)，备用。使用时，取1瓶aplidine-Z-13冻干粉加2ml注射用水或0.9％氯化钠注射用水或葡萄糖注射用水，振摇溶解，待气泡消散后，汲出加入500ml生理盐水或葡萄糖注射用水中，静脉输注。

实施例14

(14)将MPEG-PDDLA与aplidine按一定质量比(9g：1g)共溶于100mL无水乙醇中，超声溶解加入喷雾干燥仪中，快速干燥，收集干燥后粉末，加600ml乳糖注射用水溶液，振摇超声溶解后，补加35％(W/V)乳糖注射用水溶液至950ml，调pH值至6.0，然后加35％(W/V)乳糖注射用水至1000ml刻度，0.22um加压过滤，滤液分装，1ml/瓶，置冻干机中快速冷冻至-40℃，预冻4h，升华干燥，得到aplidine冻干粉(aplidine-Z-14)，备用。使用时，取1瓶aplidine-Z-14冻干粉加2ml注射用水或0.9％氯化钠注射用水或葡萄糖注射用水，振摇溶解，待气泡消散后，汲出加入500ml生理盐水或葡萄糖注射用水中，静脉输注。

试验验证：

(1)取aplidine-Z-1至aplidine-Z-14冻干粉，加2ml注射用水，振摇溶解，通过Malvern Nano-ZS90laser particle size analyzer测定，结果见图1，2.其微观状态通过transmission electron microscope(TEM，H-6009IV，Hitachi，Japan).测定结果见图3

(2)肿瘤组织分布考察：将4T1乳腺癌细胞接种于8周(20±2g)BALB/c小鼠，当肿瘤体积长到200-300mm³，老鼠随机分成2组(n＝30)，然后分别尾静脉注射给予aplidine-Z-1和法马马公司的冻干制剂(aplidine-R)，给药剂量以0.2mg/kg aplidine计，6只老鼠分别在给药后1，4，8，12，24h时间点处死，取下肿瘤组织，冷藏到-20℃冰箱待检测。将肿瘤组织匀浆(ultra-turraxT10basic，IKA，Germany)，提取aplidine，HPLC检测，其结果见图4.

结果分析：自制aplidine冻干粉针剂(aplidine-Z，AP-Z)较法马马公司的冻干制剂 (aplidine-R，AP-R)在肿瘤部位具有较高的聚集浓度，靶向性，同时，具有缓释作用，在24h后仍然检测到aplidine药物，说明aplidine-Z所形成的纳米粒子在肿瘤组织聚集，药物缓慢释放，具有被动靶向和长效双重作用，可以极大提高药物疗效。

(3)抗肿瘤效果：将黑色素瘤B16-F10cells(2×10⁵cells)接种于C57BL/6mice(male，8-10weeks，20±20g)45只，皮下接种。当肿瘤体积长到100-200mm³时，随机分成3组(0天)，分别尾静脉给药NS，aplidine-R和aplidine-Z-14，给药剂量以0.2mg/kg aplidine计，分别在0，3，6，9，12天给药，期间计算肿瘤体积与生存期。结果见图5-7

结果分析：aplidine-Z较法马马公司的冻干制剂(aplidine-R)具有更好的抑制肿瘤效果，能够明显延长老鼠生存期。

(4)抗肿瘤效果：将骨髓瘤细胞MPC-11(6×10⁵cells)接种于BALB/c小鼠皮下(male，8-10weeks，20±20g)45只。当肿瘤体积长到80-150mm³时，开始随机分成3组(0天)，分别尾静脉给药NS，aplidine-R和aplidine-Z-2，给药剂量以0.2mg/kg aplidine计，分别在0，3，6，9，12天给药，期间计算老鼠体重，肿瘤体积，生存期。综合比较2组数据结果：

(5)抗肿瘤效果：将人ACHN肾癌细胞株(1×10⁷cells)接种于裸鼠皮下(male，8-10weeks，20±20g)45只。当肿瘤体积长到80-150mm³时，开始随机分成3组(0天)，分别尾静脉给药NS，aplidine-R和aplidine-Z-3，给药剂量以0.2mg/kg aplidine计，分别在0，3，6，9，12天给药，期间计算老鼠体重，肿瘤体积，生存期。综合比较2组数据结果：

(6)抗肿瘤效果：将耐药胰腺癌MIA PaCa-2cells(1.5×10⁶cells)接种于BALB/c裸鼠皮下(male，8-10weeks，20±20g)45只。当肿瘤体积长到100-200mm³时，开始随机分成3组(0天)，分别尾静脉给药NS，aplidine-R和aplidine-Z-3，给药剂量以0.2mg/kg aplidine计，分别在0，3，6，9，12天给药，期间计算老鼠肿瘤体积，生存期。综合比较2组数据结果：

结果分析：aplidine-Z较法马马公司的冻干制剂(apl idine-R)具有更好的抑制肿瘤效果，能够明显延长老鼠生存期。

Claims

1.一种携带膜海鞘素化合物的冻干粉针剂，其包括由具有亲水嵌段A和疏水嵌段B的生物可降解的嵌段共聚物组成的聚合物胶束载体，以及被物理包埋在聚合物中的活性成分膜海鞘素化合物；临床使用时加入注射用水或氯化钠注射用水或葡萄糖注射用水，振摇，自组装成粒径在10nm～200nm的粒子；

所述冻干粉针剂的制备工艺在于：

(1)将嵌段共聚物和膜海鞘素化合物溶于有机溶剂，得到澄清溶液A；而后通过喷雾或减压抽真空方式除去有机溶剂，得到共分散物B；往共分散物B注入注射用水，使其溶解，过滤，得溶液C；加入含有稀释剂的注射用水稀释到所需浓度，并通过pH调节剂调pH值至合适范围，而后将溶液0.22μm加压过滤、分装、置冻干机中快速冷冻至-40℃，预冻4h，升华干燥，得到膜海鞘素化合物的冻干粉针剂；

(2)将嵌段共聚物和膜海鞘素化合物，或嵌段共聚物、膜海鞘素化合物和pH值调节剂，或嵌段共聚物、膜海鞘素化合物、稀释剂和pH值调节剂共溶于叔丁醇或叔丁醇与水的混合物，超声溶解，得到澄清溶液E；将溶液0.22μm加压过滤，置冻干机中快速冷冻至-40℃，预冻4h，升华干燥制成膜海鞘素化合物的冻干粉针剂；

所述嵌段共聚物与膜海鞘素化合物的重量配比为5～50∶1；

所述膜海鞘素化合物为aplidine；

所述嵌段共聚物为MPEG-PDLLA、MPEG-PCL、PDLLA-PEG-PDLLA中的一种。

2.根据权利要求1所述的一种携带膜海鞘素化合物的冻干粉针剂，其中所述具有亲水嵌段A和疏水嵌段B的嵌段共聚物是A-B型嵌段共聚物，亲水嵌段A和疏水嵌段B的重均分子量分别是1500-3500道尔顿和1000-4000道尔顿。

3.根据权利要求1所述的一种携带膜海鞘素化合物的冻干粉针剂，其所述稀释剂是药学上可接受的，为乳糖、甘露醇、蔗糖、木糖醇、山梨醇、右旋糖酐、氯化钠、葡萄糖或它们的混合物。

4.根据权利要求3所述的一种携带膜海鞘素化合物的冻干粉针剂，所述稀释剂是乳糖、蔗糖或甘露醇。

5.根据权利要求1所述的一种携带膜海鞘素化合物的冻干粉针剂，其特征在于，所述的有机溶剂为乙醇、丙二醇、叔丁醇、乙腈、二氯甲烷或丙酮中的一种或几种的混合溶剂。

6.根据权利要求5所述的一种携带膜海鞘素化合物的冻干粉针剂，其特征在于，所述的有机溶剂为叔丁醇以及制药上许可使用的乙醇。

7.根据权利要求1所述的一种携带膜海鞘素化合物的冻干粉针剂，其特征在于所述的pH调节剂为氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸盐、苯甲酸盐、磷酸氢盐、柠檬酸、碳酸钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠，所述的pH值合适范围为5-6。

8.权利要求1-7任一项所述的一种携带膜海鞘素化合物的冻干粉针剂在制备治疗肾癌、结直肠癌、肺癌、骨髓瘤、胰腺癌、甲状腺髓样癌、黑色素瘤、非何杰金氏淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌药物中的应用。