CN104698111A - 乙醇基体标准物质及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乙醇基体标准物质及其制备方法。该方法包括以下步骤：将同一头牛的牛血与抗凝剂混合均匀得基体牛血，分别向5份所述的基体牛血中添加乙醇至量值水平，混合均匀，即得乙醇基体标准物质；其中，所述的量值水平为乙醇浓度，所述的乙醇浓度以mg/100mL计分别为X1、X2、X3、X4和X5，且X1＝0～15，X2＝10～40，X3＝30～70，X4＝60～100，X5＝80～120。本发明的乙醇基体标准物质的基体更加接近实际样品，具有很好的基体代表性，能够保证血液酒精检测项目更好的量值溯源，解决基体效应引起的检测结果差异问题，结果更加可靠和可比，且可在-20℃下长期保存。

Description

乙醇基体标准物质及其制备方法

技术领域

本发明涉及计量测试的量值传递领域，特别涉及乙醇基体标准物质及其制备方法。

背景技术

2008年世界卫生组织的事故调查显示，大约50％-60％的交通事故与酒后驾驶有关，酒后驾驶已经被列为车祸致死的主要原因。当乙醇在人体血液内达到一定浓度时，人对外界的反应能力及控制能力就会下降，处理紧急情况的能力也随之下降。对于酒后驾车者而言，其血液中乙醇浓度越高，发生交通事故的几率越大。

根据国家质量监督检验检疫局发布的《车辆驾驶人员血液、呼气酒精含量阈值与检验》(GB19522—2004)中规定，驾驶员血液中的乙醇浓度大于等于20mg/100ml，小于80mg/100ml时，属于饮酒驾驶。驾驶员血液中的乙醇浓度大于等于80mg/100ml时属于醉酒驾驶。《中华人民共和国道路交通安全法》最新规定，饮酒驾驶处以暂扣驾驶证、罚款等行政处罚，而醉酒驾驶严重得多，不但吊销驾驶证，还要依法追究刑事责任。因此准确测定血液中的乙醇浓度，特别是在接近法律规定的临界值时，显得尤为重要。

对于血液中乙醇浓度的测定方法，主要有醇脱氢酶氧化法、色谱法或免疫测定方法等，目前最准确的方法是顶空进样-气相色谱法，这也是进行司法鉴定时采用的标准方法。

标准物质Reference Material(RM)：是一种已经确定了具有一个或多个足够均匀的特性值的物质或材料，作为分析测量行业中的“量具”，在校准测量仪器和装置、评价测量分析方法、测量物质或材料特性值和考核分析人员的操作技术水平，以及在生产过程中产品的质量控制等领域起着不可或缺的作用。标准物质的制备途径主要有：人工合成、自然界物质提纯、人或动物组织来源提纯品或者基因工程重组标准物质。作为质控物质，最好选用天然的物质，与待测标本具有尽可能的相似性，否则将不具有充分的代表性。但是针对血液酒精检测项目，目前国内没有基体标准物质，因此司法鉴定实验室在进行相关检测时，所用的标准物质是乙醇纯度标准物质，该物质与待测标本相似性不够，并不具有充分的代表性。另外，人血液样品获得的难度大、成本高，难以保证标准物质的复制，因此，本领域亟需一种乙醇基体标准物质，其中的血液样品容易获取、成本低，且该标准物质稳定性好，以有效地解决上述技术难题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中针对血液酒精的检测使用的标准物质均是乙醇纯度标准物质，该物质与待测标本相似性不够，并不具有充分的代表性，且目前尚无乙醇基体标准物质的缺陷，而提供了一种乙醇基体标准物质及其制备方法。本发明的乙醇基体标准物质的基体更加接近实际样品，具有很好的基体代表性，能够保证血液酒精检测项目更好的量值溯源，解决基体效应引起的检测结果差异问题，结果更加可靠和可比，提高量值溯源水平，为酒驾案件的处罚判决提供依据，并且该乙醇基体标准物质中的血液样品容易获得，成本低，另外，本发明的乙醇基体标准物质的稳定性好，可在-20℃下长期保存。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：

本发明的目的之一在于：提供一种乙醇基体标准物质的制备方法，其包括以下步骤：

将同一头牛的牛血与抗凝剂混合均匀得基体牛血，分别向5份所述的基体牛血中添加乙醇至量值水平，混合均匀，即得乙醇基体标准物质；其中，所述的量值水平为乙醇基体标准物质中乙醇浓度，所述的乙醇浓度以mg/100mL计分别为X1、X2、X3、X4和X5，其中X1＝0～15，X2＝10～40，X3＝30～70，X4＝60～100，X5＝80～120，且满足以下条件：X1﹤X2﹤X3﹤X4﹤X5。

本发明中，以mg/100mL计，所述的量值水平较佳地为：X1＝0～2、X2＝15～25、X3＝35～45、X4＝75～85和X5＝85～95；更佳地为X1﹤0.2、X2＝20.0、X3＝40.0、X4＝80.0和X5＝90.0。

本发明中，所述的牛血为本领域常规的健康且新鲜的牛血，其离体时间小于72小时，乙醇残余量一般要求为小于0.2mg/100mL。所述的牛血中的乙醇残余量的检测方法为本领域常规方法，较佳地为顶空进样-气相色谱法。本发明之所以选择同一头牛的牛血，其原因在于：经实验发现，将不同牛的牛血混合后制得的乙醇基体标准物质，其中的乙醇在一周内几乎全部降解。

本发明中，所述的抗凝剂为本领域常规的抗凝剂；所述的抗凝剂较佳地为乙二胺四乙酸二钠。本发明中，所述的抗凝剂一般以溶液的形式与牛血混合。所述的抗凝剂溶液的配置方法一般为：将抗凝剂与生理盐水混合均匀，即可。所述的抗凝剂与生理盐水的质量体积比较佳地为0.015g/mL。所述的抗凝剂的添加量为本领域常规的添加量，所述的抗凝剂的添加量较佳地为每升牛血中添加1～2g抗凝剂，更佳地为每升牛血中添加1～1.5g抗凝剂。所述的抗凝剂一般经高压灭菌处理后再使用。所述的高压灭菌的条件可为本领域常规的条件，其中，所述的高压灭菌的温度较佳地为121℃；所述的高压灭菌的时间较佳地为25min～35min，更佳地为30min；所述高压灭菌的压力较佳地为0.122MPa。

本发明中，所述的将牛血与抗凝剂混合均匀的方法为本领域常规的方法，所述的将牛血与抗凝剂混合均匀的方法较佳地为晃动容纳牛血与抗凝剂的容器，即可。所述的将牛血与抗凝剂混合均匀的时间较佳地为3～10min，更佳地为5min。所述的基体牛血中的乙醇残余量一般要求为小于0.2mg/100mL。所述的基体牛血中的乙醇残余量的检测方法为本领域常规方法，较佳地为顶空进样-气相色谱法。

本发明中，所述的乙醇在使用时的用料纯度较佳地为乙醇标准物质，所述的乙醇标准物质较佳地为有证乙醇标准物质，即乙醇纯度标准物质(纯度99.8％，GBW06112)。

本发明中，在制得乙醇基体标准物质后，较佳地置于-20℃下保存。

本发明中，在制得乙醇基体标准物质后，较佳地还可进一步包括下列操作：乙醇基体标准物质的定值，均匀性检测和分装。所述的乙醇基体标准物质的定值，即准确确定乙醇基体标准物质中的乙醇的浓度。所述的乙醇基体标准物质的定值的方法为本领域常规的方法，较佳地包括以下步骤：取乙醇标准工作溶液0.50mL，至10mL顶空进样瓶中，加入100uL内标叔丁醇标准溶液，加盖铝盖后用密封钳加封；混匀，置顶空进样器中70℃加热10min待测；根据被测物与内标的峰面积比值绘制标准曲线，乙醇标准工作溶液每个浓度重复2次，取平均值，得标准曲线1；根据标准曲线1，测定乙醇基体标准物质中的乙醇浓度；乙醇基体标准物质中，同一量值水平取3份样品进行检测，每份样品检测2次，将6次结果，取平均值，即为乙醇基体标准物质中的乙醇浓度。其中，所述的乙醇标准工作溶液的制备方法可为本领域常规的方法，较佳地包括下列步骤：(1)配置浓度为8000mg/100mL乙醇储备液；(2)将所述的乙醇储备液用水稀释配制成浓度为2mg/100mL、20mg/100mL、40mg/100mL、80mg/100mL、160mg/100mL的乙醇标准工作溶液。所述的叔丁醇标准溶液的制备方法可为本领域常规的制备方法。所述的叔丁醇标准溶液的浓度较佳地为200mg/100mL。

所述的均匀性检测的方法为本领域常规的方法；较佳地为：随机取7份乙醇基体标准物质，检测乙醇基体标准物质中乙醇浓度，再以方差检验法对乙醇基体标准物质进行均匀性检验。

所述的分装的方法为本领域常规的方法。所述的分装较佳地为使用滴管、移液管、瓶口分液器或移液器分装；所述的分装更佳地为使用3mL的一次性无菌滴管分装。本发明中，所述的分装后较佳地于-20℃保存。

本发明的目的之二在于，提供如上所述的乙醇基体标准物质的制备方法制得的乙醇基体标准物质。

本发明中，所述的水若无特殊说明，一般为超纯水。所述的室温一般为10～30℃。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明首次公开了乙醇血液基体标准物质及其制备方法。本发明的乙醇基体标准物质的基体更加接近实际样品，具有很好的基体代表性，能够保证血液酒精检测项目更好的量值溯源，解决基体效应引起的检测结果差异问题，结果更加可靠和可比，提高量值溯源水平，为酒驾案件的处罚判决提供依据，避免不必要的司法纠纷，填补我国在乙醇基体标准物质方面的空白，该乙醇基体标准物质中的血液样品容易获得，成本低，另外，本发明的乙醇基体标准物质的稳定性好，可在-20℃下保存6个月以上。

附图说明

图1为牛血中乙醇浓度在不同保存条件下的量值变化图。

图2为乙醇纯度标准物质GBW06112配制的乙醇溶液中的乙醇浓度与检测值的线性关系曲线。

图3为乙醇基体标准物质中乙醇浓度与检测值的线性关系曲线。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。下述实施例中，称取物质时，均采用十万分之一分析天平。室温是指10～30℃。

下述实施例中，所用主要设备和试剂如下所示：

分析天平(METTLER TOLEDO)；

Milli-Q超纯水制备系统(Millipore)；

蒸汽高压灭菌锅(LDZX-50KBS，上海申安)；

MS2型旋涡混匀器(IKA)；

HP 7694E顶空进样器(Agilent)；

HP 6890气相色谱仪(Agilent)；

顶空样品瓶；

铝盖(含内垫)；

密封钳(Agilent)。

乙醇纯度标准物质(纯度99.8％，GBW06112)；

叔丁醇(纯度≥99.5％，Sigma)；

硫酸(分析纯，上海国药)；

乙二胺四乙酸二钠(分析纯，上海国药)；

氯化钠(分析纯，上海国药)。

新鲜健康牛血由上海牛羊肉公司提供，经顶空进样-气相色谱法检验，乙醇残余量均小于0.2mg/100mL。

实施例1基体的选择

以血为基体的标准物质，最佳的基体为人血，但是采用人血作为标准物质的基体血液有以下几个缺陷：1)人血液中可能含有致病原，例如肝炎、艾滋病等传染性致病因子，并且经严格筛查的健康人血，也可能会对使用者的健康造成威胁；2)人血获得成本高，且稳定性和可靠性差。以此，人血作为一种国家有证标准物质的候选物，是不合适的。而动物血液的组成与人血极为相似，从安全和经济两方面出发考虑，并且经试验发现，其可以作为本发明所研制的标准物质的基体血液。

作为一种添加法制备的基体标准物质候选物，所选择的血样必须能够实现稳定的、符合方法要求空白本底，这样才能在制备过程中能够针对性的浓度添加，而且保证没有其他外源物的污染和代谢物的干扰。

此处考察了新鲜牛血和猪血中的乙醇浓度，取同一头牛的牛血和同一头猪的猪血各3批，每批取6个样本，用顶空进样-气相色谱法检测其乙醇浓度，结果见表1。ND表示小于检出限，检出限为0.2mg/mL。

表1 新鲜牛血和猪血中的乙醇浓度

检测结果表明，由于新鲜猪血中本身普遍含有一定的乙醇，而牛血中乙醇本底低于检出限，符合本项目检测方法要求。

实施例2乙醇标准物质保存条件的研究

血液样品对保存条件有一定要求，如果保存不当会引起血液中乙醇浓度的降低。保存血液样品的两种常用方法是低温保存和添加防腐剂，而一般生物检测实验室最易实现的保存条件是4℃和-20℃。

因此我们选取4℃和-20℃两种温度进行考察，同时参照文献(马栋,卓先义,卜俊等.血液中乙醇保存稳定性研究[J]法医学杂志,2007,23(2):117-119.)选用1％NaF溶液作为防腐剂，考察防腐剂对保持牛血中乙醇浓度的作用。

取牛血样品四份，分别使用不同的保存条件，一段时间后检测牛血中乙醇浓度的变化(见图1)，结果如表2所示：

表2 不同保存条件下牛血中乙醇浓度的变化

无论是否添加防腐剂，4℃保存的样品在一段时间后乙醇浓度均有所下降，而-20℃保存的样品浓度不变。添加防腐剂虽然在一定程度上能延缓乙醇降解，但添加防腐剂之后血液样品的颜色气味发生明显改变。而在-20℃保存条件下未见乙醇浓度变化，因此本发明选择的乙醇基体标准物质的保存条件为-20℃，不添加防腐剂。

实施例3

乙醇基体标准物质的制备

(1)材料准备

抗凝剂溶液的配置及灭菌处理：取1.5g乙二胺四乙酸二钠和0.9g氯化钠，置于1L玻璃瓶中，加入100mL超纯水溶解，放入高压灭菌锅中灭菌处理，设置灭菌温度为121℃，灭菌时间为30min，灭菌压力为0.122MPa。

牛血采集：在上海牛羊肉公司采集健康牛的新鲜牛血，每100mL抗凝剂混合900mL新鲜牛血，盖紧瓶盖，轻柔晃动瓶身，使抗凝剂与牛血充分混合防止血液凝固，得基体牛血之后用冰盒马上转运到实验室。

基体牛血的初步筛查：使用顶空进样-气相色谱法对基体牛血进行初步检测，乙醇浓度小于0.2mg/100mL，作为基体血液，保存在4℃冰箱备用。

(2)配制一定浓度水平的血液中乙醇标准物质候选物

根据选定的量值水平(乙醇X1﹤0.2mg/100mL、X2＝20.0mg/100mL、X3＝40.0mg/100mL、X4＝80.0mg/100mL、X5＝90.0mg/100mL)，向初步筛查合格的基体牛血中添加乙醇纯度标准物质(纯度99.8％，GBW06112)，轻柔摇晃瓶子5min充分混匀，得牛血样品。

均匀性初步检验(分装前)：每个量值水平牛血样品随机取7份进行检测，检测乙醇的浓度，以方差检验法对牛血样品进行均匀性初步检验。

分装：均匀性检验合格后，使用一次性滴管分装成小瓶，每瓶不少于1mL。分装后立刻盖紧瓶盖，转移至-20℃保存，即为乙醇基体标准物质。

量值水平X1﹤0.2mg/100mL乙醇基体标准物质(空白样品)的配制：按照上述步骤初检、分装，无需添加。

量值水平X2＝20.0mg/100mL乙醇基体标准物质的配制：取40.08mg乙醇标准物质，转移至玻璃瓶中，加入200mL基体牛血，充分混匀。

量值水平X3＝40.0mg/100mL乙醇基体标准物质的配制：取80.16mg乙醇标准物质，转移至玻璃瓶中，加入200mL基体牛血，充分混匀。

量值水平X4＝80.0mg/100mL乙醇基体标准物质的配制：取160.32mg乙醇标准物质，转移至玻璃瓶中，加入200mL基体牛血，充分混匀。

量值水平X5＝90.0mg/100mL乙醇基体标准物质的配制：取180.36mg乙醇标准物质，转移至玻璃瓶中，加入200mL基体牛血，充分混匀。

实施例4乙醇标准物质的检测定值

(1)储备液的配制

乙醇储备液：取乙醇纯度标准物质GBW061124.008g于50mL容量瓶中，用超纯水定容并混匀得到8000mg/100mL乙醇储备液，保存在4℃冰箱备用。

(2)乙醇标准工作溶液的配制

乙醇标准工作溶液：吸取一定量的乙醇储备液，用水稀释配制成浓度为2mg/100mL、20mg/100mL、40mg/100mL、80mg/100mL、160mg/100mL的乙醇标准工作溶液。

叔丁醇标准溶液：称取1.005g叔丁醇于50mL容量瓶中，用超纯水定容并混匀得到200mg/100mL叔丁醇溶液，保存在4℃备用。

仪器检测条件设置

(1)顶空进样条件：

样品平衡温度：70℃；平衡时间：10min；气相色谱循环时间：15min；

(2)气相色谱条件：

色谱柱：HP-5；检测器：FID；柱温：40℃保持5min，30℃/min升至160℃。

(3)定量检测方法

用移液枪准确吸取乙醇标准工作溶液0.50mL，至10mL顶空进样瓶中，加入100uL内标叔丁醇标准溶液，加盖铝盖后用密封钳加封。混匀，置顶空进样器中70℃加热10min待测。根据被测物与内标的峰面积比值绘制标准曲线1(见图2，图中横坐标为乙醇与内标的峰面积比值，纵坐标为信号积分面积)，乙醇标准工作溶液每个浓度重复2次，取平均值。

根据标准曲线1，测定乙醇基体标准物质中的乙醇浓度；乙醇基体标准物质中，同一量值水平取3份样品进行检测，每份样品检测2次，将6次结果，取平均值，即为乙醇基体标准物质中的乙醇浓度。

乙醇纯度标准物质GBW06112配制的乙醇溶液中各浓度下乙醇与内标的峰面积及峰面积比值如表3所示。

乙醇基体标准物质定值结果如表4所示，ND表示小于检出限，检出限为0.2mg/mL。

表3 各浓度下乙醇与内标的峰面积及峰面积比值

表4 定值结果

实施例5乙醇基体标准物质的联合定值

按照ISO导则35《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法的要求》，将实施例3中的乙醇基体标准物质采用多家实验室合作定值的方法，邀请了八家具有检测能力的机构协同定值，协作单位分别是：1、上海市计量测试技术研究院；2、司法部司法鉴定科学技术研究所；3、上海市疾病预防控制中心；4、华东理工大学；5、上海市食品药品研究所；6、苏州大学司法鉴定中心；7、复旦大学医学院；8、中科院有机化学研究所。定值检测方法参照实施例4。

每个单位分别随机抽取的5种乙醇基体标准物质(X1、X2、X3、X4、X5)各3瓶，平行测定6次，进行定值分析。将8家单位定值的平均值作为乙醇基体标准物质的最终定值结果，结果见表5。

表5 乙醇基体标准物质中乙醇的最终定值结果

定值结果证明所制备的乙醇基体标准物质符合X1～X5的取值范围。

实施例6乙醇基体标准物质的实际应用

将实施例3制备的乙醇基体标准物质与人血样品比对。

用乙醇基体标准物质作标准曲线(在10～30℃下，将乙醇基体标准物质混匀后按照实施例4中定值检测方法操作，得标准曲线2)，测定人血样品中的乙醇浓度，并与司法部司法鉴定科学技术研究所提供的人血样品检测数据作比较，见表6。标准曲线见图3，图3中横坐标为乙醇与内标的峰面积比值，纵坐标为信号积分面积，表中SD为重复3次检测的标准偏差。

表6 乙醇基体标准物质与人血样品比对的定值结果

从表6可以看出，用实施例3中的乙醇基体标准物质作为标准曲线，检测出的人血样品中的乙醇浓度，与司法鉴定所提供的人血样品参考值之间有一定的误差，但是误差值均小于检测方法标准偏差，可以认为使用实施例3中的乙醇基体标准物质的检测值符合参考值，实际应用性良好。

实施例7乙醇基体标准物质与乙醇国际标准物质的比对

使用本发明制备的乙醇基体标准物质作为标准曲线，对两种NIST(美国国家标准技术研究院)的乙醇水溶液标准物质(乙醇浓度分别为20mg/100mL和80mg/100mL)进行检测。检测结果见表7。

表7 乙醇基体标准物质与乙醇国际标物的比对

通过将实施例3中的乙醇基体标准物质与乙醇国际标准物质的量值比对，发现两者差值很小，且小于检测方法标准偏差，证明实施例3中的乙醇基体标准物质量值准确可靠。

实施例8稳定性考察

稳定性考察采用经典稳定性研究，即同时制备的样品在相同条件下随着时间的推移进行测量。分别在样品制备完成后当天、1、2、3、4、5、6个月对制备的乙醇基体标准物质进行长达半年的长期稳定性考察，贮存温度为-20℃，每个时间点随机抽取3瓶，每个样品重复测定2次，取6个数据的平均值。

由于没有物理或化学模型能够真实地描述牛血中乙醇的降解机理，故可选用线性模型作为该标准物质的经验模型。实际上在此模型中的特性量值(乙醇的浓度)而言，人们期望直线的截距(在不确定度范围内)等于该标准物质的定值结果；同时，直线的斜率趋近于零。各标准物质稳定性研究实验数据见表8。

表8 乙醇基体标准物质的长期稳定性考察结果(mg/100mL)

乙醇基体标准物质	当天	1个月	2个月	3个月	4个月	5个月	6个月
								X1	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND
X2	18.76	18.96	19.01	18.67	18.62	19.54	18.45
								X3	38.80	38.48	39.12	39.62	38.44	39.97	38.83
X4	78.87	79.52	81.16	80.08	80.91	78.99	78.35
								X5	91.52	88.78	89.25	91.15	88.57	90.84	89.98

以标准物质X2为例，选用线性模型对其稳定性进行评价，结果见表9。

表9 贮存在4℃的乙醇标准物质X2的稳定性数据

时间(月)	X2(mg/100mL)
		0(当天)	18.76
1	18.96
		2	19.01
3	18.67
		4	18.62
5	19.54
		6	18.45

计算0～6个月共计7个点的数据，直线斜率可用下式计算：

${\mathrm{\β}}_1=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}(X_i-\stackrel{\‾}{X})(Y_i-\stackrel{\‾}{Y})}{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(X_i-\stackrel{\‾}{X})}^2}=-0.00571---\left(1\right)$

式中： $\stackrel{\‾}{Y}=18.86,\stackrel{\‾}{X}=3$

截距可由下式计算：

${\mathrm{\β}}_0=\stackrel{\‾}{Y}-{\mathrm{\β}}_1\stackrel{\‾}{X}=18.88---\left(2\right)$

直线上每点的标准偏差可用下式计算：

$s^2=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(Y_i-{\mathrm{\β}}_0-{\mathrm{\β}}_1{X}_i)}^2}{n-2}---\left(3\right)$

取平方根，得s＝0.3914，与斜率相关的不确定度为：

$s\left({\mathrm{\β}}_1\right)=\frac{s}{\sqrt{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(X_i-\stackrel{\‾}{X})}^2}}=0.07396---\left(4\right)$

在自由度为n-2＝5，置信水平p＝0.95(95％的显著水平)下，t检验的临界值等于2.57。

$\left|{\mathrm{\&beta;}}_1\right|<t_{0.95,n-2}\&CenterDot;s\left({\mathrm{\&beta;}}_1\right)---\left(5\right)$

其他标准物质的长期稳定性评价方法同上，结果见表10，实验结果表明该套乙醇基体标准物质在-20℃条件下保存半年内是稳定的。

表10 乙醇基体标准物质(X2-X5)的长期稳定性评价结果

/	X2	X3	X4	X5
					斜率β1	-0.00571	0.08536	-0.02143	-0.04214
截距β0	18.88	38.78	79.89	90.14
					s(β1)	0.07396	0.1127	0.2138	0.2447
t0.95,n-2·s(β1)	0.1901	0.2897	0.5495	0.6289
					结论	稳定	稳定	稳定	稳定

Claims (10)

1.一种乙醇基体标准物质的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：将同一头牛的牛血与抗凝剂混合均匀得基体牛血，分别向5份所述的基体牛血中添加乙醇至量值水平，混合均匀，即得乙醇基体标准物质；其中，所述的量值水平为乙醇浓度，所述的乙醇浓度以mg/100mL计分别为X1、X2、X3、X4和X5，且X1＝0～15，X2＝10～40，X3＝30～70，X4＝60～100，X5＝80～120，且满足以下条件：X1﹤X2﹤X3﹤X4﹤X5。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：以mg/100mL计，所述的量值水平为：X1＝0～2、X2＝15～25、X3＝35～45、X4＝75～85和X5＝85～95；较佳地为X1﹤0.2、X2＝20.0、X3＝40.0、X4＝80.0和X5＝90.0。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：

所述的牛血的离体时间小于72h；其乙醇残余量小于0.2mg/100mL；所述的基体牛血中的乙醇残余量的检测方法为顶空进样-气相色谱法；

所述的抗凝剂为乙二胺四乙酸二钠；

所述的抗凝剂以溶液的形式与牛血混合；所述的抗凝剂溶液的配置方法为：将抗凝剂与生理盐水混合均匀，即可；所述的抗凝剂与生理盐水的质量体积比为0.015g/mL；

所述的抗凝剂的添加量为每升牛血中添加1～2g抗凝剂，较佳地为每升牛血中添加1.5g抗凝剂；

和/或，所述的抗凝剂经高压灭菌处理后再使用；其中，所述的高压灭菌的温度较佳地为121℃；所述的高压灭菌的时间较佳地为25min～35min，更佳地为30min；所述高压灭菌的压力较佳地为0.122MPa。

4.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述的将牛血与抗凝剂混合均匀的方法为晃动容纳牛血与抗凝剂的容器，即可；所述的将牛血与抗凝剂混合均匀的时间为3～10min，较佳地为5min；所述的基体牛血中的乙醇残余量小于0.2mg/100mL；所述的基体牛血中的乙醇残余量的检测方法为顶空进样-气相色谱法。

5.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述的乙醇在使用时的用料纯度为乙醇标准物质，所述的乙醇标准物质较佳地为乙醇纯度标准物质，所述的乙醇纯度标准物质的纯度99.8％，证书号为GBW06112。

6.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：在制得乙醇基体标准物质后，置于-20℃下保存；

和/或，制得乙醇基体标准物质后，还进一步包括下列操作：乙醇基体标准物质的定值，均匀性检测和分装。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述的乙醇基体标准物质的定值的方法包括以下步骤：取乙醇标准工作溶液0.50mL至10mL顶空进样瓶中，加入100uL内标叔丁醇标准溶液，加盖铝盖后用密封钳加封；混匀，置顶空进样器中70℃加热10min待测；根据被测物与内标的峰面积比值绘制标准曲线，乙醇标准工作溶液每个浓度重复测定2次，取平均值；得标准曲线1；根据标准曲线1，测定乙醇基体标准物质中的乙醇浓度；乙醇基体标准物质中，同一量值水平取3份样品进行检测，每份样品检测2次，将6次结果，取平均值，即为乙醇基体标准物质中的乙醇浓度。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述的乙醇标准工作溶液的制备方法包括下列步骤：(1)配置浓度为8000mg/100mL乙醇储备液；(2)将所述的乙醇储备液用水稀释配制成浓度为2mg/100mL、20mg/100mL、40mg/100mL、80mg/100mL、160mg/100mL的乙醇标准工作溶液；

和/或，所述的叔丁醇标准溶液的浓度为200mg/100mL。

9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述的均匀性检测的方法为：随机取7份乙醇基体标准物质，检测乙醇基体标准物质中乙醇浓度，再以方差检验法对乙醇基体标准物质进行均匀性检验；

和/或，所述的分装为使用滴管、移液管、瓶口分液器或移液器分装；所述的分装较佳地为使用3mL的一次性无菌滴管分装；所述的分装后，较佳地于-20℃保存。

10.一种如权利要求1～9任一项所述的制备方法制得的乙醇基体标准物质。