CN104698063A - 一种用于监测癌细胞骨转移的同位素示踪方法 - Google Patents
一种用于监测癌细胞骨转移的同位素示踪方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104698063A CN104698063A CN201510074691.4A CN201510074691A CN104698063A CN 104698063 A CN104698063 A CN 104698063A CN 201510074691 A CN201510074691 A CN 201510074691A CN 104698063 A CN104698063 A CN 104698063A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cancer cell
- bone tumour
- solution
- monitoring
- nude mice
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 81
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 title abstract description 15
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 title abstract description 14
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 claims abstract description 56
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims abstract description 33
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims abstract description 33
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 21
- WUKWITHWXAAZEY-UHFFFAOYSA-L calcium difluoride Chemical compound [F-].[F-].[Ca+2] WUKWITHWXAAZEY-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 19
- 229910001634 calcium fluoride Inorganic materials 0.000 claims abstract description 19
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 claims description 62
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 claims description 47
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 46
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 24
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 21
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 10
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 8
- QXDMQSPYEZFLGF-UHFFFAOYSA-L calcium oxalate Chemical compound [Ca+2].[O-]C(=O)C([O-])=O QXDMQSPYEZFLGF-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N Heavy water Chemical compound [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 claims description 6
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910004261 CaF 2 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- VBIXEXWLHSRNKB-UHFFFAOYSA-N ammonium oxalate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)C([O-])=O VBIXEXWLHSRNKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 230000004907 flux Effects 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 claims description 2
- 238000004760 accelerator mass spectrometry Methods 0.000 abstract description 17
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005025 nuclear technology Methods 0.000 abstract description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 230000008859 change Effects 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 230000037182 bone density Effects 0.000 description 10
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 10
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 9
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 9
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 230000003913 calcium metabolism Effects 0.000 description 5
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- XRASPMIURGNCCH-UHFFFAOYSA-N zoledronic acid Chemical compound OP(=O)(O)C(P(O)(O)=O)(O)CN1C=CN=C1 XRASPMIURGNCCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 4
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 4
- 229960004276 zoledronic acid Drugs 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 235000008216 herbs Nutrition 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- FNYLWPVRPXGIIP-UHFFFAOYSA-N Triamterene Chemical compound NC1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1C1=CC=CC=C1 FNYLWPVRPXGIIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 210000003191 femoral vein Anatomy 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 2
- 230000000010 osteolytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- UPLPHRJJTCUQAY-WIRWPRASSA-N 2,3-thioepoxy madol Chemical compound C([C@@H]1CC2)[C@@H]3S[C@@H]3C[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@](C)(O)[C@@]2(C)CC1 UPLPHRJJTCUQAY-WIRWPRASSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000010392 Bone Fractures Diseases 0.000 description 1
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 208000037147 Hypercalcaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010027336 Menstruation delayed Diseases 0.000 description 1
- 101100328463 Mus musculus Cmya5 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000005250 Spontaneous Fractures Diseases 0.000 description 1
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000010072 bone remodeling Effects 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000022458 calcium metabolism disease Diseases 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011254 conventional chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000000148 hypercalcaemia Effects 0.000 description 1
- 208000030915 hypercalcemia disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000001095 inductively coupled plasma mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000006680 metabolic alteration Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 238000002600 positron emission tomography Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 108010048734 sclerotin Proteins 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000176 thermal ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000013055 trapped ion mobility spectrometry Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于监测癌细胞骨转移的同位素示踪方法，是以41Ca为示踪剂，以加速器质谱(AMS)为示踪剂的测量方法，用于监测癌细胞骨转移发生、发展及消退过程，属于核技术应用领域。本发明包括如下步骤：(1)41Ca标记示踪剂的生成；(2)用41Ca标记示踪剂标记实验裸鼠；(3)采集步骤(2)所述裸鼠的尿样，分离出Ca元素；(4)取步骤(3)所得氟化钙粉末，测定41Ca/40Ca同位素丰度比；(5)绘制标准曲线；(6)分析差值，得到癌细胞骨转移程度。本发明解决了现有监测手段的灵敏度都相对较低、难以实现癌细胞骨转移的早期监测的问题，具有较高的临床应用价值和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于监测癌细胞骨转移的同位素示踪方法，具体地说，是以41Ca为示踪剂，以加速器质谱(AMS)为示踪剂的测量方法，用于监测癌细胞骨转移发生、发展及消退过程，属于核技术应用领域。
背景技术
近30多年，全世界对于癌症的研究深入基础与临床各个领域，各类癌症的多学科综合治疗方式已逐渐取得共识，但癌症患者的5年生存率依然徘徊不前、遭遇瓶颈，其中重要原因是癌症易产生远处播散。癌症患者出现远处转移时，近60％为骨转移(bone metastasis)，其中大约30％无症状。骨转移是肿瘤常见并且致命的并发症，多见于肺癌、乳腺癌、前列腺癌和肾癌。我国目前每年平均有200万新增癌症患者,其中50～60％的患者最终发生骨转移。由于癌细胞骨转移改变了骨组织的微环境，严重破坏了成骨细胞和破骨细胞功能的动态平衡，造成病理性骨折、恶性高钙血症、骨髓浸润、脊髓和神经压迫等多种骨相关事件，导致患者的中位生存时间仅为8～10个月。常规的化疗、放疗和手术并不能有效地减轻骨转移患者的症状、延长骨转移患者的生存期。如果能有效地预测骨转移，就能及时寻找合理的治疗手段对其进行干预和阻止，从而达到延长患者的生存时间、提高癌症患者生存率的目的。因此，深入研究癌症骨转移机制，对选择合理治疗方式(如基于骨转移分子机制的靶向治疗方法等)预防癌细胞骨转移、控制和减少骨相关事件的发生以及提高癌症患者生存率等都有着重要的临床意义。
目前医学上有多种手段用于辅助监测癌细胞骨转移，例如：骨代谢标志物检测、核素骨显像、X线检查、CT检查、磁共振成像(MRI)、正电子发射型断层扫描(PET)等。但是，这些检测手段的灵敏度相对都较低，难以实现癌细胞骨转移的早期监测。
常规的骨代谢标志物如I型胶原氨基末端肽(NTX)和羧基端肽(CTX)以及骨碱性磷酸酶(B-ALP)等可以反映癌细胞转移到骨骼的成骨率和破骨率的变化，癌细胞骨转移后这些代谢标志物会在一定程度上升高。但是，影响骨代谢标志物的因素很多，包括年龄、性别、肝肾功能、饮食、雌激素水平、日间波动以及季节等等，这些指标往往在不同时间段的变化很大。所以，骨代谢标志物检测只能作为一种可参考的辅助参数，并不能在临床上实际用于癌细胞骨转移的早期监测。
X线、CT、MRI等检查手段主要针对有局部症状的骨转移，其依靠病变部位骨组织溶骨性改变的程度和范围来监测是否转移，但病变部位需溶骨性改变到一定程度才能发现骨的密度和形态的变化(例如X线检查要求脱钙量>50％，且范围>1.5cm)。此类检查仅适用于对已确诊的骨转移部位进行详细监测，当检查出阳性结果时，癌细胞骨转移往往己到达晚期，并不能早期监测癌细胞是否有骨转移趋势。
核素骨显像是目前临床应用较为广泛的癌症骨转移监测技术，其采用放射性示踪剂吸附于骨表面，利用正常骨组织与病变骨组织对示踪剂吸附能力的差别来监测癌症的骨转移，此种方法检出时间较常规X线检查可提前1～6个月。但其监测骨转移的灵敏度仍然有限，仅在转移灶直径≥2mm，且有15％以上的局部骨代谢变化时才可以显示出来，监测出阳性结果时癌细胞已发生一定程度的骨转移，往往错过了最佳的诊治时间。因此该方法对早期监测癌细胞骨转移的作用是有限的。
另外，采用稳定钙同位素示踪方法(如42Ca、44Ca)研究人体内的钙代谢分布的方法在近年来也有很大的发展。但是，由于普通质谱(TIMS、ICP-MS)丰度灵敏度的限制(大约10-6),以及癌症骨转移早期表象监测对灵敏度的高要求，致使采用此种方法不太适合用于癌症骨转移早期监测研究。
此外，利用短寿命放射性同位素如45Ca、47Ca,由于半衰期短、放射性强，对生物细胞可能产生损害，故也限制其用于人体癌症骨转移早期监测方面的示踪研究。
而41Ca，作为长寿命放射性核素，不管是辐射安全、经济效益，还是示踪效果，在钙的同位素中，都是最理想的生物医学示踪剂。但长期以来，由于41Ca所特有的衰变特性，即较长的半衰期与较低的放射性，采用衰变计数法难以实现对它的高灵敏度测量。另外，由于同量异位素41K和分子离子40CaH的干扰，普通质谱法也不能实现对它的高敏度测量。所以，41Ca作为生物医学示踪剂一直没有得到广泛应用。直到加速器质谱(AMS)出现以后，才使41Ca的高灵敏测量成为现实。加速器质谱(AMS)测量技术作为一种能够准确测量低丰度、长寿命同位素的核分析技术，克服了传统质谱存在的分子本底和同量异位素本底干扰的限制，该方法不受检测物质的复合结构及基体效应的影响，非常适合41Ca生物样品的测量。
发明内容
本发明的目的是弥补现有技术不足，提供一种用于监测癌细胞骨转移的同位素示踪方法，具体地说，是以41Ca为示踪剂，以AMS法为测量方法，用于监测癌细胞骨转移。本发明解决了现有监测手段的灵敏度相对都较低，难以实现癌细胞骨转移的早期监测的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种用于监测癌细胞骨转移的同位素示踪方法，包括如下步骤：
(1)41Ca标记示踪剂的生成：取丰度>99％的40CaCO3，在重水反应堆上照射100±10小时，得到41CaCO3，然后溶于浓HCl溶液，生成41CaCl2溶液，即为41Ca标记示踪剂；
(2)用41Ca标记示踪剂标记实验裸鼠：将步骤(1)所得41Ca标记示踪剂，按剂量，注射在实验裸鼠体内；
(3)采集步骤(2)所述裸鼠的尿样，分离出Ca元素，包括如下步骤：
①在采集的尿样中，加入稳定的CaCO3为载体，先用浓HCl消解，再加热浓缩，得到溶液A；
②在溶液A中，加入去离子水，离心后，去除沉淀，保留上层清液；
③在步骤②所得上层清液中，加入过量14mol/L的氨水，得到溶液B，并使溶液B的pH值始终>10；
④在溶液B中，加入过量5％w/v的草酸铵溶液，静置≥10h，离心后，得到草酸钙沉淀；
⑤将步骤④所得草酸钙沉淀，用14mol/L的氨水冲洗后，置于空气中风干，再溶于5ml的0.1mol/L的HCl溶液，得到溶液C；
⑥在溶液C中，加入过量40％w/v的HF酸，静置≥10h，离心后，得到氟化钙沉淀；
⑦将步骤⑥所得氟化钙沉淀，用去离子水清洗；
⑧将步骤⑦所得去离子水清洗后的氟化钙，烘烤后，粉碎，得到氟化钙粉末，待测；
(4)取步骤(3)所得氟化钙粉末，测定41Ca/40Ca同位素丰度比，包括如下步骤：
①取氟化钙粉末，加入高纯PbF2粉末，混合均匀后，压入离子源样品靶锥；
②从离子源引出CaF3 -负离子，C剥离后，得到Ca7+离子，并通过探测器计数；
③通过离子源交替引出40CaF3 -负离子和41CaF3 -负离子，分别测量40CaF3 -和41Ca7+离子，得到步骤(2)所述实验裸鼠尿样的41Ca/40Ca同位素丰度比；
(5)绘制标准曲线：定时采集步骤(2)所述实验裸鼠的尿样，重复上述步骤(3)-(4)，分别得到不同时间段的41Ca/40Ca同位素丰度比数值，以时间为横坐标，以相应的41Ca/40Ca同位素丰度比数值为纵坐标，绘制成曲线，当所述相邻两纵坐标的差值≤3％，即所述实验裸鼠体内已标记了41Ca，即得到标准曲线；
(6)分析差值，得到癌细胞骨转移程度：继续定时采集步骤(2)所述实验裸鼠的尿样，重复上述步骤(3)-(4)，分别得到不同时间段的41Ca/40Ca同位素丰度比数值，并与步骤(5)所得标准曲线比较，得到差异值，即为骨代谢交换率变化值，即得到癌细胞骨转移程度。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤(1)所述反应堆的热中子通量为(5.0±0.5)×1014个/s·cm2，照射后的比活度为(5.0±0.2)×106Bq/g。
进一步，步骤(2)所述注射方法为股静脉法。
进一步，步骤(2)所述裸鼠，为5周龄裸鼠。
进一步，步骤(2)所述5周龄裸鼠，是在SPF级层柜内分笼饲养，饲养温度20～26℃，饲养相对湿度40～70％，食用灭菌处理过的水和辐照后的饲料。
进一步，步骤(2)所述剂量为单只裸鼠5纳居里。
进一步，步骤(3)①所述尿样的量为10ml，所述CaCO3的量为2mg，所述浓HCl的量为10ml，所述消解的时间为30分钟，所述浓缩的量为2ml。
进一步，步骤(3)⑧所述烘烤的温度为110℃，时间为2小时，所述粉碎的目数为≥100目。
进一步，步骤(3)所述离心的转速为2000转，时间为5分钟。
进一步，步骤(4)①高纯PbF2粉末的粒径为400目。
进一步，步骤(4)①所述CaF2粉末与加入的高纯PbF2粉末的质量比1:2～1:8。
进一步，步骤(4)①所述CaF2粉末与高纯PbF2粉末的质量比1:4。
进一步，步骤(5)所述定时，是每周收集一次实验裸鼠24小时的尿样。
进一步，步骤(6)所述定时，是每周收集一次实验裸鼠24小时的尿样。
进一步，步骤(6)所述差异值超过100％，即可认定为癌细胞骨转移。
本发明的有益效果是：
(1)本发明步骤(3)所述的从尿钙中分离出钙元素的方法，为加速器质谱(AMS)测量提供了最佳的生物钙样品分离方案，能最大程度地从尿液中提取草酸钙沉淀，使41Ca示踪剂所需的标记量仅为5纳居里，并相应延长了41Ca在生物体内的标记时间。
(2)本发明通过41Ca示踪与AMS测量，对癌细胞刺激下不同时间段体内的钙代谢行为，给出定量的分析与评价，对模型对象癌细胞骨转移过程中的41Ca信号异常变化进行分析拟合，得出41Ca代谢曲线与癌细胞扩散程度及骨转移的关系。
(3)本发明采用41Ca-AMS同位素示踪技术直接监测骨骼的钙代谢的变化，利用AMS的高灵敏度极大地提高癌症骨转移检测的灵敏度，可最大程度地提前癌症骨转移的检出时间，提高癌症患者的生存率，为临床上癌症的防治提供重要的科学依据，解决了现有监测手段的灵敏度都相对较低、难以实现癌细胞骨转移的早期监测的问题。
(4)本发明亦可用于研究抗癌药物抑制下癌细胞骨骼的破坏行为，建立抗癌细胞骨破坏行药物的评价方法，为临床上抗骨转移药物的研制和评价提供方法和依据。
附图说明
1、图1为本发明的实施流程图。
2、图2是本发明41Ca-AMS加速器质谱系统的实施流程图。
3、图3是本发明41Ca-AMS测量样品谱图(⊿E2-ER)。
4、图4是本发明标记41Ca后的裸鼠尿样中的41Ca代谢动力学曲线。
5、图5是本发明癌细胞骨转移前后裸鼠股骨组织切片对比图。
具体实施方式
以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
如图1所示，本发明的实施流程为：
(1)41Ca标记示踪剂的生成：取1g丰度>99％的40CaCO3，装入石英瓶，在中国原子能科学研究院重水反应堆(CARR)上照射100小时，反应堆的热中子通量为(5.0±0.5)×1014个/s·cm2，照射后的比活度为(5.0±0.2)×106Bq/g，即41Ca与40Ca的原子数比值约为7:105，得到41CaCO3，然后溶于10ml的36％w/w的浓HCl溶液，生成41CaCl2溶液，即为41Ca标记示踪剂；
(2)用41Ca标记示踪剂标记实验裸鼠：实验裸鼠在SPF级层柜内分笼饲养，饲养温度20～26℃，饲养相对湿度40～70％，食用灭菌处理过的水和辐照后的饲料，选取5周龄裸鼠88只，随机分为模型组(61只)和对照组(27只)，将步骤(1)所得41Ca标记示踪剂，采用股静脉法，按单只裸鼠5纳居里的剂量，注射在裸鼠体内；
(3)采集步骤(2)所述裸鼠的尿样，分离出Ca元素，包括如下步骤：
①在采集的10ml尿样中，加入2mg稳定的CaCO3为载体，先用10ml的36％w/w的浓HCl消解30分钟，再加热浓缩至2ml，得到溶液A；
②在溶液A中，加入去离子水，离心后，去除沉淀，保留上层清液；
③在步骤②所得上层清液中，加入过量14mol/L的氨水，得到溶液B，并使溶液B的pH值始终>10；
④在溶液B中，加入过量5％w/v的草酸铵溶液，静置≥10h，离心后，得到草酸钙沉淀；
⑤将步骤④所得草酸钙沉淀，用14mol/L的氨水冲洗后，置于空气中风干，再溶于5ml的0.1mol/L的HCl溶液，得到溶液C；
⑥在溶液C中，加入过量40％w/v的HF酸，静置≥10h，离心后，得到氟化钙沉淀；
⑦将步骤⑥所得氟化钙沉淀，用去离子水清洗；
⑧将步骤⑦所得去离子水清洗后的氟化钙，在110℃的温度下，烘烤2小时后，粉碎成≥100目的粉末，得到氟化钙粉末，待测；
(4)取步骤(3)所得氟化钙粉末，如图2所示，测定41Ca/40Ca同位素丰度比，包括如下步骤：
①取氟化钙粉末，按1:4比例加入400目粒径的高纯PbF2粉末，混合均匀后，压入离子源样品靶锥；
②从离子源引出CaF3 -负离子，C剥离后，得到Ca7+离子，并通过探测器计数；
③通过离子源交替引出40CaF3 -负离子和41CaF3 -负离子，分别测量40CaF3 -和41Ca7+离子，得到步骤(2)所述实验裸鼠尿样的41Ca/40Ca同位素丰度比，AMS测量样品谱图如图3所示；
(5)绘制标准曲线：每周采集一次步骤(2)所述实验裸鼠24小时的尿样，重复上述步骤(3)-(4)，分别得到不同时间段的41Ca/40Ca同位素丰度比数值，以时间为横坐标，以相应的41Ca/40Ca同位素丰度比数值为纵坐标，绘制成曲线，当所述相邻两纵坐标的差值≤3％，即所述实验裸鼠体内已标记了41Ca，即得到标准曲线；
(6)分析差值，得到癌细胞骨转移程度：继续每周采集一次步骤(2)所述实验裸鼠24小时的尿样，重复上述步骤(3)-(4)，分别得到不同时间段的41Ca/40Ca同位素丰度比数值，并与步骤(5)所得标准曲线比较，得到差异值，即为骨代谢交换率变化值，即得到癌细胞骨转移程度，当所述差异值超过100％，即可认定为癌细胞骨转移；
(7)乳腺癌细胞的培养：乳腺癌细胞株Walker 256由桂林医学院细胞所提供，培养于含10％小牛血清的PMI-1640培养液中并置于37℃、5％CO2的细胞培养箱内，每2～3天更换一次培养液；
(8)乳腺癌细胞的接种：第3周起，待41Ca已标记所述实验裸鼠后，模型组裸鼠均以Walker 256乳腺癌细胞原位注射造模，称为乳腺癌模型组(简称模型组)，其余正常裸鼠为对照组，模型组自接种后，每2～3天查看并记录一次荷瘤小鼠全身状况、活动情况及移植瘤的质地和大小，同时每周采集尿样和血样；
(9)乳腺癌骨转移监测：第4、5周，对照组与模型组各随机取5只裸鼠处死，采集股骨样进行骨密度(BMD)及骨组织病理形态学分析，之后，模型组每2周采用BMD扫描检验系统进行活体检测，每2～3天查看并记录一次荷瘤小鼠全身状况、活动情况及移植瘤的质地和大小，期间所有裸鼠每周采集一次10ml尿样测定41Ca/40Ca同位素丰度比数值，采集2ml血液做生化指标方法分析，即检测骨代谢标志物—Ⅰ型胶原氨基末端肽(NTX)，同时用骨密度(BMD)监测模型裸鼠骨质变化；
(10)骨转移后的抗肿瘤药物干预实验：第9周，对照组与模型组各随机取5只裸鼠处死，采集股骨样进行BMD、骨组织病理形态学分析，之后，模型组裸鼠随机均分为三组：无措施模型组作为阴性对照组，唑来膦酸治疗组作为阳性治疗Ⅰ组，中药治疗组作为阳性治疗Ⅱ组，治疗Ⅰ组裸鼠每周静脉注射唑来膦酸(Zoledronate)溶液(0.5mg/只鼠)连续注射3周，治疗Ⅱ组裸鼠每周口服色床子-补骨脂中药制剂溶液(0.5mg/只鼠)连续口服3周，继续每周做骨密度(BMD)分析，同时采集10ml尿样和2ml血样，分别测定41Ca/40Ca同位素丰度比数值和Ⅰ型胶原氨基末端肽(NTX)；
(11)乳腺癌骨转移裸鼠及正常裸鼠的后续监测：对剩余的裸鼠继续监测，第12周对照组、无措施模型组、唑来膦酸治疗组和中药治疗组各随机取5只裸鼠处死，对股骨样进行骨密度(BMD)、骨组织病理形态学及癌细胞荧光成像分析，其余裸鼠继续每周做骨密度(BMD)分析，同时采集10ml尿样和2ml血样，分别测定41Ca/40Ca同位素丰度比数值和Ⅰ型胶原氨基末端肽(NTX)，每2～3天查看并记录一次荷瘤小鼠移植瘤的质地和大小，第15周，处死所有裸鼠，采集股骨样进行骨密度(BMD)及骨组织病理形态学分析。
数据结果分析比较：
四组实验裸鼠尿钙的41Ca/40Ca同位素丰度比数值分别进行AMS分析检测，样品测定至少三次，41Ca/40Ca相对标准偏差(RSD)范围为0.5～7％(中值为3％)，测量谱图如图4所示。
(1)在标记骨骼后的第一个月内，41Ca/40Ca比值急剧下降，如图4(a)所示，这与体内钙库和尿液之间的快速钙交换规律相一致。该代谢曲线可由指数函数(R(t)＝A+B.ect)描述,其中，R(t)为41Ca/40Ca比值，A、B、C为反应个体差异的参数(常数)，均可由尿钙数据点拟合代谢曲线方程确定。该代谢曲线即作为标准曲线。数据表明，41Ca/40Ca比值在标记3周后，达到一个稳定值A(约2×10-10)，任何偏离上述标准曲线或上述稳定值A的扰动可被认定为体内钙代谢紊乱。
(2)Walker 256肿瘤细胞注射后20天左右，41Ca/40Ca比值迅速攀升，平均值相对增加166±25％，如图4(b、c、d)所示。当癌症扩散到骨骼中，骨代谢交换率会增加，而在骨重建部位的骨吸收率和骨沉积率出现不平衡。骨吸收率迅速增加会导致局部产生大量骨衍生的生长因子，从而刺激破骨细胞的形成以及进一步的骨破坏，如图5所示。然后，癌细胞浸润破坏了正常的骨代谢交换率，从而导致进一步的骨重塑序列的破坏，并从骨骼中释放出大量41Ca，最终导致尿样中41Ca/40Ca比值的上升。
(3)在治疗部分，如图4(c、d)所示，41Ca/40Ca比值随着治疗进程显著下降。唑来膦酸治疗组和中药治疗组中，41Ca/40Ca比值比图(a)的标准曲线外推比值(即A值)分别减少了23％和48％。这表明，唑来膦酸和中药对抑制骨转移有一定效果。也可以进一步说明，作为一种有效的方法，41Ca-AMS可评估癌症骨转移的治疗效果。
(4)表1列出41Ca-AMS的测量结果与传统的骨密度(BMD)、Ⅰ型胶原氨基末端肽(NTX)的比较结果。从表中可以看出，41Ca/40Ca比值与这两种生物指标正相关。在骨转移前后及治疗前后骨密度(BMD)和Ⅰ型胶原氨基末端肽(NTX)均呈显著差异，并且与骨转移前后和药物治疗前后41Ca/40Ca比值的变化具有相同的趋势。骨转移前后，骨密度(BMD)和Ⅰ型胶原氨基末端肽(NTX)的平均相对变化分别为-2.6±1.6％和123±30％。治疗一个月后骨密度(BMD)和Ⅰ型胶原氨基末端肽(NTX)的平均相对变化分别为11±2.3％和-42±30％，进一步证实了41Ca-AMS的测量结果与现有传统方法结果的关联性。
表1 41Ca-AMS方法与传统方法钙代谢参数的比较表
采用本发明所述的方法早期监测癌细胞骨转移，通过41Ca示踪与AMS测量，对乳腺癌细胞刺激下不同时间段裸鼠体内的钙代谢行为，给出定量的分析与评价，从而根据传统方法的检测结果，对模型组裸鼠癌细胞骨转移之前及过程中的41Ca信号异常变化进行分析拟合，得出41Ca早期代谢曲线与癌细胞扩散程度及骨转移的关系，为临床上癌症的防治提供重要的科学依据，解决了现有监测手段的灵敏度都相对较低，难以实现癌细胞骨转移的早期监测的问题。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种用于监测癌细胞骨转移的同位素示踪方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)41Ca标记示踪剂的生成：取丰度>99％的40CaCO3，在重水反应堆上照射100±10小时，得到41CaCO3，然后溶于浓HCl溶液，生成41CaCl2溶液，即为41Ca标记示踪剂；
(2)用41Ca标记示踪剂标记实验裸鼠：将步骤(1)所得41Ca标记示踪剂，按剂量，注射在实验裸鼠体内；
(3)采集步骤(2)所述裸鼠的尿样，分离出Ca元素，包括如下步骤：
①在采集的尿样中，加入稳定的CaCO3为载体，先用浓HCl消解，再加热浓缩，得到溶液A；
②在溶液A中，加入去离子水，离心后，去除沉淀，保留上层清液；
③在步骤②所得上层清液中，加入过量14mol/L的氨水，得到溶液B，并使溶液B的pH值始终>10；
④在溶液B中，加入过量5％w/v的草酸铵溶液，静置≥10h，离心后，得到草酸钙沉淀；
⑤将步骤④所得草酸钙沉淀，用14mol/L的氨水冲洗后，置于空气中风干，再溶于5ml的0.1mol/L的HCl溶液，得到溶液C；
⑥在溶液C中，加入过量40％w/v的HF酸，静置≥10h，离心后，得到氟化钙沉淀；
⑦将步骤⑥所得氟化钙沉淀，用去离子水清洗；
⑧将步骤⑦所得去离子水清洗后的氟化钙，烘烤后，粉碎，得到氟化钙粉末，待测；
(4)取步骤(3)所得氟化钙粉末，测定41Ca/40Ca同位素丰度比，包括如下步骤：
①取氟化钙粉末，加入高纯PbF2粉末，混合均匀后，压入离子源样品靶锥；
②从离子源引出CaF3 -负离子，C剥离后，得到Ca7+离子，并通过探测器计数；
③通过离子源交替引出40CaF3 -负离子和41CaF3 -负离子，分别测量40CaF3 -和41Ca7+离子，得到步骤(2)所述实验裸鼠尿样的41Ca/40Ca同位素丰度比；
(5)绘制标准曲线：定时采集步骤(2)所述实验裸鼠的尿样，重复上述步骤(3)-(4)，分别得到不同时间段的41Ca/40Ca同位素丰度比数值，以时间为横坐标，以相应的41Ca/40Ca同位素丰度比数值为纵坐标，绘制成曲线，当所述相邻两纵坐标的差值≤3％，即所述实验裸鼠体内已标记了41Ca，即得到标准曲线；
(6)分析差值，得到癌细胞骨转移程度：继续定时采集步骤(2)所述实验裸鼠的尿样，重复上述步骤(3)-(4)，分别得到不同时间段的41Ca/40Ca同位素丰度比数值，并与步骤(5)所得标准曲线比较，得到差异值，即为骨代谢交换率变化值，即得到癌细胞骨转移程度。
2.根据权利要求1所述的一种用于监测癌细胞骨转移的同位素示踪方法，其特征在于，步骤(1)所述反应堆的热中子通量为(5.0±0.5)×1014个/s·cm2，照射后的比活度为(5.0±0.2)×106Bq/g。
3.根据权利要求1所述的一种用于监测癌细胞骨转移的同位素示踪方法，其特征在于，步骤(2)所述剂量为单只裸鼠5纳居里。
4.根据权利要求1所述的一种用于监测癌细胞骨转移的同位素示踪方法，其特征在于，步骤(3)①所述尿样的量为10ml，所述CaCO3的量为2mg，所述浓HCl的量为10ml，所述消解的时间为30分钟，所述浓缩的量为2ml。
5.根据权利要求1所述的一种用于监测癌细胞骨转移的同位素示踪方法，其特征在于，步骤(3)⑧所述烘烤的温度为110℃，时间为2小时，所述粉碎的目数为≥100目。
6.根据权利要求1所述的一种用于监测癌细胞骨转移的同位素示踪方法，其特征在于，步骤(4)①所述CaF2粉末与加入的高纯PbF2粉末的质量比1:2～1:8。
7.根据权利要求1所述的一种用于监测癌细胞骨转移的同位素示踪方法，其特征在于，步骤(5)所述定时，是每周收集一次实验裸鼠24小时的尿样。
8.根据权利要求1所述的一种用于监测癌细胞骨转移的同位素示踪方法，其特征在于，步骤(6)所述定时，是每周收集一次实验裸鼠24小时的尿样。
9.根据权利要求1所述的一种用于监测癌细胞骨转移的同位素示踪方法，其特征在于，步骤(6)所述差异值超过100％，即可认定为癌细胞骨转移。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510074691.4A CN104698063B (zh) | 2015-02-12 | 2015-02-12 | 一种用于测定骨代谢交换率变化值的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510074691.4A CN104698063B (zh) | 2015-02-12 | 2015-02-12 | 一种用于测定骨代谢交换率变化值的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104698063A true CN104698063A (zh) | 2015-06-10 |
| CN104698063B CN104698063B (zh) | 2017-09-19 |
Family
ID=53345408
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510074691.4A Expired - Fee Related CN104698063B (zh) | 2015-02-12 | 2015-02-12 | 一种用于测定骨代谢交换率变化值的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104698063B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108918646A (zh) * | 2018-07-27 | 2018-11-30 | 中国核动力研究设计院 | 一种63Ni活度浓度测量方法 |
| CN110566184A (zh) * | 2019-09-17 | 2019-12-13 | 广西师范大学 | 一种利用14c核素进行油田井间示踪的方法 |
| CN113406115A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-09-17 | 中国辐射防护研究院 | 一种氟化钙渣中铀同位素含量的分析方法 |
| JP2021535383A (ja) * | 2018-08-29 | 2021-12-16 | ゲオマール ヘルムホルツ−ツェントルム フュア オツェアンフォアシュング キールGEOMAR Helmholtz−Zentrum fuer Ozeanforschung Kiel | 骨密度の低下を伴う疾患の診断方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004081573A1 (en) * | 2003-03-10 | 2004-09-23 | Novartis Ag | Method to evaluate the likelihood of development of bone metastasis based on the determination of calcium proteins |
| US20120282645A1 (en) * | 2011-04-27 | 2012-11-08 | Natural History Museum | Nanoparticles |
| US20130115650A1 (en) * | 2010-06-10 | 2013-05-09 | Acting for and on behalf of Arizona State University | Isotopic Biomarkers for Rapid Assessment of Bone Mineral Balance in Biomedical Applications |
| CN104181222A (zh) * | 2014-09-22 | 2014-12-03 | 天津出入境检验检疫局化矿金属材料检测中心 | 利用同位素示踪法分析鉴别进口铁矿国别的方法 |
-
2015
- 2015-02-12 CN CN201510074691.4A patent/CN104698063B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004081573A1 (en) * | 2003-03-10 | 2004-09-23 | Novartis Ag | Method to evaluate the likelihood of development of bone metastasis based on the determination of calcium proteins |
| US20130115650A1 (en) * | 2010-06-10 | 2013-05-09 | Acting for and on behalf of Arizona State University | Isotopic Biomarkers for Rapid Assessment of Bone Mineral Balance in Biomedical Applications |
| US20120282645A1 (en) * | 2011-04-27 | 2012-11-08 | Natural History Museum | Nanoparticles |
| CN104181222A (zh) * | 2014-09-22 | 2014-12-03 | 天津出入境检验检疫局化矿金属材料检测中心 | 利用同位素示踪法分析鉴别进口铁矿国别的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| EBERHARD DENK等: "Evaluation of 41Calcium as a New Approach to Assess Changes in Bone Metabolism", 《JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESEARCH》 * |
| P. E. WARWICK等: "Effective Determination of the Long-lived Nuclide 41Ca in Nuclear Reactor", 《ANAL. CHEM.》 * |
| T. SCHULZE-KONIG等: "Comparison of 41Ca analysis on 0.5 MV and 5 MV-AMS systems", 《NUCLEAR INSTRUMENTS AND METHODS IN PHYSICS RESEARCH B》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108918646A (zh) * | 2018-07-27 | 2018-11-30 | 中国核动力研究设计院 | 一种63Ni活度浓度测量方法 |
| JP2021535383A (ja) * | 2018-08-29 | 2021-12-16 | ゲオマール ヘルムホルツ−ツェントルム フュア オツェアンフォアシュング キールGEOMAR Helmholtz−Zentrum fuer Ozeanforschung Kiel | 骨密度の低下を伴う疾患の診断方法 |
| JP7379468B2 (ja) | 2018-08-29 | 2023-11-14 | ゲオマール ヘルムホルツ－ツェントルム フュア オツェアンフォアシュング キール | 骨密度の低下を伴う疾患の診断方法 |
| CN110566184A (zh) * | 2019-09-17 | 2019-12-13 | 广西师范大学 | 一种利用14c核素进行油田井间示踪的方法 |
| CN113406115A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-09-17 | 中国辐射防护研究院 | 一种氟化钙渣中铀同位素含量的分析方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104698063B (zh) | 2017-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104698063B (zh) | 一种用于测定骨代谢交换率变化值的方法 | |
| CN109053781A (zh) | 一种肿瘤诊疗一体化的硼携带剂 | |
| Emre Erdi | The use of PET for radiotherapy | |
| CN107544086A (zh) | 加马光子侦测成像装置与方法 | |
| Osborne et al. | The preoperative detection of internal mammary lymph node metastases in breast cancer | |
| Noordzij et al. | Nuclear medicine imaging techniques | |
| Shen et al. | Study on 41Ca-AMS for diagnosis and assessment of cancer bone metastasis in rats | |
| Wan | Application Prospect of Radionuclide Tracer Technology in Clinical Imaging Therapy and Drug Development | |
| CN105294769B (zh) | 用于骨骼系统疾病显像的99mTc标记的多胺基膦酸体系 | |
| CN109480889A (zh) | 一种股骨头缺血性坏死的定量检测方法 | |
| Borković et al. | Comparison of sampling and measurement methods for atmospheric 14C activity | |
| CN202003031U (zh) | 一种放射性核素碘-125核纯度快速测定装置 | |
| US11040119B2 (en) | Compositions and methods for assessing neuromuscular function | |
| Güner et al. | Technological Advancements in Nuclear Medicine and Molecular Imaging | |
| Othman et al. | Future of nuclear medicine-an overview | |
| Maksimova et al. | Optimization of planning radionuclide diagnostic tests in osteoscintigraphy | |
| Talbot et al. | Positron emission tomography with [18F]-FDG in oncology | |
| Tasnim et al. | Comprehensive Analysis and Quality Assessment of Freeze Dried Methylene Diphosphonate Labelled with 99m-Technetium: An Extensive Comparison of Biodistribution Study with Commercial Standards | |
| CN1065769C (zh) | 一种放射性药物制剂的制备方法 | |
| Hunter | Nuclear Medicine | |
| MacDonald | Recent uses of a total body counter facility in metabolic research and clinical diagnosis with radionuclides | |
| Napieczyńska | Imaging Neuronal Pathways of the Rat Basal Ganglia System with 52Mn PET and MEMRI | |
| Kovalenko et al. | Compact universal digital X-ray diagnostic system | |
| Balashov et al. | Organizational and technical ways of providing the population with accessible and high-quality radiodiagnosis in conditions of scarce resources | |
| WO2023166205A1 (en) | Theragnostic method for cancer patients |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170919 |