CN104697832A - 一种用于准确测定体液阳离子的样本前处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于准确测定体液阳离子的样本前处理方法，包括以下步骤：称取一定量的体液，加入(1-5)倍体液体积的浓硝酸，混合8-16h后在加热板上加热消化，加热板温度控制在100-150℃，加热1-4h，得到黄色固体物质；将加热板温度降至60-100℃，加入(2-5)倍体液体积的过氧化氢，继续消化，直至全部变成白色的无机盐粉末；采用浓度为0.2-2％的稀硝酸进行复溶，稀硝酸的加入量为(25-500)mL/g体液。采用本发明方法处理体液样本，可将体液直接矿化成无机盐，而不损失体液中的阳离子。采用分析仪器测定样本中的钾、钠、钙、镁离子，其准确度和不精密度能控制在1.0％以内。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种用于准确测定体液阳离子的样本前处理方法。
背景技术
正常人血清中分别含有K+3.5-5.4mmol/L、Na+135-145mmol/L、Ca2+2.25-2.75mmol/L、Mg2+0.74-1.0mmol/L和Cl-98-106mmol/L等电解质。这些电解质对保持体液酸碱平衡、维持渗透压起重要作用。当人体发生病变时，如糖尿病、酸中毒、肾衰竭、严重呕吐、腹泻、渗出性胸膜炎或腹膜炎等，会引起电解质浓度偏离正常范围。因此，及时而准确地测定病人体液中的电解质浓度，对诊断这些疾病具有重要意义。
检验结果的准确性，是临床医生对疾病进行诊断和治疗的重要依据。在临床实验室中如何确保检验结果的准确，是每个检验人员必须关心的问题。通常，在检验过程中使用具有溯源性的常规检测系统是保证检验结果准确的前提，而要实现常规检测系统的溯源必须依靠参考系统。参考系统包括：参考物质、参考方法和参考实验室，其中参考方法是参考系统的关键组成部分，是临床检验标准化的重要基础。参考方法需具有明确的、符合特定要求的测量不确定度，因而需基于可靠测量原理。对于无机离子类生化检验项目，其参考方法一般基于仪器分析原理，其中的同位素稀释质谱(ID/MS)、电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)、火焰光度法(FAES)、火焰原子吸收法(FAAS)、离子色谱法(IC)是目前国际上所主要采用的参考方法分析原理。这些分析原理都涉及样本前处理，因为体液中含有大量的有机物，如蛋白质，浓度可高达80g/L。这类样本如果不经处理直接进分析仪器，将存在基体干扰造成测量结果的不准确，有时甚至会损伤分析仪器。即使采用简单的样本稀释短时间内能准确测定，长时间运行该分析方法后会存在精密度和准确度下降的情况，分析方法稳健性(Robustness)较差。因此，在体液(如血清、血浆及其制品)电解质参考方法中，样本的前处理是非常重要的步骤。
经文献检索发现，目前在电解质参考方法的研究中主要采用两种样本前处理方法：最普遍的方法是直接稀释法(NBS special publication 260-63；NBS special publication260-36；J Chromatogr A,1997,789:557-568.；Clin Chim Acta,2000,292:55-68.；AnalChem,1994,66:2404-2408.；J Chromatogr A,1995,706:443-450.；Clin.Lab.2013；59(9-10):1061-1069.；Clin Chim Acta,2013；420:146-149.)，将血清样本采用水、稀酸或其他溶液直接稀释。二是微波消解法(Accred Qual Assur,2004,9:671-677.)，采用微波消解仪直接将血清样本消化成无机盐。采用直接稀释法操作简便，但存在很多不足。主要原因是血清样本中存在大量有机物，简单的酸稀释和过滤只能降低有机物的浓度，将与蛋白质结合的二价离子释放到溶液中，而无法彻底的去除蛋白质。采用FAES、FAAS、ICP-OES或ICP-MS检测这类样本中的阳离子时，或多或少存在光(质)谱干扰，使分析方法的精密度和准确度下降，采用IC法长时间检测这类样本会造成分析柱的污染和抑制器的损伤，导致基线漂移和分离度下降，同样会造成分析方法的准确度和精密度下降。采用微波消解法，可将血清样本直接矿化成无机盐，采用分析仪器检测可得到满意的结果。但该处理方法较繁琐，并需要昂贵的仪器，成本较高。
目前，还未见有基于湿法消化法，采用硝酸和过氧化氢体系将体液直接矿化成无机盐的样本前处理方法，以及将该前处理方法应用于电解质参考方法建立方面的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于准确测定体液阳离子的样本前处理方法。采用本发明方法处理体液样本，可将体液直接矿化成无机盐，而不损失体液中的阳离子。采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)、离子色谱(IC)、电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)等分析仪器测定样本中的钾、钠、钙、镁离子，其准确度和不精密度能控制在1.0％以内。
本发明所采用的技术方案为：
一种基于湿法消化的样本前处理方法，该方法以硝酸和过氧化氢为氧化剂，分两步将体液直接矿化成无机盐。具体步骤如下：
(1)称取一定量的体液，加入(1-5)倍体液体积的浓硝酸，混合8-16h后在加热板上加热消化，加热板温度控制在100-150℃之间，加热1-4h至近干，得到黄色固体物质；
(2)将加热板温度降至60-100℃之间，加入(2-5)倍步骤(1)中体液体积的过氧化氢，继续消化，直至全部变成白色的无机盐粉末(无液态状物质存在)；
(3)采用浓度为0.2-2％的稀硝酸溶解，进行复溶，稀硝酸的加入量为(25-500)mL/g体液。
作为优选，所述步骤(1)中体液为血清、血浆、脑脊液及其制品中的一种。
作为优选，所述步骤(1)中浓硝酸的浓度为70％、纯度为99.999％。
作为优选，所述步骤(1)中加热板温度控制在110-140℃之间；所述步骤(2)中加热板温度控制在70-80℃之间。
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：本发明以湿法消化为基础，采用硝酸和过氧化氢分两步将体液直接矿化成无机盐，其矿化率接近100％，消化后的产物为白色无机盐，总有机碳的含量接近于0；在处理过程中又不损失体液中的金属离子，采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)、离子色谱(IC)、电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)等分析仪器测定样本中的钾、钠、钙、镁离子，其准确度和不精密度可控制在1.0％以内，样本中的钾、钠、钙、镁等阳离子回收率在99％-101％之间。
与现有电解质参考方法中的样本前处理方法相比，本发明的样本前处理方法具有以下优点与特点：
(1)该样本前处理方法可将体液样本直接矿化成无机盐，而不损失样本中的阳离子，适用于阳离子参考方法的建立，适合推广至准确测定阳离子分析方法的样本前处理。
(2)与微波消解法相比，该样本前处理方法条件温和、操作简便、能耗和成本低，适合应用于电解质参考方法中。
(3)与直接稀释法相比，该样本前处理方法可提高分析方法的准确度和不精密度，降低基体效应，提高分析方法的稳健性。
附图说明
图1所示的是本发明实施例1得到的前处理后体液样本的紫外可见扫描光谱图；
图2所示的是本发明实施例1得到的前处理后体液样本的离子色谱仪检测的色谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
实施例1：
准确称取1.0mL的血清样本于50mL锥形瓶中，加入2.0mL的HNO3(浓度70％、纯度99.999％)，混匀，封口膜封口静置过夜(约12h)，然后放在电热板上加热消化，加热板温度调节至120℃，进行消化约2h，直至近干。将近干的样本取下冷却，再将加热板的温度调至80℃。待温度稳定后，在锥形瓶中加入4mL过氧化氢后加热直至完全煮干，此时，有白色粉末析出。冷却后，用0.2％的稀硝酸溶解并转移至25mL容量瓶中，定容至刻度，备用。
将实施例1得到的前处理后血清样本分别进行紫外可见扫描光检测和离子色谱仪检测检测，其图谱分别如图1、图2所示，离子色谱仪检测结果如表1所示。由检测结果可知，血清样本消化产物的紫外可见扫描光谱图与标准溶液的光谱图重合，无其他杂峰，表明该样本前处理可将血清样本直接矿化成无机盐。测定血清样本消化产物中的总有机碳(TOC)，也表明血清样本可直接矿化成无机盐。将消化产物用稀酸定容后，采用离子色谱仪检测，发现精密度和准确度可控制在1.0％以内。与决定性方法(ICP-MS)相比较，发现具有很好的相关性，表明该样本前处理方法非常适合应用于阳离子参考方法。
表1 本发明所得血清样本消化产物经离子色谱仪检测的结果(mmol/L,n＝10)
a国际参考实验室室间质量评价活动(IFCC-RELA):Na±1.25％；K±2.00％；Mg±3.75％；Ca±2.50％；
b决定性方法(ICP-MS)测定结果；
c国际各参考实验室均值。
实施例2：
准确称取1.0mL的RELA样本(国际参考实验室室间质量评价(IFCC-RELA)样本，血清冻干粉复溶物)于50mL锥形瓶中，加入3.0mL的HNO3(浓度70％、纯度99.999％)，混匀，封口膜封口静置过夜(约12h)，然后放在电热板上加热消化，加热板温度调节至120℃，进行消化约2.5h，直至近干。将近干的样本取下冷却，再将加热板的温度调至80℃。待温度稳定后，在锥形瓶中加入4mL过氧化氢后加热直至完全煮干，此时，有白色粉末析出。冷却后，用0.2％的稀硝酸溶解并转移至25mL容量瓶中，定容至刻度，备用。
实施例3：
准确称取1.0mL的脑脊液样本于50mL锥形瓶中，加入4.0mL的HNO3(浓度70％、纯度99.999％)，混匀，封口膜封口静置过夜(约12h)，然后放在电热板上加热消化，加热板温度调节至120℃，进行消化约3h，直至近干。将近干的样本取下冷却，再将加热板的温度调至80℃。待温度稳定后，在锥形瓶中加入4mL过氧化氢后加热直至完全煮干，此时，有白色粉末析出。冷却后，用0.2％的稀硝酸溶解并转移至25mL容量瓶中，定容至刻度，备用。
实施例4：
准确称取1.0mL的血浆样本于50mL锥形瓶中，加入3.0mL的HNO3(浓度70％、纯度99.999％)，混匀，封口膜封口静置过夜(约12h)，然后放在电热板上加热消化，加热板温度调节至110℃，进行消化约4h，直至近干。将近干的样本取下冷却，再将加热板的温度调至80℃。待温度稳定后，在锥形瓶中加入4mL过氧化氢后加热直至完全煮干，此时，有白色粉末析出。冷却后，用0.2％的稀硝酸溶解并转移至25mL容量瓶中，定容至刻度，备用。
实施例5：
准确称取1.0mL的血浆样本于50mL锥形瓶中，加入3.0mL的HNO3(浓度70％、纯度99.999％)，混匀，封口膜封口静置过夜(约12h)，然后放在电热板上加热消化，加热板温度调节至130℃，进行消化约2h，直至近干。将近干的样本取下冷却，再将加热板的温度调至80℃。待温度稳定后，在锥形瓶中加入4mL过氧化氢后加热直至完全煮干，此时，有白色粉末析出。冷却后，用0.2％的稀硝酸溶解并转移至25mL容量瓶中，定容至刻度，备用。
实施例6：
准确称取1.0mL的血清样本于50mL锥形瓶中，加入3.0mL的HNO3(浓度70％、纯度99.999％)，混匀，封口膜封口静置过夜(约12h)，然后放在电热板上加热消化，加热板温度调节至140℃，进行消化约1h，直至近干。将近干的样本取下冷却，再将加热板的温度调至80℃。待温度稳定后，在锥形瓶中加入4mL过氧化氢后加热直至完全煮干，此时，有白色粉末析出。冷却后，用0.2％的稀硝酸溶解并转移至25mL容量瓶中，定容至刻度，备用。
实施例7：
准确称取1.0mL的血清样本于50mL锥形瓶中，加入2.0mL的HNO3(浓度70％、纯度99.999％)，混匀，封口膜封口静置过夜(约12h)，然后放在电热板上加热消化，加热板温度调节至120℃，进行消化约2h，直至近干。将近干的样本取下冷却，再将加热板的温度调至60℃。待温度稳定后，在锥形瓶中加入4mL过氧化氢后加热直至完全煮干，此时，有白色粉末析出。冷却后，用0.2％的稀硝酸溶解并转移至25mL容量瓶中，定容至刻度，备用。
实施例8：
准确称取1.0mL的血清样本于50mL锥形瓶中，加入3.0mL的HNO3(浓度70％、纯度99.999％)，混匀，封口膜封口静置过夜(约12h)，然后放在电热板上加热消化，加热板温度调节至120℃，进行消化约2.5h，直至近干。将近干的样本取下冷却，再将加热板的温度调至100℃。待温度稳定后，在锥形瓶中加入4mL过氧化氢后加热直至完全煮干，此时，有白色粉末析出。冷却后，用0.2％的稀硝酸溶解并转移至25mL容量瓶中，定容至刻度，备用。
对实施例2-8得到的前处理后体液样本分别进行紫外可见扫描光检测和离子色谱仪检测检测，其结果与实施例1类似，故其图谱便不一一在本申请列出。
本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合医学检验技术领域的市售产品。
以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
Claims (5)
1.一种用于准确测定体液阳离子的样本前处理方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)称取一定量的体液，加入(1-5)倍体液体积的浓硝酸，混合8-16h后在加热板上加热消化，加热板温度控制在100-150℃，加热1-4h，得到黄色固体物质；
(2)将加热板温度降至60-100℃，加入(2-5)倍体液体积的过氧化氢，继续消化，直至全部变成白色的无机盐粉末；
(3)采用浓度为0.2-2％的稀硝酸进行复溶，稀硝酸的加入量为(25-500)mL/g体液。
2.根据权利要求1所述的一种用于准确测定体液阳离子的样本前处理方法，其特征在于：所述步骤(1)中体液为血清、血浆、脑脊液及其制品中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种用于准确测定体液阳离子的样本前处理方法，其特征在于：所述步骤(1)中浓硝酸的浓度为70％、纯度为99.999％。
4.根据权利要求1所述的一种用于准确测定体液阳离子的样本前处理方法，其特征在于：所述步骤(1)中加热板温度控制在110-140℃。
5.根据权利要求1所述的一种用于准确测定体液阳离子的样本前处理方法，其特征在于：所述步骤(2)中加热板温度控制在70-80℃。
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