CN104693303A - 一种蛋白制品中的核酸去除方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白制品的核酸去除方法，它是采用膜层析方法去除核酸，具体步骤如下：a、用平衡液平衡膜层析柱；b、取待处理样品，调节pH以及电导率与平衡液一致；c、上样，收集280nm紫外吸收峰处的流出液；d、用平衡液冲洗，收集280nm紫外吸收峰处的流出液；e、合并步骤c和步骤d的流出液，即可。本发明方法可以有效去除核酸，蛋白回收率高，处理方法简单，工艺稳定性好，采用本发明方法处理后的蛋白制品的核酸含量小于0.1pg/mg蛋白，安全性好，临床应用前景良好。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白制品中的核酸去除方法。
背景技术
采用基因工程技术生产的蛋白药品需要严格控制残留的宿主核酸类物质(DNA)含量，特别是抗体类蛋白药物临床应用剂量大，因此核酸类物质含量需要控制在很低的限度内。
目前通用子交换层析法可以去除大量的核酸类物质，但处理后成品的核酸残留量往往大于1pg/mg蛋白，有时甚至高达数十皮克/毫克蛋白，难以满足抗体类药物的需要。
需要提供一种新的核酸去除方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的核酸去除方法以及该方法制备得到的蛋白制品。
本发明蛋白制品的核酸去除方法，它是采用膜层析方法去除核酸，具体步骤如下：
a、用平衡液平衡膜层析柱；
b、取待处理样品，调节pH以及电导率与平衡液一致；
c、上样，收集280nm紫外吸收峰处的流出液；
d、用平衡液冲洗，收集280nm紫外吸收峰处的流出液；
e、合并步骤c和步骤d的流出液，即可。
步骤a中，所述膜层析柱的填料为Mustang Q膜层析填料。
步骤b中，调节pH以及电导率的方法是：采用超滤的方法，将待处理样品的缓冲体系交换为平衡液。
步骤a和步骤d中，所述平衡液是含有NaCl的柠檬酸盐缓冲液，其pH为6～8，电导率为7.8～25.5mS/cm，NaCl浓度为50～150mmol/L，柠檬酸盐浓度5～30mmol/L。优选地，所述柠檬酸盐是柠檬酸钠。
本发明还提供了前述任意一项方法制备得到的蛋白制品。优选地，所述蛋白制品的核酸含量低于0.1pg/mg蛋白。优选地，所述蛋白制品是单克隆抗体。
本发明方法可以有效去除核酸，蛋白回收率高，处理方法简单，工艺稳定性好，采用本发明方法处理后的蛋白制品的核酸含量小于0.1pg/mg蛋白，安全性好，临床应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1本发明核酸去除方法
1、试验材料
抗体蛋白样品的获得：
步骤1、一种可表达抗CD20单克隆抗体的CHO细胞的制备：
制备表达抗CD20单克隆抗体的CHO细胞：采用PCR技术和DNA重组技术将pSV2-dhfr载体(ATCC产品)中的dhfr(二氢叶酸还原酶)表达单元克隆到pCDNA3.1(+)载体(Invitrogen公司产品)中，构建可表达DHFR的哺乳动物细胞表达载体pBF01。
根据文献报道(US Patent,US6399061)，采用化学合成技术合成重组抗CD20单克隆抗体的轻链和重链基因片段；采用DNA重组技术将合成的基因片段分别克隆到pBF01载体中，分别构建可表达抗CD20单克隆抗体的轻链和重链多肽的重组表达载体pBF01-CD20L和pBF01-CD20H。
采用脂质体转染法，将构建的重组表达载体pBF01-CD20L和pBF01-CD20H共转染Invitrogen公司的CHO-DG44细胞，然后经G418抗性筛选阳性克隆，然后再通过ELISA法筛选高表达抗体的克隆，然后再用MTX(甲氨蝶呤)逐步加压、筛选、克隆，最终获得一株高表达抗CD20单克隆抗体的CHO细胞株CHO-CD20。
步骤2、细胞培养
采用批次流加培养，得到细胞培养液。
步骤3、细胞培养上清的分离
采用深层过滤的方法获得细胞培养上清：采用Millipore公司的D0HC和B1HC深层滤器按顺序过滤步骤2中的细胞培养液，收集滤过液。
步骤4、Protein A亲和层析
层析填料：采用GE公司的MabselectSuRe层析填料(一种耐碱的ProteinA填料)。
层析流速：50～300cm/h。
填料清洗：用清洗液0.1mol/L NaOH+1.0mol/L NaCl清洗层析柱。
平衡：用平衡液20mmol/L PB(磷酸缓冲液)+50mmol/L NaCl、pH7.2平衡层析柱。
20mmol/L PB：是指缓冲液中，磷酸根的浓度为20mmol/L。
上样：步骤3收集的细胞培养上清调节pH7.2后上样；上完样后用平衡液冲洗层析柱直至流出液280nm紫外吸收回到基线。
中间冲洗：采用缓冲液20mmol/L PB、1mol/L NaCl、pH7.2冲洗层析柱，直至流出液280nm紫外吸收回到基线。然后用平衡液冲洗层析柱1.5CV(柱床体积)以上。
洗脱和收集：采用洗脱液20mmol/L柠檬酸钠+50mmol/L NaCl、pH3.5进行抗体蛋白洗脱，收集280nm紫外吸收峰；抗体蛋白收集后用TRIS调节pH至7.2。
2、本发明核酸去除方法
(1)膜层析去除核酸类物质
膜层析填料：采用Pall公司的Mustang Q膜层析填料
层析流速：10CV/min(注：CV为膜层析填料体积)
填料清洗：用清洗液0.5mol/L NaOH+0.5mol/L NaCl清洗膜层析填料。
填料再生：用再生液25mmol/L柠檬酸钠+0.5mol/L NaCl、pH6.5冲洗层析柱，至流出液pH为中性(pH6～9)
平衡：用平衡液25mmol/L柠檬酸钠+50mmol/L NaCl、pH6.5平衡层析柱。
上样：采用超滤的方法，将抗CD20的抗体蛋白样品缓冲体系交换为25mmol/L柠檬酸钠+50mmol/L NaCl、pH6.5，然后上样(平衡液的电导率是8.8mS/cm)；上完样后用平衡液冲洗膜层析柱直至流出液280nm紫外吸收回到基线。
样品收集：上样和冲洗过程中收集流出液的280nm紫外吸收峰。
3、检测分析
采用荧光定量PCR法进行检测。
(1)按照PrepSEQ TM残留DNA样品制备试剂盒(invitrogen,LifeTechnologies公司)的说明书定量回收样品中残留的DNA；
(2)根据resDNASEQ TM定量CHO DNA试剂盒(invitrogen,LifeTechnologies公司)说明书，用荧光定量PCR仪(7500Real Time PCR,ABApplied Biosystem公司)对DNA含量进行检测。其中PCR的反应条件是：第一阶段：酶激活95℃，10min；第二阶段：变性95℃，15s；退火/延伸60℃，1min，共40个循环。
4、实验结果
采用本发明方法处理前，样品中DNA含量为2.5pg/mg蛋白；采用本发明方法处理后，样品中DNA含量小于0.1pg/mg蛋白。
实验结果说明，本发明方法可以有效去除样品中的核酸。
实施例2本发明核酸去除方法
1、试验材料
同实施例1。
2、本发明核酸去除方法
除了平衡液分别变更为下表1中的平衡液，其余条件同实施例1。
表1平衡液的改变
3、检测分析
同实施例1。
4、实验结果
表2检测结果
| 编号 | 原核酸类物质含量 | 纯化后核酸类物质含量 | 本发明方法处理后样品的抗体收率或纯度 |
| 1 | 8.5pg/mg蛋白 | 小于0.1pg/mg蛋白 | 蛋白纯度97％，收率98％ |
| 2 | 2.7pg/mg蛋白 | 小于0.1pg/mg蛋白 | 蛋白纯度96％，收率99％ |
| 3 | 3.9pg/mg蛋白 | 小于0.1pg/mg蛋白 | 蛋白纯度96％，收率100％ |
由表2可以看出，采用本发明方法处理前，样品中核酸含量在2.7～8.5pg/mg蛋白不等；但采用本发明方法处理后，样品中核酸含量均小于0.1pg/mg蛋白，蛋白收率为98～100％，回收率高。
实验结果说明，本发明方法中，平衡液的pH为6～8，NaCl浓度为50～150mmol/L，柠檬酸钠浓度5～30mmol/L,电导率7.8～25.5mS/cm时，均可有效去除核酸。
对比例1
1、试验材料
同实施例1。
2、核酸去除方法
除了改变平衡液的组成外，其余条件同实施例1。
平衡液的pH为7.5，柠檬酸钠浓度为10mmol/L、NaCl浓度为200mmol/L。
3、检测分析
同实施例1。
4、实验结果
处理后，样品中DNA含量为0.7pg/mg蛋白。
对比例2
1、试验材料
同实施例1。
2、核酸去除方法
除了改变平衡液的组成外，其余条件同实施例1。
平衡液的pH为7.0，柠檬酸钠浓度为20mmol/L、NaCl浓度为30mmol/L。
3、检测分析
同实施例1。
4、实验结果
处理后，样品中DNA含量为0.4pg/mg蛋白。
实验结果说明，只有在本发明特定条件下，通过特定工艺参数的配合，才可以有效去除核酸，改变其中一个步骤，如，改变平衡液的组成则无法达到目的。
综上，本发明方法可以有效去除核酸，蛋白回收率高，处理方法简单，工艺稳定性好，采用本发明方法处理后的蛋白制品的核酸含量小于0.1pg/mg蛋白，安全性好，临床应用前景良好。
Claims (8)
1.一种蛋白制品的核酸去除方法，其特征在于：它是采用膜层析方法去除核酸，具体步骤如下：
a、用平衡液平衡膜层析柱；
b、取待处理样品，调节pH以及电导率与平衡液一致；
c、上样，收集280nm紫外吸收峰处的流出液；
d、用平衡液冲洗，收集280nm紫外吸收峰处的流出液；
e、合并步骤c和步骤d的流出液，即可。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中，所述膜层析柱的填料为Mustang Q膜层析填料。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b中，调节pH以及电导率的方法是：采用超滤的方法，将待处理样品的缓冲体系交换为平衡液。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：步骤a、b或d中，所述平衡液是含有NaCl的柠檬酸盐缓冲液，其pH为6～8，电导率为7.8～25.5mS/cm，NaCl浓度为50～150mmol/L，柠檬酸盐浓度5～30mmol/L。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述柠檬酸盐是柠檬酸钠。
6.权利要求1～5任意一项方法制备得到的蛋白制品。
7.根据权利要求6所述的蛋白制品，其特征在于：所述蛋白制品的核酸含量低于0.1pg/mg蛋白。
8.根据权利要求6或7所述的蛋白制品，其特征在于：所述蛋白制品是单克隆抗体。
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|---|---|---|---|---|
| CN114317486A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-12 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | 一种末端脱氧核糖核苷酸转移酶TdT的纯化方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101265288A (zh) * | 2007-03-13 | 2008-09-17 | 齐鲁制药有限公司 | Crm197突变体的纯化方法 |
| CN101437839A (zh) * | 2006-03-20 | 2009-05-20 | 米德列斯公司 | 蛋白质纯化 |
| CN102395597A (zh) * | 2009-03-11 | 2012-03-28 | 惠氏有限责任公司 | 纯化小模块免疫药物蛋白的方法 |
| CN104125963A (zh) * | 2011-12-22 | 2014-10-29 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 使用离子交换膜层析改进下游蛋白质纯化步骤的方法 |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101437839A (zh) * | 2006-03-20 | 2009-05-20 | 米德列斯公司 | 蛋白质纯化 |
| CN101265288A (zh) * | 2007-03-13 | 2008-09-17 | 齐鲁制药有限公司 | Crm197突变体的纯化方法 |
| CN102395597A (zh) * | 2009-03-11 | 2012-03-28 | 惠氏有限责任公司 | 纯化小模块免疫药物蛋白的方法 |
| CN104125963A (zh) * | 2011-12-22 | 2014-10-29 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 使用离子交换膜层析改进下游蛋白质纯化步骤的方法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114317486A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-12 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | 一种末端脱氧核糖核苷酸转移酶TdT的纯化方法 |
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