CN104692541A - 一种以多孔氧化锆为载体附着生长高效降油菌剂处理深海溢油的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种以多孔氧化锆为载体附着生长高效降油菌剂处理深海溢油的方法，采用添加造孔剂法制备多孔氧化锆载体，其特征在于：(1)圆柱状多孔氧化锆载体，直径为1.65-1.75cm，高为1.35-1.45cm，孔隙率为55-65％，体积密度为2.35-2.45g/cm³，孔径分布为微米级，载体的载菌量可达1.1×10⁸-1.2×10⁸cfu/个；(2)耐压性能好，可以承受0.4MPa以下的压力。所述的多孔氧化锆载体附着生长菌剂之后，利用1350-1400个孔径约为1cm，边长约为20cm的正方形网装载约9-10个多孔氧化锆置于带有浮标的大型拖网内并绑定于其底部，经船只运送并投放至40米深度以内的深海溢油污染海域底部沉积物中，可有效实现菌剂对沉积物中石油烃类的降解和多孔氧化锆的重复利用。

Description

一种以多孔氧化锆为载体附着生长高效降油菌剂处理深海溢油的方法

技术领域

本发明属于深海溢油生物修复技术领域，具体涉及一种以多孔氧化锆为载体附着生长高效降油菌剂处理深海溢油的方法。

背景技术

随着世界对石油及其制品需求的日益增长，在海上开采、运输、装卸以及石油使用过程中的溢油事故也日益增多，造成了严重的环境污染。海上原油泄漏等事故对我国近岸海域生态环境造成了严重影响，而在溢油事故处理中采取的投加消油剂等措施是将海洋表面的浮油转移到海洋沉积物中，这一方法并不能彻底解决海洋溢油对海洋生态系统造成的危害。

微生物降解是去除环境中石油污染物的主要途径，相对物理或化学方法它具有成本低、投资少、效率高的特点。应用微生物来催化降解石油烃类，减小或最终消除石油污染正受到世界各国的普遍重视。许多微生物能以烃类为唯一碳源生长，降解石油烃的微生物大量存在于受石油烃污染的水体和底部沉积物中。为了消除海洋底部沉积物中的石油烃类，目前普遍采用向溢油海域投放石油降解菌剂来降解溢油的生物修复技术，而其技术关键是提高海底微生物的固着率。由于生物修复菌剂本身密度低且较分散，投放的菌剂往往漂浮在海面上，难以对海底被污染的沉积物发挥降解作用。而采用微生物固定化技术，即将微生物固定在有效载体中，保持微生物的活性并可提高单位体积微生物的细胞密度，可有效地解决污染环境的生物修复问题。固定化的微生物能长期保持活性，固定化微生物载体 的微环境还有利于屏蔽土著菌、噬菌体和毒性物质对微生物的恶性竞争、吞噬和毒害，减轻海浪的剪切力对微生物的损害。载体是固定化的关键，国内外在水处理中采用的载体种类很多，主要包括有机材料载体和无机材料载体。如泥炭、填料、活性炭、焦炭末、沸石、细石英砂、蛭石等，但将这些载体应用于海洋溢油的生物修复都存在着一定的缺陷。例如泥炭、填料、活性炭、焦炭末、沸石类这些载体由于密度小、抗压强度小、机械强度低而不易沉入海底与被污染的沉积物接触，更难以承受海底压力及水流冲击力。而细石英砂载体颗粒小易被海浪冲散，蛭石类载体在体积膨胀之后虽然可以负载菌剂但是密度变小难以达到要求。即使耗费大量财力物力，受海底的特殊环境影响，向溢油海域投放的利用这些载体负载的高效石油降解菌剂易被冲散而很难进入并固着在沉积物中，导致沉积物中的微生物含量较少，削弱了微生物对沉积物中石油烃类的降解能力。因此，研究密度大、耐压强度高且能够附着微生物生长的多孔无机材料载体的制备显得非常必要。如参考文献[1]朱柱,李和平,郑泽根.固定化细胞技术中的载体材料及其在环境治理中的应用[J].重庆建筑大学学报,2000,22(5):99-100；[2]李慧,王平,肖明.硅藻土和滑石粉作为荧光假单胞菌P13菌剂的载体研究[J].中国生物防治,2009,25(3):239-244；[3]徐金兰,黄廷林,唐智新等.高效石油降解菌的筛选及石油污染土壤生物修复特性的研究[J].环境科学学报,2007,27(4):622-625。

多孔陶瓷是一种经高温烧成、在成形与烧结过程中材料体内形成大量彼此相通或闭合气孔的新型陶瓷材料。多孔陶瓷具有孔隙率较高、比表面积大、机械强度较高、化学稳定性好等特点使得多孔材料可以作为深海溢油修复菌剂的良好载 体。其中，多孔氧化锆材料具有非常优异的物理和化学性能，是多孔陶瓷研究的重点和热点。目前针对多孔氧化锆材料的制备和性能评价研究有不少的报道，但是在保证材料整体具有较高孔隙率的情况下使制得的多孔氧化锆的密度具有可控性，从而达到改善多孔氧化锆材料性能使其具有密度较大、抗压强度、抗剪切强度高、能够更好地作为附着微生物生长的载体。如参考文献[4]王莉丽,王秀峰,江红涛等.多孔氧化锆基体上涂覆羟基磷灰石涂层材料的制备和性能[J].机械工程材料，2008,32(12):5-7；[5]杨飞,杨仁堂,李军等.无机沸石载体抗菌剂的制备及其抗菌性能[J].纸和造纸,2009,28(3):28-31。

基于多孔氧化锆材料的上述优点，本发明选择其作为高效降油菌剂的载体并制备了符合菌剂载体要求的多孔氧化锆。本发明以多孔氧化锆材料作为载体附着生长高效降油菌剂，构成降油菌剂-多孔氧化锆载体一起投放至40米以下的深海溢油海域，实现了菌剂对污染沉积物中石油的有效降解，实现了有针对性、集中性、无二次污染的处理沉积物中的石油烃类，并将海洋溢油事故造成的近岸海域生态环境危害降到最小的目标。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种以多孔氧化锆为载体附着生长高效降油菌剂处理深海溢油的方法。

本发明所采用的技术方案是：根据溢油海域海底压力高，洋流冲击力较大的特殊环境，采用添加造孔剂法制备了孔隙率较高、体积密度较大且耐压强度较高的多孔氧化锆，制备的多孔氧化锆满足菌剂载体的要求。

采用添加造孔剂法制备多孔氧化锆，淀粉的添加量依据气孔率的要求而定。 制备的多孔氧化锆为圆柱状，直径为1.65-1.75cm，高为1.35-1.45cm，孔隙率为55-65%，体积密度为2.35-2.45g/cm³，孔径分布为微米级，载体的载菌量可达1.1×10⁸-1.2×10⁸cfu/个。

与现有技术相比，本发明的有益效果是可以通过制备的多孔氧化锆载体来附着生长高效降油菌剂且载体密度较大，可以投放到40米以下的深海溢油污染海域底部，提高了菌剂对污染沉积物中石油烃类的降解效率。其特性是可以承受溢油海域底部小于0.4MPa的压力而不破裂、不易被海底洋流冲击而发生迁移、无需外力即可沉入指定地点，从而实现了高效降油菌剂对海底污染沉积物中石油烃类有效、有针对性的处理目的。

附图说明

图1脱氢酶活性标准曲线

以TTC值代表脱氢酶活性的大小，吸光度值代表菌液的密度，测定不同吸光度下TTC值的大小并作图，拟合曲线的相关性很好。

图2脱氢酶活性-菌液体积关系曲线

图3单个氧化锆和装载多孔氧化锆的网袋

取对数生长期的菌液各1、2、3、4、5、6ml，根据脱氢酶活性测定方法，分别测其脱氢酶活性，绘制脱氢酶活性-菌液体积曲线，如图2所示。相关性指数0.9963，说明脱氢酶活性与菌液体积的相关性很好。

具体实施方式

1.多孔氧化锆的制备及表征

采用淀粉作为有机造孔剂制备多孔氧化锆材料，将添加造孔剂法和淀粉固结成型工艺相结合，淀粉的溶胀是该工艺的基础，淀粉不仅仅充当造孔剂，而且在该工艺中还能充当造粒剂的作用。其原理是通过在氧化锆粉末中添加造孔剂，利 用造孔剂在坯体中占据一定的空间，在烧结过程中，造孔剂挥发而在基体中形成气孔。气孔的大小和形状由造孔剂颗粒的大小和形状所决定，孔隙率通过改变造孔剂和氧化锆粉末的比例来控制。主要步骤如下：

1）将微米级粒径的氧化锆粉体分散于无水乙醇溶液中，逐步加入一定比例的淀粉，通过机械搅拌和超声分散使其形成悬浊液，超声分散40-60min；

2）产物经80℃干燥2h后，升温到100℃继续干燥12h；

3）悬浊液干燥之后产物经过造粒、干压成型制得圆柱状的坯体，圆柱状模具的底面直径为1.7cm，高1.4cm；

4)将坯体在1000℃温度下保温4小时烧结而成。

烧成后的试样制成标准试样，分别采用阿基米德法测定其体积密度、压汞仪法测定其孔径分布、SEM法测其孔径大小，以及利用相关计算方法测定多孔氧化锆高、底面直径和抗压强度。计算得到多孔氧化锆的直径为1.65-1.75cm，高为1.35-1.45cm，孔隙率为55-65%，体积密度为2.35-2.45g/cm³，孔径分布为微米级。

2.多孔氧化锆载菌步骤及载菌量的计算

微生物的脱氢酶活性反映了其降解有机物的能力，某种液体培养基中所含菌剂的脱氢酶活性值与载体负载的菌剂的脱氢酶活性值相当则可以大致估算载体的载菌量。

1)多孔氧化锆载菌步骤及载菌量的计算步骤如下：

在超净工作台中取1ml菌液加入灭菌的盛有100ml牛肉膏蛋白胨液体培养基（牛肉膏3g/L,蛋白胨10g/L,氯化钠30g/L，pH7.0-7.2,121℃灭菌 20min）的250ml锥形瓶中，同时将灭菌的多孔氧化锆投入其中，包好之后置于25℃-28℃、125-130r/min的摇床中振荡培养；在第23h-25h时（菌液的对数生长期）取出氧化锆置于50ml灭菌的离心管中。

2）测定载菌多孔氧化锆的脱氢酶活性具体操作如下：

（1）多孔氧化锆脱氢酶活性的测定(TTC法)

①依次向载有多孔氧化锆的离心管中加入4mLTris-HCl缓冲液，Na₂SO₃溶液1mL，TTC溶液1mL，使其没过氧化锆的上表面。

②摇匀后立即放入37℃恒温水浴锅内，并轻轻摇动，记下反应时间（10min-60min，依显色情况而定）。

从水浴中取出离心管，立即向管中加入一滴浓硫酸终止反应。

③向各离心管中加入5mL丙酮，充分混匀，抽提TF。

④各离心管在3000rpm下离心2min。

⑤吸取出上清液，测定486nm波长下的吸光度值（测定的吸光度值应在0.8以下，色度过浓时须稀释再比色）。

⑥以TF值表示脱氢酶活性，由下列公式计算：

TFμg/(mL·h)=A×B×C

A-标准曲线对应值，μg/mL

B-培养时间较正＝60min/培养时间min，h^-1

C-比色时的稀释倍数

通过计算得到载菌多孔氧化锆的TF值（脱氢酶活性）最高约为96-97μg/(mL·h)。

（2）多孔氧化锆载菌量的计算

根据图2曲线并结合载菌多孔氧化锆的TF最高值（脱氢酶活性）可得多孔氧化锆的载菌体积约为2ml。根据平板计数法得到菌液的密度为5.5×10⁷cfu/ml-6×10⁷cfu/ml，因此得到制备的多孔氧化锆的载菌量为1.1×10⁸cfu-1.2×10⁸cfu/个。

3.载菌多孔氧化锆的深海投放方法

步骤一、装载载菌多孔氧化锆网袋的制作

1）制备若干个孔径约为1cm，边长约为20cm的正方形网，网的孔径小于氧化锆的底面直径以防止装载的多孔氧化锆漏掉。利用该网可以装载约9-10个多孔氧化锆且可以在网内铺展开来，可以避免重叠从而有效的利用空间，提高氧化锆与沉积物的接触面积。

2）制备大型拖网，每个氧化锆的质量约为7-8g，按照100Kg的装载量计算可知大约装载13000-14000个氧化锆，铺展底面积约为2.7-3.2m²，拖网的底面积应大于3.2m²。因此制备的拖网孔径约为5cm，铺展面积约为4-5m²。

步骤二、载菌多孔氧化锆网袋的装载方法

将约9-10个载菌的多孔氧化锆置于网内，然后将网的四角聚合起来用细绳封口（图3），如此制作若干个装载有多孔氧化锆的网袋。将各个小网袋装到大拖网中，用绳子的一端封口，另一端系有浮标，便于指示投放的多孔氧化锆的位置同时可以实现氧化锆的重复再利用。

步骤三、载菌多孔氧化锆的深海投放方法

将载菌多孔氧化锆装载到1350-1400个孔径约为1cm，边长约为20cm 的正方形网袋里面置于大型拖网内，用细绳把小网袋绑在大型拖网底部，使底部氧化锆载体最大程度地铺展，放在船只上，然后将船只停泊在受溢油污染的海域，把拖网投放至40米深度以内的深海溢油污染海域，拖网会自动下沉至铺展在海底沉积物上，在绳子上系上浮标以标记位置。利用该方法可以把载菌的多孔氧化锆投放至指定的受溢油污染海域底部沉积物中，实现石油降解菌剂与海底沉积物的混合，为降解菌剂降解沉积物中的石油烃创造有利条件，同时可以实现多孔氧化锆载体的重复利用。

Claims (5)

1.一种以多孔氧化锆为载体附着生长高效降油菌剂处理深海溢油的方法，其特征是：所述载体为圆柱状，可以作为高效降油菌剂附着生长的载体，辅助其处理深海溢油。

2.按权利要求1所述的载体，其特征是：直径为1.65-1.75cm，高为1.35-1.45cm，孔隙率为55-65%，体积密度为2.35-2.45g/cm³，孔径分布为微米级。

3.按权利要求2所述的载体，其特征是：微米级的孔径分布与较高的孔隙率为降油菌剂的附着生长创造了条件；体积密度大于海水的密度，克服了其他无机载体密度小难以下沉、易被海水水流冲击无法达到指定地点的缺点，实现了菌剂对污染沉积物中石油的有效降解；具有耐压强度高，抗剪切能力强的特点，能够适应海底高压的特殊环境，克服了一般无机载体密度小、材质疏松难以承受高压的缺点。

4.按权利要求书3所述的载体，其特征是：多孔氧化锆载体的载菌量可达1.1×10⁸-1.2×10⁸cfu/个。

5.按权利要求书2、3所述的载体，其特征是：多孔氧化锆载体附着生长菌剂之后，利用1350-1400个孔径约为1cm，边长约为20cm的正方形网装载约9-10个多孔氧化锆置于带有浮标的大型拖网内并绑定于其底部，经船只运送并投放至40米深度以内的深海溢油污染海域底部沉积物中，可有效实现菌剂对沉积物中石油烃类的降解和多孔氧化锆的重复利用。