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Die
vorliegende Erfindung betrifft einen mit einer Keramik beschichteten
Träger,
ein Verfahren zu dessen Herstellung sowie Verwendungsmöglichkeiten
desselben.
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Materialoberflächen, die
mit Fluiden in Kontakt sind, leiden typischerweise unter Abnutzung, Korrosion
und Biofouling, die durch abrasive Teilchen, aggressive Medien und
Mikroorganismen, die natürlicherweise
in wässrigen
Umgebungen vorhanden sind, verursacht werden. Die synergistische
Wirkung dieser drei Faktoren ist der Hauptgrund eines Systemeffizienzverlustes,
der Notwendigkeit für
eine häufige
Wartung und schließlich
eines Systemversagens.
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Biofouling
wird durch das Wachstum von Bakterien oder anderen Mikroorganismen
auf gegenüber
Wasser exponierten Oberflächen
bewirkt. Die erhöhte
Konzentration von Nährstoffen
nahe der festen Oberflächen
schafft die Grundlage für
eine solche Oberflächenbesiedelung
und schließlich
einer Biofilmbildung. Biofilme sind komplexe heterogene Strukturen,
die aus Mikroorganismen bestehen, die in einer selbst erzeugten,
extrazellulären
Matrix eingebettet sind. Diese Matrix liefert eine schützende und
günstige
Umgebung für
das Wachstum von Mikroben. Biofilme bestehen hauptsächlich aus
Polysacchariden und Proteinen. Wesentliches Merkmal von Biofilmen
ist ihre hohe Beständigkeit
gegenüber umweltbedingten
Stressfaktoren und gegen die weitläufig verwendeten Biozide und
Antibiotika.
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Oberflächenmerkmale
beeinflussen die Biofilmbildung direkt, obwohl Mikroorganismen in
der Lage sind, sowohl glatte als auch raue Oberfläche zu besiedeln.
Eine höhere
Oberflächenrauhigkeit
erhöht typischerweise
eine anfängliche
mikrobielle Adhäsion
und eine anschließende
Oberflächenbesiedelung.
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Biofilme
sind der Hauptgrund für
ein Biofouling und eine Korrosion von Wasserrohren oder eine Verstopfung
von Leitungen. Eine Oberflächenkorrosion
kann durch die Freisetzung von bakteriellen metabolischen Produkten
direkt auf den Oberflächen
verursacht werden.
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Das
Wachstum von pathogenen Mikroorganismen, zum Beispiel in Wasserverteilungssystemen oder
in Heiz/Kühlvorrichtungen,
stellt eine Gefährdungsquelle
einer epidemischen Massenvermehrung dar. In Biofilmen vorliegende
Bakterien zeigen eine erhöhte
Resistenz gegenüber
vielen üblicherweise eingesetzten
antimikrobiellen Agentien. Eine hohe und/oder langdauernde Dosierung
von Bioziden ist häufig
erforderlich, um mit Biofilmen in Beziehung stehende Infektionen
auszurotten.
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Um
einer Biofilmbildung entgegenzuwirken, sind antimikrobielle Agentien
direkt in Materialien integriert oder auf Oberflächen abgeschieden worden. Weitläufig verwendete
antibakteri elle Agentien sind beispielsweise kationische oberflächenaktive
Mittel, Antibiotika oder Metallionen. Jedoch hat sich für diese
antimikrobiellen Substanzen gezeigt, für die vollständige Ausrottung
von Biofilmen nicht adäquat
zu sein. Eine intensive und lang dauernde Verwendung von Bioziden
induziert die Freisetzung von gefährlichen Schadstoffen in die
Umwelt, die Bildung von toxischen Nebenprodukten oder bewirkt die
Resistenz gegenüber
Bakterienstämmen.
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Lysozym
ist ein natürliches
antimikrobielles Biomolekül,
das bereits breite Anwendung findet. Es ist ein globuläres Enzym,
das in Eiweiß,
Tränenflüssigkeit
und anderen Körpersekreten
vorhanden ist und bemerkenswerte antibakterielle Eigenschaften zeigt.
Natives Lysozym ist in der Lage, die strukturelle Integrität der Zellwand
bestimmter Arten von Bakterien (Gram-positive Bakterien) zu schädigen, und
nach einer speziellen biochemischen Modifikation ist entsprechendes
Lysozym dann in der Lage, gegen Gram-negative Bakterien aktiv zu
sein, siehe Wu, Y. und M. A. Daeschel, Lytic antimicrobial activity
of hen egg white lysozyme immobilized to polystyrene beads. Journal
of Food Science, 2007, 72(9): S. M369–M374; Williams, T. J., R.
P. Schneider und M. D. P. Willcox, The effect of Protein-coated
contact lenses an the adhesion and viability of gram negative bacteria,
Current Eye Research, 2003, 27(4); Pellegrini, A., et al., Bactericidal
Activities of Lysozyme and Aprotinin against Gram-Negative and Gram-Positive
Bacteria Related to Their Basic Character, Journal of Applied Bacteriology,
1992. 72(3): S. 180–187.
Lysozym ist in der Lage, Bakterien durch eine spezifische Spaltung
der Polysaccharidzellwandkomponenten abzutöten, oder durch Induzierung
einer Zellmembranschädigung.
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Sowohl
natives als auch modifiziertes Lysozym gilt gemeinhin als nicht-toxisch
für höhere Organismen
oder für
die Umwelt und induzieren keine Resistenz in Bakterien.
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Eine
Oberflächenabnutzung,
die dadurch bewirkt wird, dass harte Teilchen auf die Oberfläche auftreffen,
ist mit einem konstanten Materialabtrag von der Oberfläche verbunden
und führt
zu einem Verlust an Systemeffizienz und schließlich einem Materialversagen.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Materialoberfläche, die
mit Fluiden in Kontakt kommt, bereitzustellen, die die Nachteile
des Standes der Technik überwindet,
insbesondere die Abnutzung, Korrosion und das Biofouling bei einem Kontakt
mit Fluiden vermeidet. Des weiteren soll ein Verfahren zur Herstellung
einer solchen Oberfläche bereitgestellt
und Verwendungsmöglichkeiten
angegeben werden.
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Die
erste Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch
einen mit einer Keramik beschichteten Träger, wobei die Keramik eine
auf den Träger
aufgetragene mikrostrukturierte Keramikschicht umfasst, die mit
einem antibakterielle Aktivität
aufweisenden Enzym funktionalisiert ist. Die verwendete Keramik
ist bevorzugt eine harte Keramik mit einer Harte von 2000 Vickers.
Ebenfalls können
oxidische oder nicht oxidische Keramiken oder Mischungen derselben eingesetzt
werden.
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Dabei
ist bevorzugt vorgesehen, dass der Träger aus Metall, Kunststoff
und/oder Keramik ist.
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Ferner
ist bevorzugt vorgesehen, dass die mikrostrukturierte Keramikschicht
aus alpha-Aluminiumoxid,
Titanoxid, Zirkoniumoxid, Siliziumcarbid und Mischungen derselben
ausgewählt
ist.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung sieht vor, dass die mikrostrukturierte Keramikschicht aus
Nanoteilchen mit einem Durchmesser von 1 bis 1.000 nm, bevorzugt
100 bis 500 nm, aufgebaut ist.
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Auch
kann vorgesehen sein, dass die mikrostrukturierte Keramikschicht
ein Muster aus Bergen und Tälern
aufweist, mit einer Höhendifferenz
zwischen Berg und Tal von 1 bis 20 μm, bevorzugt 5 bis 15 μm.
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Außerdem ist
bevorzugt, dass das Enzym kovalent an die mikrostrukturierte Keramikschicht
angebunden ist, optional mittels einer Verknüpfungsverbindung, wie einer
Siloxanverbindung.
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Noch
bevorzugter ist das Enzym ein natives, modifiziertes Lysozym und/oder
Lactoferrin.
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Erfindungsgemäß ist ebenfalls
ein Verfahren zur Herstellung des Trägers, welches die Schritte umfasst:
i) Auftragen einer mikrostrukturierten Keramikschicht auf den Träger; ii)
Sintern der Keramikschicht; iii) Funktionalisieren der Keramikschicht
mit einem antibakterielle Aktivität aufweisenden Enzym.
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Dabei
kann bevorzugt vorgesehen sein, dass das Auftragen der mikrostrukturierten
Keramikschicht mittels Aufsprühen
einer Keramiknanoteilchen enthaltenden Slurry auf den Träger erfolgt.
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Noch
bevorzugter ist vorgesehen, dass die Keramikschicht durch eine Mikrostrukturierung
durch Softlithographie erhalten wird.
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Am
bevorzugtesten sieht die Ausführungsform
vor, dass das Sintern bei einer Temperatur von 1.000 bis 2.000°C, bevorzugt
1.300 bis 2.000°C
erfolgt. Es ist selbstredend, dass solche Temperaturen bei Verwendung
von Kunststoff oder Metall als Träger nicht eingesetzt werden
können.
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Schließlich sieht
die Erfindung eine Verwendung eines erfindungsgemäßen Trägers in
bzw. als Wasserleitungssystem, Heiz/Kühlvorrichtung, Rohr, Leitung
und/oder Reaktormaterial, insbesondere in der pharmazeutischen,
medizinischen oder Lebensmittel verarbeitenden Industrie, in Krankenhäusern oder
Pflegeeinrichtungen vor.
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Die
vorliegende Erfindung offenbart einen Träger mit sehr vielseitig einsetzbarer
und effizienter Materialoberfläche
bzw. ein Verfahren zu dessen Herstellung, um Oberflächenbeschichtungen
bereitzustellen, die gleichzeitig gegen Abnutzung, bakterielle Besiedelung
und Korrosion schützen.
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Die
hier vorgestellten Oberflächenbeschichtungen
auf einem Träger
bestehen aus einer harten, vorzugsweise regelmäßig strukturierten, dünnen Keramikschicht,
die mit Enzymen funktionalisiert ist, die intrinsische antibakterielle
Eigenschaften zeigen.
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Die
gemusterte bzw. strukturierte Keramikschicht wird bspw. mit Hilfe
von Keramiknanoteilchen hergestellt, die direkt auf die zu beschichtende
Oberfläche
aufgebracht werden. Die Oberflächenschicht wird
dabei so hergestellt, dass bevorzugt ein regelmäßiges Muster mit Erhebungen
in der Größenordnung
von wenigen Mikrometern gebildet wird. Die strukturierte Keramikschicht
schützt
die darunter liegende Oberfläche
des Trägers
gegenüber
einer mechanischen Abnutzung und Korrosion, und schützt die
abgeschiedenen antibakteriellen Enzyme gegenüber einem Aktivitätsverlust.
Antibakterielle Enyzme, die an die strukturierte Keramikschicht
angebunden sind, töten
Bakterien bei Kontakt mit diesen ab und verhindern die Ausbildung
eines Biofilms und einer möglichen
Biokorrosion.
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Erfindungsgemäß wurde überraschend
festgestellt, dass die Kombination aus mikrostrukturierter Keramikschicht
und daran kovalent angebundenen Enzymen mit antibakterieller Aktivität wesentlich
ist. Die mikrostrukturierte Keramikschicht mit ihren Erhebungen
verhindert, dass angebundene Enzyme, zumindest in größerem Umfang,
von der Keramikschicht abgelöst werden.
Die mikrostrukturierte Keramik bietet somit einen Schutz für die daran
angebundenen Enzyme und bewahrt deren Aktivität.
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Bei
Verwendung des erfindungsgemäßen Trägers wurde
festgestellt, dass zum einen die Abnutzung und Korrosion des Trägers drastisch
reduziert wird, zum anderen wird eine bakterielle Besiedelung unter
Ausbildung eines Biofilms vermieden.
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Eine
Abscheidung der keramischen Nanoteilchen auf der Trägeroberfläche wird
bevorzugt unter Verwendung eines Mikrokontaktprägeverfahrens erreicht. Eine
Mikrokontaktprägung
wird eingesetzt, um direkt Keramikschichten auf entsprechenden Oberflächen unter
Verwendung von wässrigen
Suspensionen, die die Keramiknanoteilchen enthalten, herzustellen.
Dadurch können
Oberflächenbeschichtungen
mit genau definierten Merkmalen, beispielsweise Erhebungen in einer
Größenordnung
von wenigen Mikrometern, direkt auf großen Flächen, sogar auf gekrümmten Oberflächen, hergestellt
werden.
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Der
entsprechend beschichtete Träger
der vorliegenden Erfindung stellt einen praktikablen Weg dar, um
jegliche Oberflächen
gegenüber
Abnutzung, Bakterien und chemischer sowie biologischer Korrosion
zu schützen.
Ein entsprechender Träger
kann in irgendwelchen Systemen eingesetzt werden, die in feuchten
und wässrigen
Umgebungen eingesetzt werden, wo abrasive Mittel, Bakterien und
aggressive Medien gleichzeitig vorhanden sein können.
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Weitere
Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden
Beschreibung, in der Erfindung von Beispielen unter Bezugnahme auf
die Zeichnungen erläutert
wird.
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Dabei
zeigt
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1 eine
elektronenmikroskopische Aufnahme eines erfindungsgemäßen Trägers; und
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2 eine
schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Trägers mit mikrostrukturierter Keramikschicht
und daran angefügten
Enzymen;
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Beispiel 1
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Erfindungsgemäß wird in
einer Ausführungsform
der Träger
mit einer strukturierten, nur wenige Mikrometer dicken Keramikschicht,
die bevorzugt durch eine Mikrostrukturierung durch Softlitographie hergestellt
wird, beschichtet. In einer wässrigen
Suspension dispergierte Keramiknanoteilchen werden verwendet, um
direkt Mikromuster auf der Oberfläche des Trägers herzustellen. Zur Mikrostrukturierung wird
ein flexibler Silikonstempel durch Giessen eines Präpolymers
aus Polydimethylsiloxan gegen einen vorstrukturierten Siliciumwafer
hergestellt. Der Stempel wird anschließend mit einem dünnen Film
einer Suspension beschichtet, in der Keramiknanoteilchen dispergiert
worden sind. Der Stempel wird dann gegen die zu beschichtende Oberfläche gepresst.
Das Mikromuster wird dann kompaktiert und durch Sintern bei hohen
Temperaturen gehärtet.
Ein mit Aluminiumoxidnanoteilchen hergestelltes Mikromuster ist beispielhaft
in 1. gezeigt.
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In
einem zweiten Schritt wird die strukturierte Oberfläche mit
Enzym funktionalisiert, wie es schematisch in 2 gezeigt
ist. An eine mikrostrukturierte Keramik 1 wird über ein
Verknüpfungsmolekül 2 sowohl
natives Lysozym 3 als auch modifiziertes Lysozym 4 angefügt. Eine
Abscheidung von Enzym 3, 4 wird die mikrostrukturierte
Oberfläche
des Trägers gegenüber einer
bakteriellen Adhäsion
schützen.
Dabei werden die Enzyme 4, 5 kovalent an der strukturierten
Oberfläche 1,
bevorzugt unter Verwendung von Verknüpfermolekülen 2, kovalent gebunden.
Die Art der verwendeten Verknüpfungsmoleküle 2 gewährleistet
eine enge Bindung der Enzymmoleküle 4, 5 an
der Oberfläche
und beeinträchtigt
nicht deren antibakterielle Aktivität.
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Überraschend
wurde erfindungsgemäß festgestellt,
dass der bereitgestellte, mit einer mikrostrukturierten Keramik
beschichtete Träger
aus unterschiedlichstem Material sein kann, jedoch die Oberfläche desselben
gegenüber
einer mechanischen Abnutzung und einer chemischen Korrosion geschützt wird.
Ferner ist es durch die Mikrostrukturierung möglich, eine schützende keramische
Oxidschicht auf irgendeinem Träger
variabler Größe und Geometrie
herzustellen. Die an der mikrostrukturierten Keramikschicht angefügten Enzyme
schützen
die Materialoberflächen
gegenüber
einer Biofilmbildung, und diese verlieren über einen langen Zeitraum ihre spezifischen
antibakteriellen Eigenschaften nicht.
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Die
erfindungsgemäßen Träger stellen
daher eine hoch interessante Alternative bereit, um Systeme, die
beispielsweise beim Wassertransport eingesetzt werden und abrasive
Mittel, aggressive Medien und Mikroorganismen enthalten, zu verbessern.
Die Verwendung antibakterieller Enzyme auf einem entsprechenden
Träger
verhindert ein Biofouling auf den Materialoberflächen und stellt eine nachhaltige
Alternative gegenüber
herkömmlichen
synthetischen Bioziden dar.
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Beispiel 2
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Ein
erfindungsgemäßer Träger wurde
bezüglich
der bakteriellen Beständigkeit
und der Abnutzungsbeständigkeit
unter Flussbedingungen unter Verwendung von lebensfähigen Bakterien,
abrasiven Mitteln und stark sauren Lösungen getestet. Die mit Enzym
funktionalisierte Keramikbeschichtung zeigte eine bemerkenswerte
antibakterielle Aktivität.
Insbesondere hat sich die hergestellte Keramikmikrostruktur als
effizienter physikalischer und chemischer Schutz für das abgeschiedene
antibakterielle Enzym gezeigt, sogar unter abrasiven und sauren
Bedingungen, was potentiell eine lang anhaltende antimikrobielle
Aktivität
ermöglicht.
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Die
Abnutzungsbeständigkeit
des mit einer mikrostrukturierten Keramikschicht beschichteten Trägers wurde
unter Flussbedingungen unter Verwendung von Siliciumdioxidpulver,
disper giert in doppelt deionisiertem Wasser, als abrasivem Mittel
getestet. Silicateilchen (Teilchengrößenverteilung zwischen 75 und
150 μm)
wurden als Modellsandteilchen ausgewählt, eines der am häufigsten
vorkommenden Abrasivmittel in Fluidtransportsystemen. Ein erfindungsgemäß hergestellter
Träger
wurde mit einer Silica-Suspension von 10 Gew.-% an Silica bei einer
Flussgeschwindigkeit von 500 μl/Minute
für 4 Tage
gespült.
Das Mikromuster wurde durch das Abrasivmittel nicht beschädigt. Vielmehr
zeigte der erfindungsgemäße Träger eine
hohe Abnutzungsbeständigkeit
und wurde daher für
eine weitere Biofunktionalisierung und antibakterielle Tests verwendet.
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Um
die antibakterielle Effizienz des mit einem Enzym (Lysozym) funktionalisierten
Trägers
der Erfindung zu untersuchen, wurde eine bakterielle Besiedelung
und Zelllebensfähigkeit
auf den Keramikoberflächen
untersucht. Da eine Biofilmentwicklung und eine bakterielle Reaktion
gegenüber
antimikrobiellen Agentien stark von den Flussbedingungen abhängt, wurden
biofunktionalisierte Aluminiumoxidoberflächen unter kontrollierten dynamischen
Bedingungen für
ein bestimmtes Zeitintervall getestet.
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Als
ein bakterielles Modellsystem wurden Micrococcus luteus-Zellen eingesetzt.
M. luteus ist ein Gram-positives, nicht-pathogenes Bakterium der Hautflora
und wird gemeinhin in der Umwelt gefunden. M. luteus wird durch
seine runden Zellen charakterisiert, die spezifische Zellaggregate
bilden. Insbesondere ist M. luteus hoch empfindlich gegenüber Lysozym
und ein übliches
Substrat, um die Lysozymaktivität
zu bestimmen.
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Zur
Findung der Biofilmentwicklung, und zur Unterscheidung zwischen
lebensfähigen
und toten Bakterien, wurde eine Zweifarb-Fluoreszenz-Lebensfähigkeitsuntersuchung
mittels Fluoreszenzmikroskopie verwendet. Lebende Bakterienzellen
fluoreszieren dabei grün,
während
tote Bakterien oder Bakterien mit beeinträchtigten Zellmembranen rot
fluoreszieren. Fluoreszenzfärbung
und Mikroskopieanalysen wurden hier spezifisch als nicht-invasive
und nicht- zerstörende Methode
für eine
in-situ-Analyse der Biofilmstruktur und der Bildung sowie der bakteriolytischen
Lysozymaktivität
verwendet.
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Antibakterielle
Merkmale eines erfindungsgemäßen Trägers wurden
unter dynamischen Flussbedingungen getestet. Nach einer Lysozym-Funktionalisierung
wurden die Keramikoberflächen
gegenüber
lebensfähigen,
ggf. modifizierten M-luteus-Zellen (Zellkonzentration: 106 Zellen/ml) für 40 Stunden bei einer Flussgeschwindigkeit
von 100 μl/Minute
exponiert. Als Kontrolle wurde eine Biofilmentwicklung auf mikrostrukturiertem
Aluminiumoxid ohne jegliche Funktionalisierung durchgeführt.
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Eine
Fluoreszenzmikroskopieanalyse zeigte, dass auf nicht-funktionalisierten
Aluminiumoxidoberflächen
M. luteus einen Biofilm aus hauptsächlich lebenden Bakterien bildete.
Einige wenige tote Bakterien wurden detektiert. Die Bakterien bilden
Zellaggregate aus lebensfähigen
Zellen, die sich in unregelmäßigen Cluster
anordnen.
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Auf
mit Lysozym funktionalisiertem Aluminiumoxid wurde jedoch eine beträchtlich
geringere Menge an Zellaggregaten gefunden, die lediglich tote Bakterien
enthielten.
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Somit
wurde der Bakterientod klar durch auf der Keramikoberfläche absorbierte
Lysozymmolekülen
induziert, was zeigt, dass absorbierte Lysozymmoleküle ihre
antibakterielle Aktivität
bewahrten und nicht von der Aluminiumoxidoberfläche während des Tests desorbierten.
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Lysozym-funktionalisierte,
mikrostrukturierte Aluminiumoxide wurden dann unter Abrasiv-bedingungen getestet,
um zu erkennen, ob die Mikrostrukturierung die enzymatische Aktivität beeinflussen
und schützen
kann. Biofunktionalisierte Aluminiumoxidsubstrate wurden zunächst mit
einer Silikasuspension (Flussgeschwindigkeit: 500 μl/ml, Expositionszeit: 12
Stunden) gespült
und anschließend
mit einer Lösung,
die lebensfähige
M. luteus-Zellen ent hielt (Zellkonzentration: 106 Zellen/ml,
Flussgeschwindigkeit: 500 μl/Minute,
Expositionszeit: 12 Stunden).
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Auf
der Mikrostruktur entwickelte sich kein Biofilm, während Aggregate
von lebenden Bakterien auf der Oberfläche außerhalb der Mikrostruktur beobachtet
wurden. Dies zeigt, dass auf der Oberfläche um die Mikrostrukturierung
Lysozymmoleküle
desorbiert wurden und daher die Aluminiumoxidoberfläche nicht
mehr gegenüber
einer bakteriellen Adhäsion geschützt wurde.
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Schließlich wurden
die Eigenschaften des erfindungsgemäßen Trägers unter sauren Bedingungen
getestet. Dazu wurde der Träger
einer salzsauren Lösung
bei pH 2 für
2 Stunden ausgesetzt, dieser pH-Wert liegt deutlich unterhalb des
idealen pH-Werts von 7, bei dem Lysozym seine höchste enzymatische Aktivität zeigt.
Unter diesen harten pH-Bedingungen ist eine Proteindenaturierung
sehr wahrscheinlich. Mit Lysozym funktionalisierte, mit Keramik
mikrostrukturierte Träger
wurden zunächst
mit einer HCl-Lösung
(Flussgeschwindigkeit 500 μl/Minute,
Expositionszeit: 2 Stunden) gespült,
anschließend
mit PBS-Lösung
gespült
und dann mit lebensfähigen
M. luteus-Zellen (Zellkonzentration: 106 Zellen/ml,
Flussgeschwindigkeit: 500 μl/ml,
Expositionszeit: 12 Stunden) durchschwemmt. Sogar unter Bedingungen
dieser harten Vorbehandlung wurden Aggregate von toten M. luteus-Zellen
auf mit Lysozym-funktionalisierten
Trägern
gefunden. Tote Bakterien wurden auf der Oberfläche innerhalb der Mikrostruktur
gefunden. Auf der Aluminiumoxidoberfläche, die die Mikromuster umgibt,
wurden Zellaggregate gefunden, die sowohl tote als auch lebensfähige Bakterien
enthielten. Dies zeigt, dass die bakterizide Aktivität von Lysozym
ohne Mikrostrukturschutz teilweise verschlechtert wurde.
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Die
in der Beschreibung, den Ansprüchen und
den beigefügten
Zeichnungen offenbarten Merkmale können sowohl einzeln als auch
in einer beliebigen Kombination zur Verwirklichung der Erfindung
in ihren unterschiedlichen Ausführungsformen
wesentlich sein.