CN104673754A - 重组骨髓瘤细胞克隆的筛选方法及由此获得的抗体分子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及适应在无蛋白质培养基中生长的重组骨髓瘤细胞克隆的筛选方法。此过程包含重组骨髓瘤细胞系从无血清培养基到无蛋白质培养基适应的过程，这个过程是非常麻烦，同时重组骨髓瘤细胞系抗体生产率低。该过程包含适应在富含高密度葡萄糖和谷氨酰胺的无蛋白质培养基中高细胞密度生长。进一步的关键步骤是在富含葡萄糖和谷氨酰胺的无蛋白质细胞培养基中的克隆过程。分离的克隆出现意想不到的“增长函数”，抗体产能增加50%（最大IgG浓度，mg/L），比生长速率（μ）增加70%。本发明公开的细胞克隆生产人源化重组抗-CD6 T1h抗体。此外，本发明还公开了人源化重组抗-CD6 T1h抗体的属性特征。

Description

重组骨髓瘤细胞克隆的筛选方法及由此获得的抗体分子

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种在富含高浓度葡萄糖和谷氨酰胺的无蛋白质培养基中代谢适应生长的高产稳定表达细胞克隆的筛选方法，该方法用于灌流发酵过程中生产治疗性抗体。

背景技术

治疗性抗体是生物技术药物市场的主要类别（Walsh G，2014，Nature Biotechnology 2014，32: 992-1000）。不同的治疗性抗体已经获得注册批准，用于治疗癌症、自身免疫病和其他慢性疾病，一些重组抗体也正处于不同的临床发展阶段（Biologic Medicines in Development, Phrma Report 2013，www.phrma.org）。迄今为止最畅销的抗体均靶向炎症性疾病。可以预见的医疗需求将远远超过全球现有抗体的产能。

用于规模化生产工艺的细胞系生产力是关键问题。基因扩增系统和细胞培养基优化已经被评价用于增加抗体生产率。已经报道基因修饰和重组骨髓瘤细胞系的遗传适应用于生产治疗性抗体（Barnes et al.，2000，Cytotechnology 32:109-123；Barnes et al., 2007, Biotechnol Bioeng 96:337-349）。

灌流发酵工艺允许在发酵收获液中高密度细胞培养来增加抗体浓度。但是，高密度细胞培养会因代谢需求而降低抗体生产速率。经肿瘤细胞增强的有氧糖酵解与促进生物分子合成和细胞持续生长的合成代谢有关系（Vander Heiden MG et al., 2009, Science 324: 1029-1033; Levine AJ et al., 2010, Science 330: 1340-1344）。生产重组抗体的NS0细胞克隆已经成功的适应在无蛋白质培养基中生长（WO2004/038010 A1）。然而，适应无血清培养基和进一步无血清培养基中的长期发酵工艺通常伴随着细胞系生产力的损失（Barnes et al., 2003, Biotechnol Bioeng 81: 631-639；Barnes et al., 2004，Biotechnol Bioeng 85: 115-121）。而重组骨髓瘤细胞系的高密度细胞培养的代谢需求没有得到妥善解决。

适应在无蛋白质培养基中高产稳定表达的细胞克隆可以从工业化的不稳定重组骨髓瘤细胞系中重新获得（CN104152415A）。但是在实践中，一些重组骨髓瘤细胞系从无血清培养基到无蛋白质培养基的适应过程伴随着抗体生成率的降低。稳定但低表达细胞系不适合工业灌流发酵工艺。增加抗体生产率而不导致抗体分泌不稳定是任何细胞系优化过程中的一个关键步骤。

生物药品通常是复杂的糖蛋白分子。单克隆抗体是由具有N-和O-糖基化位点的4条多肽链组成。生产工艺中任何变化都可能导致抗体分子理化性质的变化。在生物制药工业上可比较性概念出现用于评价产品属性上的变化（Demonstration of comparability of human biological products, including therapeutic biotechnology-derived products, Center for Biologics Evaluation and Research (CBER), Center for Drug Evaluation and Research (CDER) April 1996; EU Guideline on Comparability of Medicinal Products containing Biotechnology-derived Proteins as Active Substances: Quality issues (CPMP December 2003); ICH Q5E: Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in their Manufacturing Process. EU: Adopted by CMPM, December 1, 2004, CPMP/ICH/5721/03, date for coming into operation: June 2005; MHLW: Adopted 26 April 2005, PFSB/ELD Notification No. 0426001; FDA: Published in the Federal Register, Vol. 70, No. 125, June 30, 2005; 37861-2）。

生产工艺上的变化当中，一个被认为关键的改变就是细胞系上的改变。然而在生产工艺开发中，也经常通过优化细胞系来提高其生产力。细胞系优化后的每一步，必须进行可比性研究来确保产品属性不变。每个单克隆抗体的分子表型是进行任何涉及生产工艺修改的可比性研究的先决条件，例如细胞系、生产规模和生产现场。

Itolizumab是一种识别淋巴细胞上CD6分化抗原的人源化抗体（Roque-Navarro et al., Hybrid Hybridomics.2003，22: 245-57）。CD6分子属于清道夫受体富含半胱氨酸（SRCR）超家族B（Martínez et al., Pharmacol Rev.2011，63: 967-1000），与T细胞活化有关，是治疗自身免疫性疾病的一个潜在靶点（Alonso-Ramirez et al., Arthritis. 2010, 2010: 130646）。Itolizumabdid不抑制可溶性ALCAM与HEK293细胞表达的CD6的结合（Alonso et al., Hybridoma (Larchmt). 2008, 27: 291-301）。但是，它分别通过抗-CD3抗体和可溶性ALCAM破坏CD3 / CD6同时靶向外周血单核细胞（PMBC）增殖的协同效应。CD6共刺激增强CD3活化的PMBC肿瘤坏死因子（TNF）超家族和干扰素(IFN)-g基因的转录，表明可促进促炎症。在CD6介导的激活途径中，Itolizumab抑制胞内蛋白质磷酸化的刺激反应，如促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、转录3（STAT3）的信号传导和活化、蛋白激酶Akt；减少IFN-γ、IL-6和TNF-α生成（Nair et al., ClinExpImmunol. 2010, 162: 116-30）。

在类风湿性关节炎患者的I期临床试验中，施用Itolizumab是安全的，并且不影响白细胞和淋巴细胞数量，结果显示Itolizumab对疾病有控制趋势(Rodriguez et al., Results Immunol. 2012, 2: 204-11)。对重度银屑病患者进行I期临床试验，观察也得到类似的结果，外周血单个核细胞增殖和IFN-g-分泌细胞以及血清中的促炎细胞因子减少（Krupashankar DS et al., 2014, J Am Acad Dermatol 71(3): 484-492）。

生产Itolizumab的重组骨髓瘤细胞T1h/3E9适应在无蛋白质培养基中生长（WO2004/038010 A1）。但是这种细胞系在细胞密度高于2x10⁶cell/ml时降低比生长速率（μ）和重组IgG产生。在本发明中，我们建立了一种新的方法来开发高产稳定表达细胞克隆用于灌流发酵生产工艺。根据这种方法，从生产单克隆抗体Itolizumab (T1h)的重组NS0骨髓瘤细胞系T1h/3E9中获得细胞克隆。随着代谢适应过程维持此治疗性抗体的属性特征。本发明公开了这种分子表型用于支持对生物制药的任何进一步可比性研究。

发明内容

本过程包括重组骨髓瘤细胞系从无血清培养基到无蛋白培养基的适应过程，此过程是不可能的或需花费很长时间，同时伴随着比生长速率（μ）和抗体产量的降低。

本发明的关键创新步骤在于在富含高浓度葡萄糖和谷氨酰胺的无蛋白质培养基中骨髓瘤细胞系高密度（5 x 10⁶ cells/ml -10 x 10⁶ cells/ml)生长的适应过程，以及在富含高浓度葡萄糖和谷氨酰胺无蛋白质培养基中的进一步细胞克隆过程，获得具有高比生长速率和高生产能力的细胞克隆。

本发明的方法包括两个阶段：

1、在富含葡萄糖和谷氨酰胺的无蛋白质培养基中静止低密度细胞培养的代谢适应过程；

2、使用灌流发酵系统，在富含葡萄糖和谷氨酰胺的无蛋白质培养基中高密度细胞培养的代谢适应过程。

阶段一：在补充葡萄糖（25 mM -30 mM）和谷氨酰胺（5 mM -10 mM）的无蛋白质培养基PFHMII（购自美国Hyclone公司）中解冻细胞系。75 cm² T瓶中接种细胞，36.5℃，5％CO ₂，80RPM恒温摇床中孵育。调节细胞浓度到（0.4-0.5）x 10⁶ cell/ml，连续传代培养。代谢适应过程持续60天，适应过程后，相同的培养基、36.5°C 、 5% CO₂条件下10 cell/wel静止培养亚克隆，筛选三个亚克隆用于进一步动力学表征确定。选择具有较高比生长速率和生产能力的亚克隆用于高密度细胞培养的适应过程。

阶段二：使用同样的细胞培养基（富含葡萄糖和谷氨酰胺），接种第一次筛选过程获得的细胞到5L生物反应器中。使用灌流外部装置增加细胞浓度在5x10⁶cells/ml以上。发酵过程持续14-21天。随着发酵的运行，细胞活力保持在80%以上。在发酵结束时冷冻细胞并储存在液氮中（最终生产细胞库，EPCB）。下一步为发酵结束时从细胞中筛选高产稳定表达细胞克隆。适应过程后使用相同的细胞培养基（富含葡萄糖和谷氨酰胺），高密度细胞培养细胞克隆，每孔一个细胞。

从EPCB解冻的细胞在补充葡萄糖（25 mM -30 mM） 和谷氨酰胺（5 mM -10 mM）的无蛋白质PFHMII培养基中通过有限稀释法（Freshney R., 2010, Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications, 6th ed. Hoboken, N.J.: Wiley-Blackwell pp. 208–211）进行细胞克隆。很少的克隆能够在这种培养基中生长，用流式细胞仪（FACS）进行表征确定。使用抗-人IgG单抗偶联FITC进行细胞内免疫球蛋白染色，FACS检测（Pluschke et al., 2011, BMC Proceedings 5, Suppl 8:P97）。测定每个分离克隆的平均荧光强度（MFI）和阳性细胞百分比。

在本发明的另一实施例中，细胞克隆T1h/3E9-1E6通过动力学研究进行进一步的表征确定。

在本发明的另一实施例中，测定筛选的高产稳定表达细胞系T1h/3E9-1E6分泌的免疫球蛋白的属性特征。这些属性特征的公开从操作上定义了这种治疗性抗体T1h的分子表型：

以下实施例用于说明本发明，但是不以任何方式限制其范围。此处不提供技术方法的详细说明。

附图说明

图1：适应在补充葡萄糖和谷氨酰胺的无蛋白质培养基中低密度细胞培养的生长。

图2：从补充葡萄糖和谷氨酰胺的PFHM-II培养基中获得的T1h/4-7亚克隆在5L生物反应器中的发酵运行。

图3：用抗-人IgG抗体偶联FITC进行细胞内免疫球蛋白染色FACS检测。高密度细胞培养下代谢适应后显示了三个不同克隆的MFI值。生产hR3抗体的重组骨髓瘤细胞系用作阳性对照。选择亚克隆T1h/1F6做进一步的动力学研究。

图4：细胞内免疫球蛋白染色对比。第一图：阴性对照。第二图：亲本细胞系T1h/3E9.第三图：低密度细胞代谢适应培养的亚克隆T1h/4-7。第四图：高密度细胞代谢适应培养的亚克隆T1h/3E9-1F6。

图5：筛选的克隆T1h/3E9-1F6的动力学研究。

图6：T1h轻链在天然状态（上图）和去糖基化（下图，使用PNGase F）状态的解卷积质谱，样品是被还原/烷基化的。常规LC-MS条件，C8柱进行样品分离/脱盐，乙腈/甲酸洗脱缓冲系统运行。

图7：T1h重链在天然状态（上图）和去糖基化（下图，使用PNGase F）状态的解卷积质谱，样品是被还原/烷基化的。常规LC-MS条件，C8柱进行样品分离/脱盐，乙腈/甲酸洗脱缓冲系统运行。

图8：T1h整个分子在天然状态（上图）和去糖基化（下图，使用PNGase F）状态的解卷积质谱，样品是被还原/烷基化的。常规LC-MS条件，C8柱进行样品分离/脱盐，乙腈/甲酸洗脱缓冲系统运行。

图9：胰蛋白酶消化后，用C4柱和常规乙腈/ TFA缓冲系统反相HPLC分离后获得的T1h的肽图。

图10：25℃，使用10mm路径长度比色皿， T1h在远紫外线（205-260nm）区得到的圆二色谱分析图。样品浓度为0.2mg/ mL。

图11：使用Varioskan Flash设备，280nm处刺激T1h分子后，在315和390nm中间读取色氨酸的荧光发射光谱。使用96孔板，每孔200uL，样品浓度为0.2mg/ mL。

图12：从T1h（两个不同的样品）分离的2-AB标记多糖的糖基化性能分析，用正相HPLC荧光检测分离(Ex: 330nm / Em:420nm)。

图13：T1h不同样品（N=9）的糖基化参数，用于研究糖基化性能分析的偏差范围。

图14：用Propac-WCX10柱，在280nm处获得的T1h的弱阳离子交换图。注射30 ug样品。

图15：使用TSK-G3000sxl柱，在280nm处获得的T1h的SEC-HPLC图。

图16：使用L1210靶细胞，流式细胞仪剂量-反应曲线（阳性%对T1h浓度（ug/mL）的log值）。

具体实施例

实施例1：在补充葡萄糖和谷氨酰胺的无蛋白质培养基中低密度细胞培养的代谢适应过程

在补充25 mM葡萄糖和6 mM谷氨酰胺的无蛋白质培养基PFHMII中培养细胞系T1h/3E9（与WO2004/038010 A1实施例2制备重组细胞系T1hT相同方法获得）。解冻细胞（80%活力），75 cm² T瓶中接种细胞，36.5℃，5％CO ₂，80RPM恒温摇床中孵育。调节细胞浓度到（0.4-0.5）x 10⁶ cell/ml，连续传代培养。代谢适应过程持续60天以上。细胞活力范围为80%-90%，传代培养后得到的细胞密度值高达1.5x10⁶cell/ml（见图1）。适应过程后，相同的培养基、36.5°C 、 5% CO₂条件下10 cell/wel静止培养亚克隆。筛选三个亚克隆用于进一步动力学表征确定。选择具有较高比生长速率和生产能力的亚克隆T1h/4-7用于高密度细胞培养的适应过程（表1）。

表1：代谢适应后低密度细胞培养的亚克隆动力学研究

实施例2：，在补充葡萄糖和谷氨酰胺的无蛋白质培养基中高密度细胞培养的代谢适应过程

接种第一次筛选过程获得的细胞T1h/4-7到5L生物反应器中，使用同样的细胞培养基（25 mM葡萄糖和6 mM谷氨酰胺）。中空纤维筒作为灌流外部装置。稀释速率为（0.3-0.5）VVD。发酵过程持续14-21天。随着发酵的运行，细胞活力保持在80%以上，细胞浓度在5x10⁶cell/ml以上（见图2）。在发酵结束时冷冻细胞并储存在液氮中（最终生产细胞库，EPCB）

从EPCB解冻的细胞在补充25 mM葡萄糖和6 mM谷氨酰胺的无蛋白质培养基中通过有限稀释法进行细胞克隆。获得3%的克隆效率。分离3个克隆，用流式细胞仪（FACS）进行表征确定。使用抗-人IgG单抗偶联FITC进行细胞内免疫球蛋白染色。测定每个分离克隆的平均荧光强度（MFI）和阳性细胞百分比。筛选具有较高MFI的克隆T1h/3E9-1F6用于进一步表征确定（见图3）。

实施例3：筛选的生产重组抗体T1h的细胞系T1h/3E9-1E6的表型特征

细胞内IgG含量随着表型适应和克隆过程而变化。亲本细胞T1h/3E9在PFHMII中生长，显示MFI值为107.21，89.5%的抗体分泌细胞。第一步适应过程后，亚克隆T1h/4-7的MFI值增长到422.27，97.8%的抗体分泌细胞。最终，在第二步适应过程后，筛选的克隆T1h/3E9-1F6具有更大的增长，MFI值为591.71，98.8%的抗体分泌细胞，显示出的一个更窄的单峰表明更均匀的细胞群体（图4）。令人惊奇的是，克隆T1h/3E9-1F6显示在MFI值上与亲本细胞T1h/3E9相比增加5.5倍。

在滚瓶中通过批次细胞培养来评价克隆T1h/3E9-1F6的抗体生产能力。96小时后，获得最大细胞浓度（约3x10⁶cell/ml），细胞活力为80%-90%。6天后培养细胞活力降到接近60%，活细胞浓度约为1x10⁶cell/ml，抗体浓度约为50μg/ml（见图5）。动力学参数的比较表明，静止低密度细胞培养下，克隆T1h/3E9-1F6的比生长速率（μ) 70%增加，抗体生产能力增加50%（表2）。

表2：亲本细胞系T1h/3E9与筛选的高产稳定表达细胞系T1h/3E9-1F6的动力学研究比较

实施例4：筛选的高产稳定表达细胞系T1h/3E9-1E6分泌的免疫球蛋白的属性特征

以覆盖基本分子属性定义几个特征属性，来评估分子质量，监测产品一致性以及细胞系的稳定性。通过测定整个分子及其单链质量、通过LC-ESI-MS分析亲本和二硫键还原/烷基化的样品，用质谱来研究蛋白质的一级结构。表3显示了简要结果，图6、7、8显示了获得的光谱。

表3：完整分子的质量，及其有糖基化和无糖基化的链的质量

a：考虑整个分子没有糖基化（考虑到因糖基化反应而使N变为D），在位点1的焦谷氨酸不变，两条重链不包含最后的K残基，所有的C形成二硫键；

b：所有的C利用碘乙酸烷基化；

c：考虑到整个重链在位点1焦谷氨酸没有发生改变，且包含最后的K残基。同时也考虑到因糖基化反应而使N变为D，所有的C通过使用碘乙酸烷基化；

d：考虑到整个轻链，考虑到通过使用碘乙酸所有C烷基化。

此外，通过肽图研究该分子的一级结构，以进一步排除任何因翻译后修饰截断或序列改变的可能（图9）。

在高级结构的情况下，使用两种不同的技术进行检测。其中之一是远紫外CD谱，用于分析二级结构（图10），另外一个是固有荧光特性，用于检测构象的不同和蛋白质稳定性（Weichel et al, 2008, BioProcess International, June）。图11显示了荧光分析的结果：在326nm处获得最大发射波长，在330nm/350nm处吸光度比值为1.62。

糖基化，发生在人IgG1抗体分子上的主要翻译后修饰，是通过正相HPLC谱图来研究的。图12显示了有代表性的色谱曲线，表4显示了不同产品样本的糖基化参数（Montesino et al, 2012, Biologicals 40:288-298）。这些糖基化参数的特性和分散见图13.

表4：T1h不同样品（N=9）的糖基化参数，用于研究糖基化性能分析的偏差范围

样品	G0F%	G1F%	G2F%	G0F/G1F	G1F ratio	Fuc%	Sial%
								1	35.5	39.5	10.8	0.9	2.8	98.6	3.9
2	23.0	42.6	13.8	0.5	3.7	94.4	7.7
								3	17.9	31.9	10.6	0.6	4.5	91.2	17.5
4	23.8	40.7	11.9	0.6	4.2	94.8	11.9
								5	20.9	38.6	14.0	0.5	4.2	94.8	15.5
6	20.7	36.6	10.9	0.6	4.1	92.3	8.6
								7	31.4	41.1	9.3	0.8	3.7	93.1	3.8
8	25.6	39.4	9.6	0.6	3.5	96.6	13.6
								9	22.5	37.0	9.4	0.6	3.6	92.5	12.1
平均值	32.3±29.1	37.8±20.1	9.8±10.4	0.9±1.6	3.3±1.7	95.8±8.5	6.9±13.3

G0F％，G1F％，G2F％：岩藻糖化无半乳糖，岩藻糖化单半乳糖，岩藻糖化二半乳糖，岩藻糖基聚糖％；

Fuc%：岩藻聚糖％；

SIAL％：唾液酸化聚糖％。

分子的异质性是由弱阳离子交换（WCX）来定义的，用于检测不同电荷的物质，允许检测产品截断、脱酰胺基作用和一些糖基化变化等。对于抗体而言，这种方法的结果主要是监测C-末端赖氨酸截断，是一种在hIgG1分子上发现的常规改变（Dionex Application Note127,http://www.dionexfrance.com/library/literature/application_notes_updates/AN127_LPN1047.pdf)）。不同样品获得的图谱见图14，表5显示了整体结果。此外，尺寸排阻色谱法（SEC）用于监测该分子的聚集状态。图15显示了不同样品获得的图谱，表6显示了其分析结果。

表5：不同T1h样品的WCX-HPLC整合结果（主峰百分比）

表6：不同T1h样品的SEC-HPLC整合结果（主峰百分比）

最后，通过流式细胞仪测定分子识别靶细胞上抗原的能力，由此来评价分子的功能。图16显示了不同样品获得的剂量 - 反应曲线的结果，计算此样品的EC₅₀为3.95±0.69ug/mL。

Claims (9)

1.一种在无蛋白质培养基从骨髓瘤细胞系中获得高产稳定表达细胞克隆的方法，该方法采用工业上生产重组抗体，其特征在于，所述的方法包括以下两个阶段：

（1）静止低密度细胞培养，在富含葡萄糖和谷氨酰胺的无蛋白质培养基中的代谢适应；

（2）高密度细胞培养，使用灌流发酵系统，在富含葡萄糖和谷氨酰胺的无蛋白质培养基中的代谢适应。

2.根据权利要求1所述的方法，所述的阶段（1）包含以下步骤：

（1）适应在补充25 mM-30 mM葡萄糖和5 mM-10 mM谷氨酰胺的PFHMII细胞培养基中低细胞密度，培养超过60天，所述低细胞密度为（1-2）×10⁶cell/ml；

（2）在相同细胞培养基中以10 cell/well进行细胞亚克隆；

（3）筛选的亚克隆进行动力学研究测定比生长速率和生产能力，所述生产能力指最大IgG浓度，单位为mg/ml。

3.根据权利要求1所述的方法，所述的阶段（2）包含以下步骤：

（1）采用灌流发酵系统，5L生物反应器中，适应在补充25 mM-30 mM葡萄糖和5 mM-10 mM谷氨酰胺的PFHMII细胞培养基中高细胞密度培养运行14-21天，所述高细胞密度为（5-10）x10⁶cell/ml；

（2）发酵结束时，细胞被冻存在液氮中，即最终生产细胞库EPCB；

（3）从EPCB中解冻细胞，在补充25 mM-30 mM葡萄糖和5 mM-10 mM谷氨酰胺的PFHMII细胞培养基中以有限稀释法进行细胞克隆；

（4）抗-人抗体作为探针，ELISA法检测分泌抗体的克隆；

（5）通过细胞内免疫球蛋白染色的流式细胞仪方法进行抗体生产细胞亚群的定量分析。

4.根据权利要求1-3所述的方法，所述的骨髓瘤细胞系是NS0细胞系。

5.根据权利要求4所述的方法，所述的重组NS0细胞系包含编码人源化重组抗CD6 T1h抗体的序列。

6.一种由权利要求1所述方法获得的骨髓瘤细胞系，所述细胞系适应生长在补充葡萄糖和谷氨酰胺的无蛋白质培养基中。

7.一种由权力要求6所述细胞系分泌的人源化重组抗CD6 T1h抗体。

8.根据权利要求7所述的细胞系分泌的人源化重组抗CD6 T1h抗体，所述细胞系是克隆T1h/3E9-1E6。

9.根据权利要求8所述的人源化重组抗CD6 T1h抗体，所述人源化重组抗CD6 T1h抗体包含如下所述的分子表型：

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