CN104673740A - 促进莱氏野村菌产孢的培养基及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种促进莱氏野村菌产孢的培养基及制备方法，以便更快速高效的获得莱氏野村菌的分生孢子。本发明的解决方案是通过添加合适的昆虫组织成分，改变营养配比，增加莱氏野村菌生长的刺激因子，使培养效率得到提高。

Description

促进莱氏野村菌产孢的培养基及制备方法

技术领域

本发明属于农业病虫害生物防治领域，具体是涉及一种促进莱氏野村菌产孢的培养基制备方法。

背景技术

害虫对植物的危害是造成农业减产的重要因素之一。据联合国粮农组织（FAO）估计，全世界谷物产量常年因害虫而损失14%左右；我国粮食损失率在10-15%之间，蔬菜损失率为15%-25%，果品为20%-30%。由此可见，虫害的发生是制约农业丰产的重要因素。为了防止或降低由于昆虫取食带来的经济损失，防止害虫对农产品的危害，农民不得不大量喷洒化学农药，农药的使用在消灭害虫的同时也带来了严重的副作用，最直接后果就是导致农产品农药残留大量超标，严重污染坏境，引起人畜中毒或病变。有鉴于此，农业专家提出了“预防为主，综合防治”的植物保护方针，主要的防治措施有5条：农业防治、物理防治、检疫防治、生物防治、化学防治。其中生物防治被认为是最有前途的防治方法，具有环保，安全，可操作性强等优点，也是除了化学防治之外最有效的方法。

莱氏野村菌Nomurea  rileyi是一种重要的昆虫病原真菌,是专门寄生在地面昆虫体内的一种真菌，尤其喜欢寄生鳞翅目夜蛾科害虫，由于其在自然界中的发生环境与人类的农业环境基本一致，因而对多种夜蛾科害虫，如斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、粘虫、棉铃虫、烟青虫具有很好的防治效果。该种病原菌全世界广泛分布，在国内多地区均有发现，种质资源丰富，是很好的生防真菌，在害虫的生物防治领域具有广阔的应用前景。

莱氏野村菌研究中常用的培养基是萨氏麦芽糖-酵母培养基(SMAY)，产孢速率及产孢量优于萨氏葡萄糖-酵母培养基（SDAY）和马铃薯葡萄糖培养基（PDA），但该培养基依然有较长的培养周期。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以促进莱氏野村菌产孢的培养基制备方法，此种培养基比SMAY培养基更适合莱氏野村菌的生长，可以有效缩短莱氏野村菌的产孢周期，以便更快速的收获分生孢子。

本发明的技术方案是，一种促进莱氏野村菌产孢的培养基，固体，每1升培养基中，各组分及含量为：麦芽糖8-12克；蛋白胨8-12克；酵母浸出物8-12克；琼脂粉10-15克；斜纹夜蛾老熟幼虫35-45克。

优选的方案中，一种促进莱氏野村菌产孢的培养基，固体，每1升培养基中，各组分及含量为：麦芽糖10克；蛋白胨10克；酵母浸出物10克；琼脂粉12克；斜纹夜蛾老熟幼虫40克。

前面所述的莱氏野村菌培养基，优选的方案是，添加40克斜纹夜蛾老熟幼虫。

前面所述莱氏野村菌培养基的制备方法，步骤如下：

（1）准确称取麦芽糖10克、蛋白胨10克、酵母浸出物10克、琼脂粉12克，混匀后置于500毫升烧杯中，然后加入200毫升蒸馏水，用磁力搅拌器搅拌10分钟，至各组分溶解均匀；

（2）称取40克冰冻致死的斜纹夜蛾幼虫（优先选择老熟幼虫），在研钵中加入50毫升蒸馏水进行研磨匀浆，至无明显的大块组织为止；

（3）把斜纹夜蛾幼虫匀浆液与步骤1所得的培养液混合，搅拌均匀后定容至1升，用500毫升玻璃试剂瓶（耐高压试剂瓶）分装，121度高压灭菌20分钟后倒平板，冷却凝固后作为莱氏野村菌固体培养基。

本发明与现有技术相比，其技术优势体现在：

1、有效缩短莱氏野村菌产孢时间，由25天缩短至5-6天。

2、显著提高莱氏野村菌产孢量。

附图说明

图1是Nomuraea rileyi在本发明培养基上的生长状况；

图2是Nomuraea rileyi在SMAY培养基上的生长状况。

具体实施方式

下面结合实施例详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。

实施例：一种促进莱氏野村菌产孢的培养基制备方法。

一、莱氏野村菌培养基由下列原料配制而成（1升培养基）：

麦芽糖      10克；

蛋白胨      10克；

酵母浸出物      10克；      

琼脂            12克；

斜纹夜蛾老熟幼虫 40克；

二、莱氏野村菌培养基的制备方法：

（1）准确称取麦芽糖10克、蛋白胨10克、酵母浸出物10克、琼脂粉12克，混匀后置于500毫升烧杯中，然后加入200毫升蒸馏水，用磁力搅拌器搅拌10分钟，至各组分溶解均匀；

（2）称取40克冰冻致死的斜纹夜蛾幼虫（优先选择老熟幼虫），在研钵中加入50毫升蒸馏水进行研磨匀浆，至无明显的大块组织为止；

（3）把斜纹夜蛾幼虫匀浆液与步骤1所得的培养液混合，搅拌均匀后定容至1升，用500毫升玻璃试剂瓶（耐高压试剂瓶）分装，121度高压灭菌20分钟后倒平板，冷却凝固后作为莱氏野村菌固体培养基。

三、莱氏野村菌在SMAY培养基及新发明培养基上的生长状况比较

在无菌操作台中分别接种莱氏野村菌（Nr 5772）分生孢子液（4.7×10⁸个/毫升）5微升，然后在光照培养箱中培养，温度28℃，光暗比12:12。

1 接种莱氏野村菌5天后：

SMAY培养基未见菌丝及菌落生长；新发明培养基出现明显的白色菌落及少量的嫩绿色分生孢子。

2 接种14天后：

由上表可以看出：培养14天后，莱氏野村菌在新发明培养基上生长良好，菌落直径增长1倍，明显好于常规培养基SMAY；25天后，SMAY培养基未见明显的孢子，新发明的培养基产孢量达到1.6×10^8个/0.25cm²，明显好于SMAY培养基。

3培养14天后效果图：图1是Nomuraea rileyi在新发明培养基上的生长状况；图2是Nomuraea rileyi在SMAY培养基上的生长状况。由图1、2可以看出莱氏野村菌在SMAY培养基上生长缓慢、菌落透明、菌丝稀少，没有绿色的分生孢子产生；莱氏野村菌在新发明培养上生长快速，菌落直径大，菌丝厚实，分生孢子绿色。

本发明的完成得益于（1）山东省自然科学基金（2）项聊城大学大学生创新创业训练计划项目资助：（1）项目名称：莱氏野村菌寄生斜纹夜蛾的致病机制及寄主的免疫反应；项目编号：ZR2014CL023；执行年限2014.12-2017.12；（2）项目名称：昆虫病原真菌莱氏野村菌对斜纹夜蛾的侵染过程及致病力研究；项目编号：201410447017；执行年限2015.01-2015.12。

Claims (4)

1.一种促进莱氏野村菌产孢的培养基，其特征是，固体，每1升培养基中，各组分及含量为：麦芽糖8-12克；蛋白胨8-12克；酵母浸出物8-12克；琼脂粉10-15克；斜纹夜蛾老熟幼虫35-45克。

2.一种促进莱氏野村菌产孢的培养基，其特征是，固体，每1升培养基中，各组分及含量为：麦芽糖10克；蛋白胨10克；酵母浸出物10克；琼脂粉12克；斜纹夜蛾老熟幼虫40克。

3.根据权利要求1-2所述的莱氏野村菌培养基，其特征是，添加了40克斜纹夜蛾老熟幼虫，培养基外观茶褐色、透明。

4.根据权利要求1-3所述莱氏野村菌培养基的制备方法，其特征是，步骤如下：

（1）准确称取麦芽糖10克、蛋白胨10克、酵母浸出物10克、琼脂粉12克，混匀后置于500毫升烧杯中，然后加入200毫升蒸馏水，用磁力搅拌器搅拌10分钟，至各组分溶解均匀；

（2）称取40克冰冻致死的斜纹夜蛾幼虫（优先选择老熟幼虫），在研钵中加入50毫升蒸馏水进行研磨匀浆，至无明显的大块组织为止；

（3）把斜纹夜蛾幼虫匀浆液与步骤1所得的培养液混合，搅拌均匀后定容至1升，用500毫升玻璃试剂瓶（耐高压试剂瓶）分装，121度高压灭菌20分钟后倒平板，冷却凝固后作为莱氏野村菌固体培养基。