CN104673678B

CN104673678B - 一种类微紫青霉菌

Info

Publication number: CN104673678B
Application number: CN201410662193.7A
Authority: CN
Inventors: 周庆新; 陈相艳; 陈蕾蕾; 王易芬; 裘纪莹; 刘孝永; 王军华
Original assignee: Institute of Agro Food Science and Technology of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Agro Food Science and Technology of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-11-14
Filing date: 2014-11-14
Publication date: 2017-11-21
Anticipated expiration: 2034-11-14
Also published as: CN104673678A

Abstract

本发明公开了一种类微紫青霉菌。其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是CGMCC NO.9730，保藏日期是2014年10月10日。该菌株在PDA培养基上具有易培养，生长快的特点，在吸附重金属离子（Hg²⁺）方面能够可达到98%，同时不会引入新的污染物。

Description

一种类微紫青霉菌

技术领域

本发明涉及微生物菌种，特别是涉及一种新的类微紫青霉菌菌株。

背景技术

目前农业环境恶化与农产品受重金属污染现象十分严重，特别是在一些经济发达地区。据不完全统计，我国的耕地受污染面积2667万hm²,其中,工业/三废污染1000万hm²，农药残留施肥污染1000万hm²。受到镉、砷、铅、铬、汞等重金属污染的耕地近2000万hm²，约占总耕地面积的1/5，其中镉污染耕地1133万hm²，涉及11个省25个地区；被汞污染312万hm²，涉及15个省21个地区。重金属在水体中不但不能被生物利用降解，且某些重金属还可在微生物作用下转化为毒性更强的重金属化合物，如甲基汞。重金属离子在进入生态系统后，对水生植物的生理过程会造成极大影响。尤其严重的是经食物链的生物放大作用，重金属逐级在较高级的生物体内富集，引起生态系统中各级生物的不良反应，甚至危害包括人体在内的各种生命体的健康与生存。因此，各国对于重金属的污染均给予了高度重视，并采取水体重金属污染源头控制和工程治理相结合的防治对策。为了满足人们对环境质量的日益严格的要求，研究的热点已集中在新兴的生物环境治理领域。不少研究表明，生物恢复技术在治理重金属污染方面具有成本低，简便，不会带来新的污染等优点，有较理想的效果，具有良好的应用前景。重金属污染的微生物处理技术，是利用微生物的作用削减、净化土壤或水中的重金属或降低重金属的毒性。一些重金属离子长期在环境中积累，使得环境中的一些微生物形成了较强的耐重金属污染的能力，这些微生物作为一类特殊的群体在环境中长期存在，它们对有毒金属形成了一定的抗性。对微生物而言，是一种解毒作用，而对环境而言是一种很好的修复作用，从而使得汞、铅、锡、砷等金属或类金属离子都能在微生物的作用下降低或失去毒性。

发明内容

本发明的目的就是针对上述存在的问题而提供一种类微紫青霉菌。

本发明的一种类微紫青霉菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，其保藏编号是：CGMCCNO.9730，菌种的拉丁文名称是Penicillium subjanthinellum，参据的微生物（株）：HG2014，保藏日期是2014年10月10日。

该菌株可在CYA, MEA, YES，PDA固体培养基上生长，其中30℃在CYA生长最快，7天菌落半径达55–60 毫米。菌落在CYA培养基呈辐射状蔓延生长，白色至灰白色，产孢量稀疏。有性阶段（子囊和菌索）缺失。分生孢子梗主要二轮生，偶有一个额外的分枝。分生孢子梗光滑，无色，长度达100-500微米，分生孢子球形或亚球形，表面光滑或微有粗糙，大小为2.5–3微米。

30℃，CYA，YES，PDA，DG18培养基上培养7天菌落生长旺盛，但产孢量稀疏。

按照CTAB法从该类微紫青霉菌Penicillium subjanthinellum HG2014菌株的纯培养物中提取基因组DNA，利用rDNA内转录间隔区（ITS）序列特定引物ITS1/ITS4，通过PCR扩增和测序分析得到ITS序列，其序列如SEQ ID NO.1所示：

TGTTTATTGTACCTTGTTGCTTCGGCAGGCCCGCCTCACGGCCGCCGGGGGGCTTTCCGCCCCCGGGCCCGCGCCTGCCGGAGACAATCTTGAACGCTGTCTGAAGAATGCAGTCTGAGCGATTAAGCAAAATTAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAATTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCTGTTCCCCCGGGAACAGGCCCGAAAGGCAGTGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCCCCATCAATCTTTTTTTCAGGT。

利用β-微管蛋白（β-tubulin）序列特定引物Bt 2a/Bt 2b,通过PCR扩增和测序得到β-tubulin序列，其序列如SEQ ID NO.2所示：

GGGGGCTGATGCACTGTCATCCCACTGCAGCAGATTATCTATTGTTGAGCACAGGACCTTTATACTGACTTGAGTCACAGGCAAAACATTGCTAGCGAGCATGGTCACGATGGCGAGGGCCAGTAAGTATCAATTTGGTTGGAATTGGGTGATATGAGAATGGCGGTCTGATATTTTTCTTAGCTTCACTGGCCAGTCCGACCTCCAGCTCGAGCGCATGAACGTCTACTTCAACCACGTAAGTGTGGAAACCGACACTCGATACCTTTCCAACACGTCTAACATAATGGATCTTCATAGGCCAGCGGTGACCGTTACGTTCCCCGTGCCGTCCTGGTCGACTTGGAGCCCGGTACCATGGACGCTGTCCGTGCCGGTCCTTTCGGCAAGCTTTTCCGTCCCGACAACTTCGTCTTCGGTCAGTCTGGTGCTGGTAACAACTGGGCCAAGGGTCATCCCTAGAGGGTAAAGTAGTCCTATTGGCCGGATGTTAACTTGTTTTCGCATTCATACTCCCCTCGCTATCACAGCCCGAATTCTCTTCATTTGTTCGGTGGAATAAGATCCGACCGTGCACTAGTATAGTGCACTTGTAATCTTTAATCTCCGAGCGTGCACATCACTCAGCACACCCCTCGCTAGGAGCGAATCTATAAATGGAGGACCATTTGTTGCAAAGGAAAGGTAGAGCAGACATGCCATAATGGTATTAAGACTATGCGCTCTGGGTGGTTTGCTCAACTTGGTCCTATGTTCTCAGGCTGAGAACATCACAGCCGATGCTCACCTTATACGCACTATCCCCTCGTGTCTATGCATCGCGTACGAGTCTCTCGTATTGATGATTTTAGACCAATGGATCCTTTTTCTAACCTCATCT

GGCCTACGCGATCTGGCACTGGAAACTGGGAATCCG。

利用钙调节蛋白（calmodulin）序列特定引物cmd5/cmd6,通过PCR扩增和测序得到calmodulin序列，其序列如SEQ ID NO.3所示：

TGTTGCGCTCACGCATCGATTGGAGACCCGTGACCGGATTTAATGCTGATGGATATGTTCTCCGGCGATAGGACAAGGATGGTGATGGTTAGTGCGACCGTCGGCGATTTTTTTTTAATTCCATGCCGACTGGAGTATTCCCAACTGAGAGGACCGAATAACTGAGACCGATCGATCTATAGGACAAATCACCACCAAGGAGTTGGGCACTGTCATGCGCTCCCTCGGCCAGAACCCCTCCGAGTCCGAGCTCCAGGACATGATTAACGAAGTCGATGCCGACAACAACGGTACCATTGACTTCCCTGGTACGATTTCCC

TCCCACTCGAATTATCCCGTACTCGCCTCCGGATATATGTTAACATGCGACACAGAGTTCCTTACCATGATGGCCCGTAAGATGAAGGACACCGACTCCGAGGAGGAGATCCGTGAGGCATTCAAGGTTTTCGACCGTGACAACAACGGTTTCATTTCCGCCGCTGAGCTGCGCCACGTTATGAGTTTCTATCAGTCGACGGACTTATTTTCGCAGCCGAGCTTGGCCAGGTTGGCCAGCACTTGGGGAGCCCGGCCCGCCCGACCACATCCAGTGATGGTTGGTCAAGGACCCTGCTCACCAAACTGGCGGAAAAAAAC

CGCGGACCAGAAGATGCTGGACGACTACATGAGGCGGAGGACGGCGCCGGAGGACTTGAGGGTGATGACGCTGTTGTCGACGACGGTGACCATCTCACCCCTCTGGGTTTCCACGCGCAGCTTCTGCAACCGGGCAGCCCCCCCTGAGACGAGATTTTTGCCCATTGGGGGGCACCCCGCCGGGCGGCGTTAAACAGAATCACCCGCGCCTTGGTCGAGTCGATGTGCCGGAGTGCGCCCTTCAACGTGTGCTCGGCCAGCTCGGCGATCTGTCGGGCATTTCAACACCGGTGGGGCCAGCCCCGAAAAGGGAAAAGGCAATATTTGGGCTC。

通过GenBank 中Blast软件将ITS序列、β-tubulin序列和calmodulin序列进行比对，结果显示没有与其同源性高于99%的菌株，因此推断该菌株为一新种。

在GenBank数据库中选取了部分与测定序列相似性较高的代表性基因序列（ITS+β-tubulin），通过ClustalW软件和PAUP软件以最大简约法和最大似然法构建系统进化树（见说明书附图图2），进行系统发育分析。从系统发育树可以看出，本发明菌株与Penicillium janthinellum和Penicillium cremeogriseum显示了比较高的同源性，其中，与Penicillium janthinellum的同源性最高，该结果也获得了很高的支持率，结果可靠。

形态学比较显示该种也与Penicillium janthinellum相似，但是，该种的分生孢子的形态特征与微紫青霉菌的形态存在明显差别,如分生孢子的形状存在差别（Penicillium subjanthinellum 球形或亚球形而Penicillium janthinellum通常卵圆形且孢子基部尖细），本发明菌株分生孢子（2.5–3微米）也比Penicillium janthinellum小（3–3.5微米）。故不能认为是同一物种。因此，结合形态特征比较以及ITS、β-微管蛋白的系统学分析结果，将该菌定为类微紫青霉Penicillium subjanthinellum。

所述类微紫青霉菌菌株可以用于吸附重金属离子（Hg²⁺）。具体的，在25℃，pH为7的PDB培养基中，120r/min摇床培处理6天，对重金属离子（Hg²⁺）的吸附率可达98%(说明书附图图3)。

本发明的有益效果为：该菌株在在CYA, MEA, YES，PDA固体培养基上具有易培养，生长快的特点，在吸附重金属离子（Hg²⁺）方面能够可达到98%，同时不会引入新的污染物。利用该菌制成相应的微生物修复制剂，通过该菌吸附重金属离子（Hg²⁺）的作用，降低土壤、水体等环境中重金属的含量，进而保护环境，极具开发应用前景。

附图说明：

图1所示为本发明菌株在CYA上的生长状况以及光学显微镜下分生孢子梗和分生孢子特征（比例尺10μm）；

图2所示为本发明菌株基因序列（ITS+β-tubulin）构建的系统发育树；

图3所示为本发明菌株在PDB液体培养基中随时间变化对重金属离子（Hg²⁺）的吸附率。

具体实施方式：

为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案。

实施例１

培养基的制备：

向融化的PDA培养基分别加入一定量的HgCl₂母液搅拌均匀，即固体培养基中的重金属含量为汞离子（200mg/L）。

将配制好的固体培养基放入高压灭菌锅内在121℃下灭菌30 min。

把灭菌后的固体培养基倒入培养皿内约l/4-l/3高度处，平放好，冷却凝固制成平板。本操作在无菌条件下进行。

实施例2

菌株纯化：

称取10g（可因土样含水量的多少酌情增减）常年被汞重金属污染的土样（山东潍坊某化工厂区周边土壤），加入盛有90 mL灭菌水的三角瓶中，将三角瓶置于摇床上110-130r/min，振荡20分钟，使土壤颗粒均匀分散于蒸馏水中，得到稀释倍数为10的土壤悬浮液；从中吸取1 mL置入装有9 mL灭菌水的试管中，为稀释倍数为10²的悬浮液。灭菌的培养基在冷却到45℃左右时，加入链霉素30 μg/mL，倒入培养皿降温凝固后，将得到的稀释倍数为1×10²的土壤悬浮液充分摇匀，吸取1 mL，向每个培养皿中滴入4-6滴，用灭菌的弯玻璃棒将其均匀涂抹后，将该培养皿倒置于21℃-25℃生化培养箱内培养，6d-14d后，体视镜下观察。挑取生长旺盛、形态典型的单个孢子到PDA培养基上培养。

菌株保存在有PDA培养基斜面的试管中，同时将纯化培养的菌种挑取适量加入到含2.0 mL无菌水的2.5 mL 冻存管中。

实施例3

按照CTAB法从本发明菌株的纯培养物中提取基因组DNA，利用rDNA内转录间隔区（ITS）序列特定引物ITS1/ITS4，通过PCR扩增和测序分析得到ITS序列，其序列如SEQ IDNO.1所示。利用β-微管蛋白（β-tubulin）序列特定引物Bt 2a/Bt 2b,通过PCR扩增和测序得到β-tubulin序列，其序列如SEQ ID NO.2所示。利用钙调节蛋白（calmodulin）序列特定引物cmd5/cmd6,通过PCR扩增和测序得到calmodulin序列，其序列如SEQ ID NO.3所示。通过GenBank 中Blast软件将ITS序列、β-tubulin序列和calmodulin序列进行比对，结果显示没有与其同源性高于99%的菌株，因此推断该菌株为了一新种。

ITS、β-微管蛋白、钙调节蛋白的引物序列如下:

ITS1: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’

ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

Bt2a: 5’-GGTAACCAAATCG GTGCTGCTTTC-3’

Bt2b: 5’-ACCCTCAGTGTAGT GACCCTTGGC-3’

Cmd5: 5’-CCGAGTACAAGGCCTTC -3’

Cmd6: 5’-CCGATAGAGGTCATAACGTGG-3’

结合该菌的各种培养特征和形态特征、ITS和β-微管蛋白序列分析，将该菌定为类微紫青霉Penicillium subjanthinellum。

实施例4

该类微紫青霉菌Penicillium subjanthinellum HG2014对重金属离子（Hg²⁺）吸附：

取保存的本发明菌株该类微紫青霉菌Penicillium subjanthinellum HG2014，转接到含重金属的PDA培养皿中，培养5-7天，无菌条件下，用5 mm打孔器打取菌饼，取5块菌饼加入到含重金属汞(20mg/L) 的PDB液体培养基 100 mL的250mL锥形瓶中，另取无菌菌饼同上方法处理作为对照，置于120 r/min, 25℃的恒温摇床中，培养6天，用带滤纸漏斗过滤，菌丝烘干称重，取过滤液消解，测重金属离子（Hg²⁺）浓度。

所述类微紫青霉菌菌株在汞浓度（20mg/L）较高的情况下不但具有耐受性，能进行快速生长，同时又具有显著的吸附能力，液体培养基中汞浓度明显降低，具体请见说明书附图图3，本发明菌株对汞的去除率最高可达98%。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院农产品研究所

<120> 一种类微紫青霉菌

<130> 无

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 454

<212> DNA

<213> Penicillium subjanthinellum

<400> 1

tgtttattgt accttgttgc ttcggcaggc ccgcctcacg gccgccgggg ggctttccgc 60

ccccgggccc gcgcctgccg gagacaatct tgaacgctgt ctgaagaatg cagtctgagc 120

gattaagcaa aattagttaa aactttcaac aacggatctc ttggttccgg catcgatgaa 180

gaacgcagcg aaatgcgata attaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgagtctt 240

tgaacgcaca ttgcgccccc tggtattccg gggggcatgc ctgtccgagc gtcattgctg 300

ccctcaagcc cggcttgtgt gttgggccct gttcccccgg gaacaggccc gaaaggcagt 360

ggcggcaccg cgtccgatcc tcgagcgtat ggggctttgt cacccgctct gtaggcccgg 420

ccggcgcttg cccccatcaa tctttttttc aggt 454

<210> 2

<211> 916

<212> DNA

<213> Penicillium subjanthinellum

<400> 2

gggggctgat gcactgtcat cccactgcag cagattatct attgttgagc acaggacctt 60

tatactgact tgagtcacag gcaaaacatt gctagcgagc atggtcacga tggcgagggc 120

cagtaagtat caatttggtt ggaattgggt gatatgagaa tggcggtctg atatttttct 180

tagcttcact ggccagtccg acctccagct cgagcgcatg aacgtctact tcaaccacgt 240

aagtgtggaa accgacactc gatacctttc caacacgtct aacataatgg atcttcatag 300

gccagcggtg accgttacgt tccccgtgcc gtcctggtcg acttggagcc cggtaccatg 360

gacgctgtcc gtgccggtcc tttcggcaag cttttccgtc ccgacaactt cgtcttcggt 420

cagtctggtg ctggtaacaa ctgggccaag ggtcatccct agagggtaaa gtagtcctat 480

tggccggatg ttaacttgtt ttcgcattca tactcccctc gctatcacag cccgaattct 540

cttcatttgt tcggtggaat aagatccgac cgtgcactag tatagtgcac ttgtaatctt 600

taatctccga gcgtgcacat cactcagcac acccctcgct aggagcgaat ctataaatgg 660

aggaccattt gttgcaaagg aaaggtagag cagacatgcc ataatggtat taagactatg 720

cgctctgggt ggtttgctca acttggtcct atgttctcag gctgagaaca tcacagccga 780

tgctcacctt atacgcacta tcccctcgtg tctatgcatc gcgtacgagt ctctcgtatt 840

gatgatttta gaccaatgga tcctttttct aacctcatct ggcctacgcg atctggcact 900

ggaaactggg aatccg 916

<210> 3

<211> 972

<212> DNA

<213> Penicillium subjanthinellum

<400> 3

tgttgcgctc acgcatcgat tggagacccg tgaccggatt taatgctgat ggatatgttc 60

tccggcgata ggacaaggat ggtgatggtt agtgcgaccg tcggcgattt ttttttaatt 120

ccatgccgac tggagtattc ccaactgaga ggaccgaata actgagaccg atcgatctat 180

aggacaaatc accaccaagg agttgggcac tgtcatgcgc tccctcggcc agaacccctc 240

cgagtccgag ctccaggaca tgattaacga agtcgatgcc gacaacaacg gtaccattga 300

cttccctggt acgatttccc tcccactcga attatcccgt actcgcctcc ggatatatgt 360

taacatgcga cacagagttc cttaccatga tggcccgtaa gatgaaggac accgactccg 420

aggaggagat ccgtgaggca ttcaaggttt tcgaccgtga caacaacggt ttcatttccg 480

ccgctgagct gcgccacgtt atgagtttct atcagtcgac ggacttattt tcgcagccga 540

gcttggccag gttggccagc acttggggag cccggcccgc ccgaccacat ccagtgatgg 600

ttggtcaagg accctgctca ccaaactggc ggaaaaaaac cgcggaccag aagatgctgg 660

acgactacat gaggcggagg acggcgccgg aggacttgag ggtgatgacg ctgttgtcga 720

cgacggtgac catctcaccc ctctgggttt ccacgcgcag cttctgcaac cgggcagccc 780

cccctgagac gagatttttg cccattgggg ggcaccccgc cgggcggcgt taaacagaat 840

cacccgcgcc ttggtcgagt cgatgtgccg gagtgcgccc ttcaacgtgt gctcggccag 900

ctcggcgatc tgtcgggcat ttcaacaccg gtggggccag ccccgaaaag ggaaaaggca 960

atatttgggc tc 972

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成

<400> 4

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 5

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成

<400> 6

ggtaaccaaa tcggtgctgc tttc 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成

<400> 7

accctcagtg tagtgaccct tggc 24

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 合成

<400> 8

ccgagtacaa ggccttc 17

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 9

ccgatagagg tcataacgtg g 21

Claims

1.一种类微紫青霉菌，其特征在于，该类微紫青霉菌Penicillium subjanthinellumHG2014，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是CGMCCNO.9730，保藏日期是2014年10月10日，所述类微紫青霉菌菌株在25℃，pH为7的PDB培养基中，120r/min摇床培处理6天，对Hg²⁺的吸附率达98%。

2. 根据权利要求1所述的一种类微紫青霉菌，其特征在于，该菌株在CYA, MEA, YES，PDA或DG18固体培养基上生长，其中30℃在CYA生长最快，7天菌落半径达55–60 毫米。

3.根据权利要求1所述的一种类微紫青霉菌，其特征在于，该菌株菌落在CYA培养基呈辐射状蔓延生长，白色至灰白色，产孢量稀疏，有性阶段子囊和菌索缺失。

4.根据权利要求1所述的一种类微紫青霉菌，其特征在于，该菌株分生孢子梗主要二轮生，偶有一个额外的分枝，分生孢子梗光滑，无色，长度达100-500微米，分生孢子球形或亚球形，表面光滑或微有粗糙，大小为2.5–3微米。

5.根据权利要求1所述的一种类微紫青霉菌，其特征在于，30℃，CYA，YES，PDA，DG18培养基上培养7天菌落生长旺盛，但产孢量稀疏。

6. 根据权利要求1所述的一种类微紫青霉菌，其特征在于，按照CTAB法从该类微紫青霉菌Penicillium subjanthinellum HG2014的纯培养物中提取基因组DNA，利用rDNA内转录间隔区（ITS）序列特定引物ITS1/ITS4，通过PCR扩增和测序分析得到ITS序列，其序列如SEQ ID NO.1所示：

7. 根据权利要求1所述的一种类微紫青霉菌，其特征在于，利用β-微管蛋白序列特定引物Bt 2a/Bt 2b,通过PCR扩增和测序得到β-tubulin序列，其序列如SEQ ID NO.2所示：

GGCCTACGCGATCTGGCACTGGAAACTGGGAATCCG。

8. 根据权利要求1所述的一种类微紫青霉菌，其特征在于，利用钙调节蛋白序列特定引物cmd5/cmd6,通过PCR扩增和测序得到calmodulin序列，其序列如SEQ ID NO.3所示：