CN104655577A - 一种测定乳酸链球菌素活力的方法 - Google Patents

一种测定乳酸链球菌素活力的方法 Download PDF

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Abstract

一种测定乳酸链球菌素活力的方法，它涉及一种测定乳酸链球菌素活力的方法。本发明的方法为：一、分别将乳酸链球菌素对照品或待测样品、藤黄微球菌悬液和质量百分含量为0.0125％刃天青染液加入到96孔板上，震荡96孔板将加入的上述物质混合均匀；二、将步骤一的96孔板在温度为25℃条件下，温浴45～60min；三、从步骤二温浴后的每孔中取上清液，转移到另一块清洁的96孔板中；四、用595纳米滤光片读取96孔板中液体的光吸收数据；五、对步骤四读取的数据进行分析后，即完成。本发明首次建立了刃天青生物比色法，可以快速、准确、高通量测定乳酸链球菌素活力。该法简单、快速、高效、准确、经济。

Description

一种测定乳酸链球菌素活力的方法
技术领域
本发明涉及一种测定乳酸链球菌素活力的方法。
背景技术
在乳酸链球菌素的研究和工业上应用过程中，准确、灵敏的检测方法至关重要。目前广泛采用的是琼脂扩散法。该法操作简单、成本较低，经过多年的改进与提高，在准确度和灵敏度方面也已经得到了很大的改善和提高；但是指示菌的选择、测定中的误差等各种影响因素对测定效果的影响是很难避免的，同时，琼脂扩散法的灵敏性和准确性有限，加上测定周期较长,长达24～48小时，为满足日生产需求量需求耗费大量人力物力。测定结果常常因人而异、需要多次重复、准确度低。因此现有琼脂扩散检测方法并不能很好地满足乳酸链球菌素研究和应用的需要。
近年来，人们对乳酸链球菌素的检测方法做了许多的创新和改进。比如四甲基偶氮唑盐比色法和96孔聚乙烯板浊度法。虽然它们耗时已缩短到5-6小时，但由于可操作性等原因，要在工业上投入使用，仍有待进一步的研究，因而无法取代现在的琼脂扩散法，广泛的作为检测乳酸链球菌素的常规方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，而提供了一种测定乳酸链球菌素活力的方法。
本发明的一种测定乳酸链球菌素活力的方法，是按照以下步骤进行的：
一、分别将乳酸链球菌素对照品或待测样品、藤黄微球菌悬液和质量百分含量为0.0125％刃天青染液加入到96孔板上，震荡96孔板将加入的上述物质混合均匀；其中，乳酸链球菌素对照品或待测样品、藤黄微球菌悬液和质量百分含量为0.0125％刃天青染液的体积比为1:(7.5～8):(1.5～2)；
二、将步骤一的96孔板在温度为25℃条件下，温浴45～60min；
三、从步骤二温浴后的每孔中取上清液，转移到另一块清洁的96孔板中；
四、用595纳米滤光片读取96孔板中液体的光吸收数据；
五、对步骤四读取的数据进行分析后，得到待测样品原活力，即完成乳酸链球菌素活力的测定。
本发明包含以下有益效果：
本发明首次建立了刃天青生物比色法，可以快速、准确、高通量测定乳酸链球菌素活 力。该法简单、快速、高效、准确、经济。可以在乳酸链球菌素生产中完全取代现行的琼脂扩散法。
本发明的方法程序简单，从准备平板到读板1小时内完成，数据输入到最终结果产生在Excel模板中自动完成。16个样品在两个不同平板上分别测试，所获结果一致性为r2＝0.9959。对12来源不同被测样品用刃天青生物比色法和琼脂扩散法分别测试，各重复6次，最终12个样品数据两种方法各取平均值。两组结果一致性为r2＝0.988。两种方法所获结果高度一致。然而，琼脂扩散法变异系数为12.47％，大大高于刃天青生物比色法变异系数5.35％。证明刃天青生物比色法结果可靠性大大高于琼脂扩散法。
另外，本发明通过预先设定MS Excel模板对待测样品的光吸收数据进行分析：根据样品板上布局，自动计算出板上各乳酸链球菌素对照品或待测样品光吸收平均值；根据乳酸链球菌素对照品光吸收平均值及其浓度自动导出回归方程；根据回归方程自动导出待测样品活力计算公式；根据待测样品光吸收平均值和活力计算公式自动求出待测样品活力；最后求出待测样品原活力。
附图说明
图1为刃天青法测试板典型回归曲线回归方程；
图2为(刃天青测试法)测试乳酸链球菌素数据；
图3为刃天青法测定乳酸链球菌素活力与琼脂扩散法测定乳酸链球菌素活力的比较结果数据。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种测定乳酸链球菌素活力的方法，它是按照以下步骤进行的：
一、分别将乳酸链球菌素对照品或待测样品、藤黄微球菌悬液和质量百分含量为0.0125％刃天青染液加入到96孔板上，震荡96孔板将加入的上述物质混合均匀；其中，乳酸链球菌素对照品或待测样品、藤黄微球菌悬液和质量百分含量为0.0125％刃天青染液的体积比为1:(7.5～8):(1.5～2)；
二、将步骤一的96孔板在温度为25℃条件下，温浴45～60min；
三、从步骤二温浴后的每孔中取上清液，转移到另一块清洁的96孔板中；
四、用595纳米滤光片读取96孔板中液体的光吸收数据；
五、对步骤四读取的数据进行分析后，得到待测样品原活力，即完成乳酸链球菌素活力的测定。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一相同的是：步骤三中所述的取上清液，转移到另一块清洁的96孔板的上清液占96孔板中每个孔体积的90％以上。其它与与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式步骤五中所述的对步骤四读取的数据进行分析，是指将步骤四读取的数据到代入到MS Excel模板中进行分析，具体操作步骤如下：
一、求出各板上乳酸链球菌素对照品或待测样品的平均值；
二、导出乳酸链球菌素对照品浓度与光吸收回归方程：Log10Activity＝K*A595+B；其中，Activity表示活力，K表示斜率，A595表示为595处的样品光吸收值，B表示截距；
三、通过步骤二的公式导出待测样品活力计算公式：Activity(A595)＝10K*A595+B，其中，Activity表示活力，K表示斜率，A595表示为595处的样品光吸收值，B表示截距；依据该公式，计算得到样品的活力值；
四、根据样品稀释倍数，将上步求出的活力值乘以稀释倍数，即得待测样品原活力。
其它与具体实施方式一相同。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
本实施例的一种测定乳酸链球菌素活力的方法，是按照以下步骤进行的：
一、分别将乳酸链球菌素对照品或待测样品、藤黄微球菌悬液和质量百分含量为0.0125％刃天青染液加入到96孔板上，震荡96孔板将加入的上述物质混合均匀；其中，乳酸链球菌素对照品或待测样品、藤黄微球菌悬液和质量百分含量为0.0125％刃天青染液的体积比为1:(7.5～8):(1.5～2)；
二、将步骤一的96孔板在温度为25℃条件下，温浴45～60min；
三、从步骤二温浴后的每孔中取上清液，转移到另一块清洁的96孔板中；
四、用595纳米滤光片读取96孔板中液体的光吸收数据；
五、对步骤四读取的数据进行分析后，得到待测样品原活力，即完成乳酸链球菌素活力的测定；
其中，步骤五中所述的对步骤四读取的数据进行分析，是指将步骤四读取的数据到代入到MS Excel模板中进行分析，具体操作步骤如下：
一、求出各板上乳酸链球菌素对照品或待测样品的平均值；
二、导出乳酸链球菌素对照品浓度与光吸收回归方程：Log10Activity＝K*A595+B；其中，Activity表示活力，K表示斜率，A595表示为595处的样品光吸收值，B表示截距；
三、通过步骤二的公式导出待测样品活力计算公式：Activity(A595)＝10K*A595+B，其中，Activity表示活力，K表示斜率，A595表示为595处的样品光吸收值，B表示截距；依据该公式，计算得到样品的活力值；
四、根据样品稀释倍数，将上步求出的活力值乘以稀释倍数，即得待测样品原活力。
由典型刃天青法测试板照片可知，在第5、6、7、8行分别是四个乳酸链球菌素对照样品(浓度分别为11.61、8.64、6.41和4.74IU mL-1)。可看出明显的颜色分化。操作人根据需要可在测试板其余部分分配待测样品重复孔。
图1为本实施例的刃天青法测试板典型回归曲线回归方程，其中，斜率(K)和截距(B)自动导出。
图2为本实施例的(刃天青测试法)测试乳酸链球菌素数据结果，其中，slope＝0.9904，r2＝0.9959，p<0.001；由图2可知，16个生产中随机抽取的乳酸链球菌素样品分别在两个测试板上测活力。所得数据作一致性分析证明高度一致。表明刃天青测试法高度稳定。
图3为本实施例的刃天青法测定乳酸链球菌素活力与琼脂扩散法测定乳酸链球菌素活力的比较结果数据，图3是对12个随机样品分别用刃天青法和琼脂扩散法测试活力；分别重复六次；各求出12个平均活力；然后进行一致性分析，最后得出两种方法所得结果高度相似。然而，刃天青法六次重复的差异度为5.35％，琼脂扩散法六次重复的差异度为12.47％，大大高于刃天青法。表明本实施例的刃天青法具有较高可靠性。

Claims (3)

1.一种测定乳酸链球菌素活力的方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：
一、分别将乳酸链球菌素对照品或待测样品、藤黄微球菌悬液和质量百分含量为0.0125％刃天青染液加入到96孔板上，震荡96孔板将加入的上述物质混合均匀；其中，乳酸链球菌素对照品或待测样品、藤黄微球菌悬液和质量百分含量为0.0125％刃天青染液的体积比为1:(7.5～8):(1.5～2)；
二、将步骤一的96孔板在温度为25℃条件下，温浴45～60min；
三、从步骤二温浴后的每孔中取上清液，转移到另一块清洁的96孔板中；
四、用595纳米滤光片读取96孔板中液体的光吸收数据；
五、对步骤四读取的数据进行分析后，得到待测样品原活力，即完成乳酸链球菌素活力的测定。
2.根据权利要求1所述的一种测定乳酸链球菌素活力的方法，其特征在于步骤三中所述的取上清液，转移到另一块清洁的96孔板的上清液占96孔板中每个孔体积的90％以上。
3.根据权利要求1所述的一种测定乳酸链球菌素活力的方法，其特征在于步骤五中所述的对步骤四读取的数据进行分析，是指将步骤四读取的数据到代入到MS Excel模板中进行分析，具体操作步骤如下：
一、求出各板上乳酸链球菌素对照品或待测样品的平均值；
二、导出乳酸链球菌素对照品浓度与光吸收回归方程：Log10Activity＝K*A595+B；其中，Activity表示活力，K表示斜率，A595表示为595处的样品光吸收值，B表示截距；
三、通过步骤二的公式导出待测样品活力计算公式：Activity(A595)＝10K*A595+B；依据该公式，计算得到样品的活力值；
四、根据样品稀释倍数，将上步求出的活力值乘以稀释倍数，即得待测样品原活力。
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