CN104628811A - 一种好氧颗粒污泥总蛋白的提取方法 - Google Patents

一种好氧颗粒污泥总蛋白的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种好氧颗粒污泥总蛋白的提取方法，包括如下步骤：(1)好氧颗粒污泥用去离子水清洗后离心；(2)将离心后的好氧颗粒污泥用液氮研磨；(3)调节研磨后好氧颗粒污泥的pH值为11-14；(4)对调节pH后的好氧颗粒污泥消解，消解温度45-55℃，消解时间9-12h；(5)对消解后的好氧颗粒污泥离心，取上清液，得到好氧颗粒污泥总蛋白。本发明优点为能较为完整稳定地提取出好氧颗粒污泥的总蛋白，SDS-PAGE跑出的条带清晰；可以消除好氧颗粒污泥中物质对蛋白提取的干扰，提取蛋白纯度高；提取的总蛋白稳定，分子量小的蛋白也不易降解；方法操作简单，具有效率高、经济、简洁的优点，适于蛋白的快速提取。

Description

一种好氧颗粒污泥总蛋白的提取方法
技术领域
本发明涉及一种蛋白的提取方法，具体涉及一种好氧颗粒污泥总蛋白的提取方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
好氧颗粒污泥一般呈球形或椭球形，颗粒表面平滑清晰，结构规则致密，具有较大的物理强度和较快的沉降速率，在沉淀或泥水混合物中可以看到单独的个体，抗有机负荷能力强，可实现同步脱氮除磷，使生化过程高效稳定进行。同时，好氧颗粒污泥包含多种好氧、兼性、厌氧微生物，组成一个完整的微生物群落。由于好氧颗粒污泥微生物种类繁多，所以探索一种好氧颗粒污泥总蛋白的提取方法有重要的理论和实践意义。
目前关于蛋白提取的方法主要有酸解法、碱解法、超声波法等，但这些方法大部分针对于活性污泥，而目前专门针对于好氧颗粒污泥蛋白的提取方法鲜有报道。活性污泥为絮状结构，其污泥微生物特征与好氧颗粒污泥有很大的不同，蛋白提取方法也存在较大的差异。目前利用碱解法提取好氧颗粒污泥总蛋白很少，碱解法提取好氧颗粒污泥总蛋白的最佳工艺条件也无从考究。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种好氧颗粒污泥总蛋白的提取方法，该方法提取的好氧颗粒污泥总蛋白纯度较高、蛋白稳定，同时小分子量蛋白不易降解。
技术方案：本发明所述好氧颗粒污泥总蛋白的提取方法，包括如下步骤：
(1)好氧颗粒污泥用去离子水清洗后离心；
(2)将离心后的好氧颗粒污泥用液氮研磨；
(3)调节研磨后好氧颗粒污泥的pH值为11-14；
(4)对调节pH后的好氧颗粒污泥进行消解，消解温度为45-55℃，消解时间控制在9-12h；
(5)对消解后的好氧颗粒污泥离心，取上清液，得到好氧颗粒污泥总蛋白。
其中，在步骤(1)中，清洗、离心后所述好氧颗粒污泥的含水率保持在80-90％，进一步优选为88-90％。
步骤(3)中，调节研磨后所述好氧颗粒污泥的pH值优选为12.3-12.5。同时，使用NaOH等调节所述好氧颗粒污泥的pH值。另外，在调节pH值前，先向好氧颗粒污泥中加入去离子水，其中，好氧颗粒污泥与去离子水的重量比为1:3.5-4。
步骤(4)中，消解温度优选为50-51℃。消解时间优选为10-11h。
步骤(5)中，所述离心转速为3500-3700r/min，时间为10-20min。
有益效果：本发明与现有技术相比，其显著优点为：利用本发明方法能较为完整稳定地提取出好氧颗粒污泥的总蛋白，SDS-PAGE跑出的条带清晰；本发明方法可以消除好氧颗粒污泥中物质对蛋白提取的干扰，提取蛋白纯度高；本发明方法提取的总蛋白稳定，分子量小的蛋白也不易降解；本发明方法操作简单，具有效率高、经济、简洁的优点，适于蛋白的快速提取。
附图说明
图1为本发明在不同工艺参数下提取好氧颗粒污泥总蛋白的SDS-PAGE图。
具体实施方式：
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
本发明是通过碱性物质使污泥中微生物细胞发生破裂，从而提取蛋白，所以此方法提取的蛋白即好氧颗粒污泥的总蛋白。而蛋白的纯度、稳定性和降解性与提取工艺的具体参数密切相关，涉及好氧颗粒污泥的含水率、固液比、pH、消解温度以及消解时间等。总蛋白的性能主要是通过SDS-PAGE图谱反应出来，和条带的多少、清晰度和亮度有关。
实施例1：利用模拟生活污水在SBR反应器中培养出的好氧颗粒污泥总蛋白的提取
提取步骤：
(1)取湿好氧颗粒污泥，用去离子水反复冲洗，例如冲洗5次，去除好氧颗粒污泥表面杂质；
(2)将清洗过的好氧颗粒污泥离心，离心转速可以控制为11000r/min，离心时间10min，保证好氧颗粒污泥含水率小于90％，同时取离心后的好氧颗粒污泥10g；
(3)加入液氮，在玛瑙研钵里反复研磨3次，保证好氧颗粒污泥接近粉末；
(4)在第(3)步的粉末中加入去离子水，去离子水的量为40mL；
(5)将第(4)步的溶液倒入高型烧杯中，在缓慢搅拌的条件下，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH至12.3；
(6)将高型烧杯放入50℃的水浴锅中恒温消解，消解时间为10h；
(7)将消解后的溶液离心，离心速度为3600r/min，离心时间为15min；
(8)取离心后上清液，此上清液中富含提取的好氧颗粒污泥的总蛋白。
实施例2：利用模拟生活污水在SBR反应器中培养出的好氧颗粒污泥总蛋白的提取
提取步骤：
(1)取湿好氧颗粒污泥，用去离子水反复冲洗5次，去除好氧颗粒污泥表面杂质；
(2)将清洗过的好氧颗粒污泥离心，离心转速11000r/min，离心时间10min，保证好氧颗粒污泥含水率小于90％，同时取离心后的好氧颗粒污泥10g；
(3)加入液氮，在玛瑙研钵里反复研磨3次，保证好氧颗粒污泥接近粉末；
(4)在第(3)步的粉末中加入去离子水，去离子水的量为40mL；
(5)将第(4)步的溶液倒入高型烧杯中，在缓慢搅拌的条件下，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH至12.3；
(6)将高型烧杯放入45℃的水浴锅中恒温消解，消解时间为10h；
(7)将消解后的溶液离心，离心速度为3600r/min，离心时间为15min；
(8)取离心后上清液，此上清液含有提取的好氧颗粒污泥的总蛋白。
实施例3：利用模拟生活污水在SBR反应器中培养出的好氧颗粒污泥总蛋白的提取
提取步骤：
(1)取湿好氧颗粒污泥，用去离子水反复冲洗5次，去除好氧颗粒污泥表面杂质；
(2)将清洗过的好氧颗粒污泥离心，离心转速11000r/min，离心时间10min，保证好氧颗粒污泥含水率小于90％，同时取离心后的好氧颗粒污泥10g；
(3)加入液氮，在玛瑙研钵里反复研磨3次，保证好氧颗粒污泥接近粉末；
(4)在第(3)步的粉末中加入去离子水，去离子水的量为40mL；
(5)将第(4)步的溶液倒入高型烧杯中，在缓慢搅拌的条件下，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH至11.0；
(6)将高型烧杯放入50℃的水浴锅中恒温消解，消解时间为10h；
(7)将消解后的溶液离心，离心速度为3600r/min，离心时间为15min；
(8)取离心后上清液，此上清液中含有提取的好氧颗粒污泥的总蛋白。
实施例4：利用模拟生活污水在SBR反应器中培养出的好氧颗粒污泥总蛋白的提取
提取步骤：
(1)取湿好氧颗粒污泥，用去离子水反复冲洗5次，去除好氧颗粒污泥表面杂质；
(2)将清洗过的好氧颗粒污泥离心，离心转速11000r/min，离心时间10min，保证好氧颗粒污泥含水率小于90％，同时取离心后的好氧颗粒污泥10g；
(3)加入液氮，在玛瑙研钵里反复研磨3次，保证好氧颗粒污泥接近粉末；
(4)在第(3)步的粉末中加入去离子水，去离子水的量为40mL；
(5)将第(4)步的溶液倒入高型烧杯中，在缓慢搅拌的条件下，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH至12.3；
(6)将高型烧杯放入50℃的水浴锅中恒温消解，消解时间为9h；
(7)将消解后的溶液离心，离心速度为3600r/min，离心时间为15min；
(8)取离心后上清液，此上清液中含有提取的好氧颗粒污泥的总蛋白。
如图1所示，第1泳道为实施例2条件下提取的好氧颗粒污泥总蛋白样品，第2泳道为实施例3条件下提取的好氧颗粒污泥总蛋白样品，第3泳道为实施例4条件下提取的好氧颗粒污泥总蛋白样品，第4泳道为实施例1条件下提取的好氧颗粒污泥总蛋白样品。可以看出第4泳道条带较多，条带清晰，亮度较高，小分子量蛋白条带也清晰可见，说明在实施例1条件下提取的好氧颗粒污泥总蛋白纯度较高，蛋白稳定，小分子量蛋白不易降解，即实施例1为本发明方法的最佳工艺条件。
实施例5：利用模拟生活污水在SBR反应器中培养出的好氧颗粒污泥总蛋白的提取
提取步骤：
(1)取湿好氧颗粒污泥，用去离子水反复冲洗，例如冲洗6次，去除好氧颗粒污
泥表面杂质；
(2)将清洗过的好氧颗粒污泥离心，离心转速可以控制为11000r/min，离心时间12min，保证好氧颗粒污泥含水率小于90％，同时取离心后的好氧颗粒污泥10g；
(3)加入液氮，在玛瑙研钵里反复研磨3次，保证好氧颗粒污泥接近粉末；
(4)在第(3)步的粉末中加入去离子水，去离子水的量为35mL；
(5)将第(4)步的溶液倒入高型烧杯中，在缓慢搅拌的条件下，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH至12.5；
(6)将高型烧杯放入51℃的水浴锅中恒温消解，消解时间为11h；
(7)将消解后的溶液离心，离心速度为3500r/min，离心时间为15min；
(8)取离心后上清液，此上清液中富含提取的好氧颗粒污泥的总蛋白。
本实施例中，pH、消解温度和消解时间对好氧颗粒污泥总蛋白的提取影响不大，所提取的好氧颗粒污泥总蛋白种类较多，纯度较高，比较稳定，小分子量蛋白也不易降解。
实施例6：
提取方法与实施例1基本相同，不同之处为：步骤(5)中，调节好氧颗粒污泥的pH至14，此条件下，由于pH对好氧颗粒污泥总蛋白提取影响较大，好氧颗粒污泥总蛋白没有提取出来。
实施例7：
提取方法与实施例1基本相同，不同之处为：步骤(5)中，调节好氧颗粒污泥的pH至13，此条件下，好氧颗粒污泥微生物细胞破碎不充分，提取的好氧颗粒污泥总蛋白种类较少，纯度不高。
实施例8：
提取方法与实施例1基本相同，不同之处为：步骤(5)中，调节好氧颗粒污泥的pH至12，此条件下，好氧颗粒污泥微生物细胞破碎不充分，提取的好氧颗粒污泥总蛋白种类较少，纯度不高。
实施例9：
提取方法与实施例1基本相同，不同之处为：步骤(6)中，消解温度控制在55℃，此条件下，由于消解温度稍高，提取的好氧颗粒污泥总蛋白中小分子量蛋白已有部分降解。
实施例10：
提取方法与实施例1基本相同，不同之处为：步骤(6)中，消解温度控制在47℃，此条件下，好氧颗粒污泥微生物细胞破碎不充分，提取的好氧颗粒污泥总蛋白种类较少，纯度较低。
实施例11：
提取方法与实施例1基本相同，不同之处为：步骤(6)中，消解时间为9h，此条件下，提取的好氧颗粒污泥总蛋白纯度较低。
实施例12：
提取方法与实施例1基本相同，不同之处为：步骤(6)中，消解时间为12h，此条件下，由于消解时间稍长，提取的小分子量蛋白已有部分降解。
在上述实施例中，好氧颗粒污泥含水率小于90％，实际处于80-90％之间，例如85％，88％，均可。研磨后的好氧颗粒污泥呈糊状，如果不加去离子水，则不能方便准确调节pH，后续提取的总蛋白效果略差；去离子水的加入量为污泥的4倍左右，例如3.5倍也可。
此外，发明方法对正常环境下和盐胁迫环境下培养的好氧颗粒污泥提取总蛋白同样适用。

Claims (9)

1.一种好氧颗粒污泥总蛋白的提取方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)好氧颗粒污泥用去离子水清洗后离心；
(2)将离心后的好氧颗粒污泥用液氮研磨；
(3)调节研磨后好氧颗粒污泥的pH值为11-14；
(4)对调节pH后的好氧颗粒污泥进行消解，消解温度为45-55℃，消解时间控制在9-12h；
(5)对消解后的好氧颗粒污泥离心，取上清液，得到好氧颗粒污泥总蛋白。
2.根据权利要求1所述的好氧颗粒污泥总蛋白的提取方法，其特征在于：步骤(1)中，清洗、离心后所述好氧颗粒污泥的含水率保持在80-90％。
3.根据权利要求2所述的好氧颗粒污泥总蛋白的提取方法，其特征在于：清洗、离心后所述好氧颗粒污泥的含水率保持在88-90％。
4.根据权利要求1所述的好氧颗粒污泥总蛋白的提取方法，其特征在于：步骤(3)中，调节研磨后所述好氧颗粒污泥的pH值为12.3-12.5。
5.根据权利要求1所述的好氧颗粒污泥总蛋白的提取方法，其特征在于：步骤(3)中，使用NaOH调节所述好氧颗粒污泥的pH值。
6.根据权利要求1所述的好氧颗粒污泥总蛋白的提取方法，其特征在于：步骤(3)中，调节pH值前，先向好氧颗粒污泥中加入去离子水，其中，好氧颗粒污泥与去离子水的重量比为1:3.5-4。
7.根据权利要求1所述的好氧颗粒污泥总蛋白的提取方法，其特征在于：步骤(4)中，所述消解温度为50-51℃。
8.根据权利要求1所述的好氧颗粒污泥总蛋白的提取方法，其特征在于：步骤(4)中，所述消解时间为10-11h。
9.根据权利要求1所述的好氧颗粒污泥总蛋白的提取方法，其特征在于：步骤(5)中，所述离心转速为3500-3700r/min，时间为10-20min。
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