CN104606200A - 氯噻嗪在制备抑制肿瘤细胞转移和扩散的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开氯噻嗪在制备抑制肿瘤细胞转移和扩散的药物中的应用。本发明利用氯噻嗪制备的药物对肿瘤细胞的转移能力进行抑制，氯噻嗪为低毒药物，可在肿瘤扩散过程中起到较大的阻断作用，与此同时再采用其他相关肿瘤药物进行治疗，可以大量减少正常细胞的死亡量；而现有的肿瘤药物多为细胞毒药物，在杀死肿瘤细胞的同时大量正常细胞也一起死亡。

Description

氯噻嗪在制备抑制肿瘤细胞转移和扩散的药物中的应用

技术领域

本发明涉及氯噻嗪在制药领域新的用途，具体涉及氯噻嗪在制备抑制肿瘤细胞转移和扩散的药物中的应用。

背景技术

氯噻嗪，利尿、降压药。用于治疗原发性高血压。该固定剂量复方用于治疗单用厄贝沙坦或氢氯噻嗪不能有效控制血压的患者。

厄贝沙坦氢氯噻嗪复合制剂中的氢氯噻嗪可引起交感神经系统和肾素－血管紧张素系统激活，对抗降压作用，并降低血钾水平。而厄贝沙坦能够抵消由利尿剂诱发的代偿机制，从而加强利尿剂的降压效果，同时还能选择性阻断AT1亚型受体发挥降压作用。另外，厄贝沙坦能够减弱氢氯噻嗪诱发的血清尿酸升高和血钾降低。厄贝沙坦氢氯噻嗪(r)能有效降低轻、中或重度高血压病人的血压，降低程度与ACEI、β阻滞剂和钙拮抗剂等单独或联合使用氢氯噻嗪相当。厄贝沙坦和氢氯噻嗪联用较单用所增加的疗效对达到治疗指南(JNC7和WHO/ISH)的目标血压十分重要。此外，长期使用厄贝沙坦氢氯噻嗪(r)的耐受性以及每天1片的简单用药方法可能对病人坚持治疗有所帮助。因此，厄贝沙坦氢氯噻嗪(r)对于为降低血压而必须联合用药的病人是合理选择。

现有公开文献中尚未发现氯噻嗪的其他药理作用。

发明内容

发明目的：本发明目的在于提供一种氯噻嗪在制备抑制肿瘤细胞转移和扩散的药物中的应用。

技术方案：氯噻嗪在制备抑制肿瘤细胞转移和扩散的药物中的应用。

优选地，所述肿瘤细胞为结肠癌细胞。

优选地，其中氯噻嗪的浓度为0.5uM。

发明人通过细胞层面的实验研究发现，氯噻嗪对肿瘤细胞的转移能力有一定的抑制作用。目前针对现有的适应症定性其为口服，起始剂量和维持剂量是每日一次，每次一片氯沙坦钾氢氯噻嗪片(40mg+12.4mg)。

本发明需要根据现有的制剂服用方法为参考依据，在现有的细胞层面实验基础上根据新的适应症疗效以及后续相关实验设计确定新的临床给药方法及剂量。

本发明通过将肿瘤细胞采集培养后，再利用药物刺激细胞，观察细胞形态、并定量分析细胞层的面积，即细胞能够与其他细胞接触的面积，从而判断肿瘤细胞的扩散能力。细胞层面积越大越有利于与其他细胞形成连接。细胞迁移需要内外因素的配合。外部的因素指的是细胞外的信号分子。内部因素则指细胞的信号传导系统和执行运动的细胞骨架和分子马达，还有参与粘着斑形成的各种分子。细胞外信号结合胞膜受体完成其使命后，需要细胞内信号分子接力，将运动信息进一步传给细胞迁移的执行单位——细胞骨架和分子马达。种类繁多的细胞内信号分子会相互作用，影响后述这两种分子的分布，结构和活性，达到精细调整细胞运动的目的。由此可见，肿瘤细胞的转移，与细胞本身以及细胞之间的关系紧密。

癌细胞与其同源正常组织相比，细胞间的粘着性降低，故癌细胞在体内容易分散和转移。在正常细胞外被中的纤粘连蛋白是一种细胞外粘着糖蛋白，它增强了细胞与细胞外基质间的粘着。癌细胞的纤粘连蛋白显著减少或缺失，钙粘蛋白合成发生障碍，从而破坏了细胞与基质之间和细胞与细胞之间的粘着，因此癌细胞具有易于侵润组织和转移的属性。癌细胞的面积的增大增强了各个细胞之间的接触面积更利于相互之间的粘连和附着。

虽然肿瘤细胞的转移是由多种因素共同形成导致的，但是以细胞层的面积，即细胞能够与其他细胞接触的面积作为细胞转移能力大小的依据，以此作为细胞间连接强度的测定的方法，具有成本低廉、操作简便、结果易判的优点，其表现出来的细胞面积增大是最容易直接观察辨别的，主要就是通过加药刺激后对细胞间连接分子E-cadherin蛋白质进行免疫染色，继而进行定量测定。细胞层面积越大越有利于与其他细胞形成连接。

本发明以为氯噻嗪为实验对象，评估考量其在抑制肿瘤细胞转移的能力评价。具体以药物刺激前后细胞面积的变化为主要依据。

有益效果：1、本发明利用氯噻嗪制备的药物对肿瘤细胞的转移能力进行抑制，氯噻嗪为低毒药物，可在肿瘤扩散过程中起到较大的阻断作用，与此同时再采用其他相关肿瘤药物进行治疗，可以大量减少正常细胞的死亡量；而现有的肿瘤药物多为细胞毒药物，在杀死肿瘤细胞的同时大量正常细胞也一起死亡；2、本发明所使用的氯噻嗪为成药库的现有药物化合物，研发周期与新药研发的周期相比可明显减少。

附图说明

图1为0.5uM浓度氯噻嗪处理后的结肠癌细胞图；

图2为1uM浓度氯噻嗪处理后的结肠癌细胞图；

图3为5uM浓度氯噻嗪处理后的结肠癌细胞图；

图4为10uM浓度氯噻嗪处理后的结肠癌细胞图；

图5为阳性对照组，由10uM浓度nocodazole处理后的结肠癌细胞图；

图6为阴性对照组。

具体实施方式

下面通过附图对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。

实施例1：氯噻嗪在制备抑制结肠癌细胞转移和扩散的药物中的应用。具体实验方案如下：

1、实验材料

本发明实验阶段采用的是结肠癌细胞(HT29)，阳性对照采用的药物是nocodazole(实验浓度为10uM)。阴性对照组没有经过任何处理。

其中实验采用氯噻嗪化合物C₇H₆ClN₃O₄S₂，CAS NO.为58-94-6，浓度分别为10uM，5uM，1uM，0.5uM。

2、实验方法

对培养24小时的结肠癌细胞(细胞密度：10⁵)进行药物刺激2小时处理：

(1)将培养皿中状态较好的结肠癌细胞离心，加入适量培养液制成细胞悬浮液；

(2)取细胞悬液计数，按照10⁵的密度加入24孔盘中，放入37℃的CO₂培养箱中培养；

(3)24小时后，换液，培养液中加入相应量的氯噻嗪化合物配置到实验所需浓度，以及阳性对照药物，然后继续培养2小时；

(4)培养2小时后将细胞于2％的PFA溶液下37℃固定10分钟，再进行荧光染色。

3、实验结果处理

对荧光染色后的结肠癌细胞观察，将观察的图片用Image J处理并计算其细胞面积在加药前后的数据，Ratio是实验组与阴性对照组的比值。结果见表1。

表1氯噻嗪对HT29细胞刺激2小时后的面积大小

经过实验数据证明，氯噻嗪在浓度0.5uM下使结肠癌细胞表面积明显增大比例，效果较好，证明氯噻嗪可以在制备抑制结肠癌细胞转移和扩散的药物中的应用。

实施例2：Transwell细胞迁移实验测定氯噻嗪对结肠癌细胞迁移能力影响。

将1×10⁵的HT29细胞接种在Transwell小室，底部采用12.0μm膜，继续培养。待细胞贴壁后上层小室加入不同浓度氯噻嗪的DMEM完全培养基，为维持渗透压，需加入0.05％-0.2％BSA，下层小室加入含15％FBS的DMEM完全培养基并继续培养24h。用棉签小心擦去膜上表面未发生迁移的细胞，迁移至膜下表面的细胞经2％PFA在37C固定10分钟后用Giemsa染色。在高倍显微镜下随机选取10个视野，计数迁移细胞。

细胞迁移率＝[实验组细胞数平均值/空白对照组细胞数平均值]×100％。

结果显示氯噻嗪化合物对结肠癌细胞HT29有剂量依赖性的抑制迁移的作用，与对照组比较迁移细胞相对百分数显著降低(P＜0.05)。见表2。

表2Transwell法检测氯噻嗪对HT29细胞迁移的影响(n＝3x±s)

实施例3：损伤修复实验检测氯噻嗪对肿瘤细胞迁移能力影响。

取对数生长期的HT29细胞，于24孔板中每孔加细胞1×10⁵，待细胞长成单层后，划“一”字形划痕，PBS冲洗，对照组和实验组分别加氯噻嗪不同浓度并拍照，培养22h后同一部位再次拍照，测量迁移距离。实验重复3次，细胞迁移率＝[(实验组0h平均值－实验组22h平均值)/(空白对照组0h平均值－空白对照组22h平均值)]×100％。

氯噻嗪在不同浓度下(0.5-10μg/ml)对LTEP、A549细胞作用22h后的抑制迁移检测，结果显示氯噻嗪对结肠癌细胞HT29有剂量依赖性的抑制迁移的作用。与对照组比较细胞迁移率显著降低(P＜0.05)。见表3。

表3损伤修复实验检测氯噻嗪对结肠癌细胞HT29迁移率影响(n＝3x±s)

结论：氯噻嗪能够显著抑制结肠癌细胞的迁移，可以用来治病抗结肠癌转移药物。

如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。

Claims (3)

1.氯噻嗪在制备抑制肿瘤细胞转移和扩散的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中肿瘤细胞为结肠癌细胞。

3.根据权利要求1所述的应用，其中氯噻嗪的浓度为0.5uM。