CN104603094A - 通过四-o-甲基去甲二氢愈创木酸抑制bnip3以及预防和治疗缺血再灌注损伤的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于预防和治疗受试者心肌细胞中缺血再灌注(IR)损伤的方法，所述方法通过在缺血性事件之前、或期间和/或之后以足够的量向受试者施用式I的化合物、或其盐、溶剂化物或立体异构体，以减轻或阻止对心脏组织的IR损伤。还提供了包含式I的化合物、或其盐、溶剂化物或立体异构体、和/或至少一种另外的治疗剂的药物组合物。

Description

通过四-O-甲基去甲二氢愈创木酸抑制BNIP3以及预防和治疗缺血再灌注损伤的方法
相关申请的参考
本申请要求2012年7月18日提交的美国临时专利申请号61/672,884的权益，其为了如同在此充分地列明的所有目的特此通过引用并入。
发明背景
心肌细胞消亡是心脏缺血(心肌梗塞)的突出和重要致病特征。广泛已知的是，通过称为缺血/再灌注(IR)损伤的机制在梗塞之后发生了大量的心肌细胞消亡。IR损伤允许仅在心肌缺血(因此缺氧)触发细胞死亡之后重建血液供给(因此氧供给)之后发生大量细胞死亡。这表明，在缺氧之后的常氧条件对在心肌梗塞之后的大量心肌细胞消亡是关键的。限制该消亡是期望的治疗目标，然而取得该目标的真正有效策略的开发需要对缺血藉以触发细胞死亡的机制的理解。研究者已经转向分离的和培养的心肌细胞，以鉴定参与响应缺血的信号传导途径并系统地测试促存活(pro survival)信号传导途径和多种抗死亡分子对诸如缺氧的缺血相关的细胞损害的效力。
再灌注是挽救缺血组织的最有效策略，然而其可引起另外的损伤，导致细胞功能障碍和死亡。在心脏、脑、肝和肾中已经观察到缺血再灌注(IR)损伤的病状。
BNIP3代表了Bcl-2和19千道尔顿的相互作用蛋白-3，且是Bcl-2蛋白家族的成员。Bcl-2蛋白家族已牵涉在凋亡性和坏死性细胞死亡两者的控制和守护线粒体完整性中。它们共有称为Bcl-2同源性结构域的多达4个保守的同源性区域(BH1、BH2、BH3和BH4)，其介导多种家族成员中的相互作用，并在功能上分为抗凋亡和促凋亡成员。许多这些蛋白通常存在于膜细胞结构，包括线粒体、内质网、和核被膜中，或在细胞死亡信号转导途径的执行期间被募集到这样的结构(主要是线粒体)。抗凋亡成员，例如Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-I、AI、Bcl-W显示了贯穿全部4个BH结构域的序列同源性。当其过度表达时，拮抗许多促存活蛋白的活性并诱导细胞死亡的促凋亡成员，显示了与较少BH结构域的同源性。如同Bax和Bak的一些蛋白包含BH1、BH2和BH3结构域，然而许多其他蛋白(Bad、Bid、Bik、Bim、BimL、Blk和Noxa)仅具有BH3结构域(仅含BH3蛋白(BH3-onlyprotein))。
BNIP3是包括BNIP3、NixIBNIP3L和BNIP3H的仅含BH3蛋白的小组的基础成员。与Bid和Bad不同，BNIP3和Nix的促凋亡活性通过涉及HIF复合物的转录机制来调节。因此，BNIP3的启动子包含针对HIF转录复合物的功能性结合位点(缺氧应答元件，HRE)且其mRNA和蛋白表达在多种细胞类型中响应于减少的氧气浓度显著地增加。在培养的细胞中，相对于参与促进血管生成、糖分解代谢和存活的其他良好表征的HIF可诱导基因(例如，红细胞生成素、VEGF、血红素加氧酶、己糖激酶和IGF2)晚发生的BNIP3的增加的表达，表现为是第二波缺氧诱导的蛋白积累的部分。
已经证明，(i)BNIP3表达响应于缺氧显著地增加，(ii)BNIP3的强制的表达引起在常氧心肌细胞中细胞死亡，和(iii)缺少其跨膜结构域的BNIP3突变体(BNIP3L1TM)的强制的表达部分地阻断缺氧诱导的细胞死亡。
因此，还存在对新的方法和药物的需要，以减轻或阻止作为心脏骤停、梗塞的结果或由于手术干预引起的IR诱导的心肌细胞中的细胞死亡。
发明概述
发明人已发现，通过施用BNIP3表达的抑制剂对BNIP3表达的抑制对改善梗塞之后的心脏状况是有益的。本发明显示了，称为四-o-甲基去甲二氢愈创木酸(M4N)的式I的化合物、或其盐、其溶剂化物、或立体异构体对预防或治疗具有心力衰竭或罹患缺血性事件的受试者中的IR损伤是有用的。
根据一个实施方案，本发明提供了式(I)的化合物：
或其溶剂化物、或立体异构体，用于在预防或治疗受试者心肌细胞中的缺血再灌注损伤(IR)中使用，所述使用包含以足够抑制受试者心肌细胞中IR损伤的量施用式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体。
根据另一个实施方案，本发明提供了式(I)的化合物：
或其溶剂化物、或立体异构体，用于在抑制受试者心肌细胞中的BNIP3表达中使用，所述使用包含以足够抑制受试者心肌细胞中BNIP3蛋白表达的量施用式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体。
在一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含上述化合物的任何一种的化合物、溶剂化物或立体异构体、和药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含上述化合物的任何一种的化合物、溶剂化物或立体异构体、至少一种另外的治疗剂、和药学上可接受的载体。
根据又一个实施方案，本发明提供了用于预防受试者心肌细胞中IR损伤的方法，所述方法包含在缺血性事件之前，以足够减少IR损伤的量的量向受试者施用式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体，或包含式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体的药物组合物。
还根据另一个实施方案，本发明提供了用于治疗受试者心肌细胞中IR损伤的方法，所述方法包含在缺血性事件期间和/或之后，以足够减少IR损伤的量的量向受试者施用式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体，或包含式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体的药物组合物。
根据一个实施方案，本发明提供了用于预防或抑制将要经受能够引起IR损伤的手术程序的受试者心肌细胞中IR损伤的方法，所述方法包含在所述程序之前，以有效预防或减少IR损伤的量向受试者施用式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体，或包含式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体的药物组合物。
附图简述
图1显示了M4N对HL-1小鼠心脏细胞中由缺氧诱导的TUNEL阳性细胞死亡的影响。用多种浓度的M4N处理细胞并在缺氧下孵育6小时，随后在常氧下孵育18小时。用TUNEL测定(TUNEL assay)测量细胞死亡。星号(*)表示通过t检验以小于1％的错误率的在它们之间的统计学的显著差异。
图2描述了M4N对HL-1小鼠心脏细胞中由缺氧诱导的细胞死亡的影响。通过台盼蓝排除测定(Trypan Blue exclusion assay)检查了20μM和40μM的M4N对HL-1细胞中由缺氧诱导的细胞死亡的影响。数据展示为一式三份的平均值(+/-)标准偏差。通过t检验分别以小于2％(*)、0.1％(**)和1％(+)的错误率，两组之间标以符号(*、**、+)的差异是统计学上显著的。
图3显示了缺氧下M4N对HL-1小鼠心脏细胞中BNIP3表达的影响。HL-1细胞在缺氧下孵育6小时，随后在常氧下孵育18小时。作为对照，HL-1细胞在缺氧下孵育24小时。通过蛋白质印迹测量蛋白表达。使用β-肌动蛋白作为对照。
图4描述了M4N对HL-1小鼠心脏细胞中通过UCN-01处理诱导的细胞死亡的影响。用M4N处理细胞，随后用UCN-01(0.2μM)处理24小时。用台盼蓝排除测定测量了细胞死亡。星号表示通过t检验以小于2％的错误率的统计学上显著性差异。
发明详述
IR损伤是心肌梗塞之后的大量心肌细胞消亡的主要原因。认为BNIP3是对加重梗塞之后的IR损伤的主要贡献者，且利用BNIP3作为用于治疗心脏衰竭的靶的基本原理是公认的。因此，本发明人假定，只要治疗对患者不具有不良副作用，通过任何手段阻断BNIP3将阻止梗塞之后的大量心肌细胞消亡。
根据一些实施方案，本发明人现已证明M4N是对BNIP3表达非常有效的抑制剂。事实上，5-20μM浓度的M4N减少了由缺氧处理诱导的HL-1小鼠心脏细胞的细胞死亡。本发明还显示了，在HL-1细胞中由缺氧诱导的大多数细胞死亡是坏死的，因为TUNEL测定仅检测伴随其是凋亡的标志的DNA断裂的细胞死亡。M4N减少无论通过台盼蓝排除测定还是TUNEL测定测量的细胞死亡，表明该药物对抑制缺氧介导的细胞死亡的坏死和凋亡两者是有效的。此外，约20μM浓度的M4N能够将HL-1细胞中通过UCN-01诱导的细胞死亡减少到某种程度，表明M4N对细胞的保护性活性并不局限于缺氧相关的细胞死亡损伤。
根据一个实施方案，本发明提供了式(I)的化合物：
或其溶剂化物、或立体异构体，用于在预防或治疗受试者心肌细胞中的缺血再灌注损伤(IR)中使用，所述使用包含以足够抑制受试者心肌细胞中IR损伤的量施用式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体。
在一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含上述化合物的任何一种的化合物、溶剂化物或立体异构体、和药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含上述化合物的任何一种的化合物、溶剂化物或立体异构体、至少一种另外的治疗剂、和药学上可接受的载体。
公开的化合物的互变异构体形式、包括非对映异构体的同分异构形式、和其药学上可接受的盐被包括在本发明的化合物之内。
此外，本发明的实施方案包括本发明的化合物的水合物。术语“水合物”包括但不限于半水合物、一水合物、二水合物、三水合物等等。可通过在产生选择的水合物的合适条件下用水接触化合物，制备本发明的化合物的水合物。
关于在此描述的药物组合物，载体可以是常规使用的那些的任何一种，并仅受诸如溶解性和对活性化合物缺少反应性的物理化学注意事项，和施用途径的限制。在此描述的载体，例如媒介物、佐剂、赋形剂和稀释剂对本领域普通技术人员是公知的并对公众是容易获得的。对活性剂是化学惰性的载体，和在使用的条件下具有很少或没有有害副作用或毒性的载体是优选的。载体的实例包括固体组合物诸如固态载体或乳胶珠。
固体载体或稀释剂包括，但不限于胶、淀粉(例如，玉米淀粉、预胶化淀粉)、糖(例如，乳糖、甘露醇、蔗糖、右旋糖)、纤维素材料(例如，微晶纤维素)、丙烯酸酯(例如，聚甲基丙烯酸酯)、碳酸钙、氧化镁、滑石、或其混合物。
载体的选择将部分地由特定药物组合物，以及由施用组合物所用的特定方法决定。因此，存在本发明的药物组合物的多种适合制剂。
如在此使用的，术语“IR损伤”意指表现为小动脉中受损的内皮依赖性扩张、增强的流体过滤和毛细血管中的白细胞堵塞、和毛细血管后微静脉(postcapillary venule)中白细胞的运输和血浆蛋白外渗的微血管功能障碍。在再灌注之后的起始阶段中，在微循环的所有部分中的活化的内皮细胞产生了更多的氧自由基，然而更少的一氧化氮。在内皮细胞中超氧化物和一氧化氮之间产生的不平衡导致了炎性介质的产生和释放(例如，血小板活化因子、肿瘤坏死因子)并增强了介导白细胞-内皮细胞粘附的粘附分子的生物合成。心血管疾病(高胆固醇血症、高血压、和糖尿病)的一些已知风险因素表现为放大了由缺血和再灌注引起的许多微血管改变。作为再灌注的结果释放的炎性介质也表现为活化了在未暴露于初始缺血性损伤的远端器官中的内皮细胞。对IR损伤的该远端响应可导致白细胞依赖性微血管损伤，其是多器官功能障碍综合征的特征。通常，在心脏组织中，产生的IR损伤是随后的心脏衰竭的原因。再灌注损伤可造成多达50％或更多的最终梗塞面积且也是手术后死亡率和发病率的重要贡献者。临床上，因为由再灌注本身起始的细胞损伤和死亡，通过早期再灌注的心肌挽救的程度不可实现。
根据另一个实施方案，本发明提供了式(I)的化合物：
或其溶剂化物、或立体异构体，用于在抑制受试者心肌细胞中的BNIP3表达中使用，所述使用包含以足够抑制受试者心肌细胞中BNIP3蛋白表达的量施用式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体。
如在此使用的，术语“抑制表达”意指，由用式(I)的化合物、或其盐、溶剂化物、或立体异构体处理的心肌细胞表达的BNIP3蛋白的量比由对照或未处理的心肌细胞两者之一表达的BNIP3蛋白的量可测量地更少。
本领域普通技术人员将理解，术语“治疗剂”是能够影响受试者身体结构或功能的任何剂或是对治疗或调整罹患其的受试者中的疾病或状况是有用的剂。治疗剂的实例可包括用于治疗疾病适应症的本领域公知的任何药物。
根据又一个实施方案，本发明提供了用于预防受试者心肌细胞中IR损伤的方法，所述方法包含在缺血性事件之前，以足够减少IR损伤的量的量向受试者施用式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体，或包含式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体的药物组合物。
还根据另一个实施方案，本发明提供了用于治疗受试者心肌细胞中IR损伤的方法，所述方法包含在缺血性事件期间和/或之后，以足够减少IR损伤的量的量向受试者施用式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体，或包含式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体的药物组合物。
根据一个实施方案，另外的治疗剂是可减轻或预防IR损伤的剂，或另一种心脏治疗剂。减轻或预防IR损伤的剂的实例包括，例如别嘌呤醇、腺苷、氧自由基清除剂、抗氧化剂、中性粒细胞的抑制剂、一氧化氮、腺苷相关的剂、肾素-血管紧张素系统的抑制剂、内皮素受体拮抗剂、Na+/H+交换抑制剂和抗凋亡剂，诸如IL-10。
其他心脏治疗剂的实例包括，例如钙通道阻滞剂、β-阻滞剂、地高辛和其他的强心苷、水杨酸、血管扩张剂、ACE抑制剂、利尿剂、正性肌力药、抗血小板药物、抗凝血剂、硝酸盐、血栓溶解剂和抗心律不齐剂。
根据一个实施方案，本发明提供了上述化合物的任一种的化合物、盐、溶剂化物或立体异构体，用于在制备药剂，优选地用于预防或治疗受试者心肌细胞中IR损伤的药剂中使用。
为了本发明的目的，施用的本发明的组合物的量或剂量应当对于有效地靶向体内(in vivo)的细胞或细胞群体是足够，以至于经过合理的时间范围在受试者中预防或减轻靶细胞或靶细胞群体中IR损伤或死亡。将通过特定药物制剂的效力和在受试者中靶细胞群体的位置，以及受治疗的受试者的体重确定剂量。
在此可互换使用的活性剂和生物活性剂是指诱导希望的药理学和/或生理学作用的化学或生物化合物，其中该作用可以是预防性的或治疗性的。该术语还包含在此具体地提及的那些活性剂的药学上可接受的、药理学上活性衍生物，包括但不限于盐、酯、酰胺、前体药物、活性代谢物、类似物等等。当使用术语“活性剂”、“药理学上活性剂”和“药物”时，然后应当理解的是，本发明包括活性剂本身、以及药学上可接受的、药理学上活性的盐、酯、酰胺、前体药物、活性代谢物、类似物等。
通过可能伴随特定组合物的施用的任何不良副作用的存在、性质和程度还将确定本发明的组合物的剂量。典型地，考虑到各种因素，例如年龄、体重、一般健康、饮食、性别、待施用的化合物、施用途径和被治疗的状况的严重性，主治医师将决定用其治疗每位个体受试者的药物组合物的剂量。通过举例的方式，且不旨在限制本发明，本发明的药物组合物的剂量可以是约0.001mg/kg到1000mg/kg被治疗的受试者体重、从约0.01mg/kg到约100mg/kg体重、从约0.1mg/kg到约10mg/kg体重、和从约0.5mg/kg到约5mg/kg体重。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物的剂量可以是在从约100nM到约50μM、优选地从约1μM到约20μM的浓度。
如在此使用的术语“治疗”、和“预防”以及由此产生的词不必然地表示100％或完全的治疗或预防IR损伤。而是，存在本领域普通技术人员知晓其具有潜在的益处或治疗作用的不同程度的治疗或预防。在该方面，本发明方法可提供任何水平的治疗或预防哺乳动物中IR损伤或心肌细胞的细胞死亡的任何量。此外，通过本发明方法提供的治疗或预防可包括治疗或预防被治疗或预防的疾病例如癌症的一种或更多种状况或症状。而且为了本文的目的，“预防”可包含延迟疾病的发作、或其症状或状况的发作。
通过可能伴随特定组合物的施用的任何不良副作用的存在、性质和程度还将确定本发明的组合物的剂量。典型地，考虑到各种因素，例如年龄、体重、一般健康、饮食、性别、待施用的化合物、施用途径和被治疗的状况的严重性，主治医师将决定用其治疗每位个体受试者的药物组合物的剂量。
如在此使用的，术语“有效量”或“足够量”是指治疗(例如，预防性或治疗性剂)的量的等价短语，所述治疗的量对于减少疾病的严重性和/或疾病的持续时间、改善其一种或更多种症状、阻止疾病的进展或引起疾病的消退是足够的、或对于预防疾病或其一种或更多种症状的发展、复发、发作或演变，或增强或提高对治疗诸如IR损伤的疾病是有用的另一种治疗(例如，另一种治疗剂)的预防性和/或治疗性作用是足够的。
根据一个实施方案，本发明提供了用于预防或抑制在将要经受能够引起IR损伤的手术程序的受试者心肌细胞中IR损伤的方法，所述方法包含在所述程序之前，以有效阻止或减少IR损伤的量向受试者施用式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体，或包含式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体的药物组合物。
本领域技术人员将理解在受试者将要进行心脏手术的情况下，可进行式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体，或包含式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体的药物组合物的施用。在此类情况下，在对心脏的实际手术程序期间，对心脏进行暂时的骤停和/或缺血。在该程序之前至少30分钟到6小时施用本发明的化合物和组合物将减少或预防对心脏组织的随后IR损伤。
实施例
细胞培养。HL-1小鼠心脏细胞系来自Claycomb博士(LSU HealthScience Centers,New Orleans LA)(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,95:2979-84(1998))的惠赠。将HL-1细胞培养在用FBS(10％)、去甲肾上腺素(0.1mM)、L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素(100单位/ml)和链霉素(100μg/ml)补充的Claycomb培养基(Sigma,Saint Louis,MO)中。将药物以小于0.1％的在培养基中的终浓度溶解于二甲亚砜中。当细胞被表明在缺氧条件下培养时，在缺氧培养箱(BioSpherix Ltd,Lacona,NY)中在0.5％的氧气浓度下孵育细胞。
试剂。根据所描述的方法(Anti-Cancer Drugs 18:933-939(2007))，通过Erimos Pharmaceutical L.L.C.(Raleigh,NC)供应了Terameprocol(M4N)(CPE 25/30制剂中10mg/ml)。依托泊苷、雷帕霉素、UCN-01和巴佛洛霉素A1都来自Sigma。抗BNIP3小鼠单克隆抗体来自Abcam(Cambridge,MA)。抗肌动蛋白单克隆抗体来自Sigma。
细胞死亡测定。通过使用TUNEL凋亡检测试剂盒(Upstate,Temecula,CA)进行了带有一些修改的末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定。在12-孔微孔培养皿(Corning Inc.,Corning,NY)中培养细胞。在处理之后，将漂浮在组织培养基中的细胞和吸附到孔的底部的那些两者都一起收集到塑料管中。在700rpm下将细胞离心下来之后，在用PBS-(-)(不含钙和镁的磷酸盐缓冲生理盐水)中10％甲醛将它们固定5分钟并储存在PBS-(-)中。将固定的细胞样品放置在载玻片上并在空气中干燥。首先将玻片在室温下在PBS-(-)中包含0.05％吐温-20、0.2％BSA的溶液中孵育15分钟。然后按照制造商的方案，在室温下用包括在TUNEL测定试剂盒中的末端脱氧转移酶和生物素-dUTP处理样品60分钟。在孵育之后，在室温下用亲和素-生物素复合物(ABC试剂,Vector Laboratory Inc.,Burlingame,CA)孵育样品30分钟。在用PBS-(-)充分洗涤之后，通过使用DAB作为底物(过氧化酶底物试剂盒，Vector Laboratory Inc.)的过氧化酶反应暴露样品的DNA终末端。通过甲基绿复染样品并将其包埋到VectaMount(Vector Laboratory Inc.)中。
对于台盼蓝排除测定，用PBS(-)洗涤细胞一次并再重悬于PBS(-)中。将重悬的细胞溶液的一部分与0.4％台盼蓝溶液(Sigma)的一部分混合。在约5分钟到15分钟内对没有染色的细胞和染色的细胞两者的数目计数。计算了染色的细胞的数目相对于全部细胞数目(其等于染色的细胞的数目和没有染色的细胞的数目)的百分比。
蛋白质印迹。在25mm2烧瓶中生长细胞并用试剂处理细胞之后，用PBS(-)洗涤细胞三次并悬浮在用蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)(Calbiochem,San Diego,CA)补充的RIPA缓冲液(150mM NaCl、50mMTris-HCl(pH 8.0)、0.1％SDS、1％NP40、和0.5％脱氧胆酸盐)中。通过总蛋白量调整样品体积。通过Bio-Rad蛋白测定(Bio-Rad Laboratories,Inc.Hercules,CA)进行蛋白测定。通过标准SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳解析样品并转移到硝酸纤维素膜(Amersham Biosciences,Bjorkgatan,Sweden)。用脱脂牛奶封闭膜，并用一抗在4℃下孵育过夜，且然后用与辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育2小时。通过蛋白质印迹化学发光剂Plus(WesternBlot Chemiluminescence Reagent Plus)(New England Nuclear Life ScienceProducts,Boston,MA)检测信号。
线粒体通透性转换孔(mPTP)开口的测量。通过Image-iT实时线粒体通透性转换孔测定试剂盒(Molecular Probes,Eugene OR)测量mPTP。首先用还包括HEPES(10mM)、L-谷氨酰胺(2mM)和琥珀酸盐(succinate)(100μM)的含碳酸氢钠、钙和镁的汉克平衡盐溶液(HBSS)洗涤细胞，来支持健康线粒体功能(改良HBSS)。然后，在含1μM CoCl2的改良HBSS中用钙黄绿素-AM(1.0μM)和MitoTracker Red CMSRos染料(200nM)标记细胞15分钟。将培养基改变为正常的HL-1培养基之后，用M4N在多种浓度下(0μM、5μM、10μM、20μM、40μM和80μM)处理细胞。在缺氧下孵育细胞6小时，接着在常氧下孵育8小时。用改良HBSS洗涤细胞之后，用B29/ZeissLSM 510META激光共聚焦显微镜(Carl Zeiss,Jena,Germany)在对于钙黄绿素在FITC设置下和对于MitoTracker在罗丹明设置下检查它们。
实施例1
M4N对小鼠心脏HL-1细胞中由缺氧诱导的细胞死亡的影响。先前发现了M4N在多种癌症细胞诸如人前列腺癌LNCaP和PC3细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、或人肝癌HepG2细胞中减少BNIP3的表达，其表明M4N对BNIP3表达的抑制作用是普遍存在的。由于调查对活心脏的直接药物作用在技术上是困难的，使用了HL-1小鼠心脏组织培养物作为模式系统。通过遗传分析和生理学特征，认为HL-1细胞非常接近于正常心脏细胞。由于该原因，HL-1细胞非常适合于该调查。对于缺氧处理，在缺氧培养箱中在0.5％氧气浓度下培养细胞6小时并将细胞返回到在正常培养箱中的常氧条件，且然后在18小时之后测量细胞死亡。该程序被用来模拟代表心肌缺血/再灌注损伤的条件，其被认为是在心肌梗塞之后的心力衰竭的主要原因。
首先，检查了在HL-1细胞中的由6小时缺氧处理、之后用18小时常氧处理诱导的TUNEL-阳性细胞死亡(图1)。数据显示，5-20μM的M4N减少了由缺氧诱导的细胞死亡。然而，通过TUNEL测定检测的细胞死亡的水平相当小。然后，通过台盼蓝排除测定定量了细胞死亡(图2)。数据显示通过台盼蓝排除测定的细胞死亡的数目比通过TUNEL测定的显著地更高(图1)，其表明了，由于TUNEL测定仅检测伴随其是凋亡的特征的显著数量的DNA断裂的细胞死亡，由于缺氧在HL-1细胞中的大多数细胞死亡通过坏死发生而不是通过凋亡发生。台盼蓝排除测定显示，20μM的M4N减少了由缺氧诱导(6小时缺氧与另外18小时常氧处理或24小时缺氧处理)的细胞死亡。此外，甚至与在常氧条件下的对照相比较，20μM的M4N也减少了细胞死亡。数据还显示，甚至在对照培养物中细胞的特定量(通过台盼蓝排除测定测量的全部的约20％阳性细胞)已被认为死亡。这是HL-1细胞与已知在组织培养条件下难以维持的正常人心肌细胞在生理学上相似的标志之一。数据整体表明，约5-20μM浓度的M4N抑制TUNEL阳性细胞死亡，以及可由台盼蓝排除测定检测的细胞死亡，其表明在该浓度范围下的M4N抑制在由缺氧处理的HL-1细胞中的坏死和凋亡。
实施例2
M4N对小鼠心脏HL-1细胞中的BNIP3表达的影响。图3显示了，通过10-40μM浓度的M4N处理确实抑制了在缺氧下6小时且然后在常氧下18小时孵育的HL-1细胞中BNIP3表达。这些是在图1和图2中显示的细胞死亡测定所用的相同条件。有趣地是，显示BNIP3基因启动子包含能够与SP1结合的许多GC盒，其说明M4N可能通过其对SP1与这些GC盒的结合的竞争性地抑制作用抑制BNIP3表达。
实施例3
M4N对线粒体通透性转换孔(mPTP)开口的影响。报道了BNIP3通过mPTP的开口并通过Bax/Bak的激活介导线粒体功能障碍。认为mPTP主要在坏死上起作用，而Bax/Bak通道参与凋亡性细胞死亡。由于本发明(图1和图2)表明，在实验性系统中坏死是细胞死亡的主要途径，检查了M4N对mPTP开口的作用。共聚焦显微术表明，5-20μM浓度的M4N抑制了由缺氧诱导的mPTP开口(数据未显示)，其与显示5-20μM的M4N抑制缺氧介导的细胞死亡(图2)的细胞死亡数据是可比的。数据还表明，在用IR损伤处理的HL-1细胞中由M4N抑制细胞死亡的机制是通过抑制缺氧诱导的BNIP3上调和然后堵塞mPTP开口。
实施例4
M4N对UCN-01诱导细胞死亡的影响。接下来，检查了M4N对HL-1细胞中由抗癌药物UCN-01诱导的细胞死亡的影响(图4)。如用台盼蓝排除测定所测量的，本数据表明约20μM浓度的M4N减少了HL-1细胞中UCN-01介导的细胞死亡。数据表明，M4N对抗细胞死亡诱导的损伤的保护性作用并不限于缺氧诱导的细胞死亡。
通过M4N抑制BNIP3表达的机制不是已知的。发明人自己的内部数据表明，M4N阻碍LNCaP人前列腺癌细胞中在转录水平上的BNIP3表达(数据未显示)。由于在BNIP3启动子中存在能够与SP1结合的许多GC盒，M4N可通过竞争性结合到这些GC盒来抑制BNIP3表达。BNIP3通过激活Bax/Bad并透化(permeabilizing)线粒体膜诱导线粒体的细胞死亡刺激物。本发明显示M4N确实抑制了HL-1细胞中由缺氧诱导的mPTP的开口，其支持了M4N通过抑制BNIP3表达然后预防mPTP的开口来保护HL-1细胞免受缺氧介导的细胞死亡的机制性模型。在心脏中，mPTP的开口可能参与由于在缺血之后的再灌注的心肌损伤的机制。认为mPTP的延长的开口是引起心肌细胞功能和活力的损失的心肌损伤的级联的端点之一。因此，通过M4N阻塞mPTP开口被认为对预防在再灌注之后的心肌细胞的进一步损伤是有益的。
发明人的有关LNCAP细胞中线粒体代谢和膜电位的数据表明，M4N具有抑制线粒体代谢和诱导△Ψm的超极化(hyperpolarization)的活性(数据未显示)。许多研究已经显示了，由于细胞死亡机制需要ATP来完成其功能，在恢复氧气供应之后的线粒体代谢的上调是在缺血之后起始细胞死亡的主要驱动力之一。这表明，M4N抑制线粒体代谢的能力是在M4N可减少缺氧处理之后HL-1细胞中细胞死亡的主要原因之中。
在作为抗癌药物的M4N的许多临床试验中，已经显示了其是非常无毒性和安全的药物，其表明BNIP3表达本身的堵塞应该对人无害。已经发现BNIP3敲除小鼠存活而没有明显的异常的事实作为BNIP3表达的切除不以显著的程度干扰正常生物功能的另一个指示。
在此引用的包括出版物、专利申请和专利的所有参考文献，特此通过引用并入本文，其程度就如同单独地和具体地表明每个参考文献通过引用并入本文并以其整体在此列出。
除非在此另有说明或与上下文明显矛盾，将在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)术语“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”和类似指代的使用解释为涵盖单数和复数两者。除非另有说明，将术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“包含(containing)”解释为开放式术语(即，意思是“包括，但不限于”)。除非在此另有说明，在此数值的范围的叙述仅仅旨在作为单独地提及落入范围之内的每个单独数值的简写方法，且就如同其被单独地在此引用一样，将每个单独数值并入说明书。除非在此另有说明或与上下文明显地矛盾，可以以任何适合的顺序进行在此所述的所有方法。除非另外地要求保护，在此提供的任何和所有实例、或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好阐述本发明且并非造成对本发明的范围的限制。在说明书中的语言不应被解释为表明任何非要求保护的要素为对本发明的实践所必要的。
在此描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知为了完成本发明的最佳实施方式。根据阅读以上描述，那些优选的实施方案的变化对本领域普通技术人员可变得明显。发明人预期普通技术人员适当地采用此类变化，且发明人预期了以如在此具体地描述的之外的方式实践本发明。因此，如由适用法律所允许的，本发明包括在此所附的权利要求中所引用的发明主题的所有修改和等价物。此外，除非在此另有说明或与上下文明显矛盾，以上所述的要素的任何组合以其所有可能的变化被本发明包含。

Claims (15)

1.一种式(I)的化合物：
或其溶剂化物、或立体异构体，用于在预防或治疗受试者心肌细胞中的缺血再灌注损伤(IR)中使用，所述使用包含以足够抑制受试者心肌细胞中IR损伤的量施用所述式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体的施用是在缺血性事件的发作之前。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的化合物，其中所述式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体的施用是在缺血性事件的发作期间和/或之后。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中所述式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体的施用是在缺血性事件之后起始的再灌注期间和/或之后。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中向所述受试者施用的所述量足够提供1μM到50μM之间、优选地10μM到20μM之间的血液中的浓度。
6.一种式(I)的化合物：
或其溶剂化物、或立体异构体，用于在抑制受试者心肌细胞中的BNIP3表达中使用，所述使用包含以足够抑制受试者心肌细胞中BNIP3蛋白表达的量施用所述式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体。
7.根据权利要求x所述的化合物，其中向所述受试者施用的所述量足够提供1μM到50μM之间、优选地10μM到20μM之间的血液中的浓度。
8.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至7中任一项所述的化合物、溶剂化物、或立体异构体，和药学上可接受的载体。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述组合物还包含至少一种另外的治疗剂。
10.一种用于预防受试者心肌细胞中IR损伤的方法，所述方法包含在缺血性事件之前，以足够减少IR损伤的量的量向所述受试者施用所述式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体，或根据权利要求9或10中任一项所述的药物组合物。
11.一种用于治疗受试者心肌细胞中IR损伤的方法，所述方法包含在缺血性事件期间和/或之后，以足够减少IR损伤的量的量向所述受试者施用所述式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体，或根据权利要求9或10中任一项所述的药物组合物。
12.根据权利要求10或11中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用的所述量足够提供1μM到50μM之间、优选地10μM到20μM之间的血液中的浓度。
13.根据权利要求10或12中任一项所述的方法，其中在向所述受试者心肌细胞起始再灌注之后，向所述受试者施用所述式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体。
14.一种用于预防或抑制将要经受能够引起IR损伤的手术程序的受试者心肌细胞中IR损伤的方法，所述方法包含在所述程序之前，以有效预防或减少IR损伤的量向所述受试者施用所述式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体，或包含所述式(I)的化合物、或其溶剂化物、或立体异构体的药物组合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中向所述受试者施用的所述药物组合物包含至少一种另外的治疗剂。
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