CN104597253A - 一种采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法 - Google Patents

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赵芳
卢菊生
张雪红
尚秋伟
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Abstract

本发明公开了一种采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，包括如下步骤：步骤一、利用氧化剂氧化大豆过氧化物酶中的糖苷键；步骤二、将蛋白与步骤一得到的大豆过氧化物酶反应形成希夫氏碱，形成稳定的酶-蛋白分子；步骤三、提纯步骤二得到的酶-蛋白分子，得到所述生物探针。本发明使用大豆过氧化物酶代替现有技术中的HRP作为标记酶制备生物探针，一方面此酶的热稳定性比HRP高，发光信号比HRP强，可以持续较长时间的强化学发光，检测灵敏度能够获得大大提高。其次，本发明制备的五种生物探针，可用于多项蛋白的检测，同时由于大豆过氧化物酶原料来源广，价格低廉，其产业化研究具有广泛的应用前景和重要的意义。

Description

一种采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法。
背景技术
大豆过氧化物酶(Soybean peroxidase,SBP)是以血红素为辅基的III类过氧化物酶(EC 1.11.1.7)，SBP是一种由单一肽链与铁卟啉构成的血红素蛋白，脱辅基蛋白分子与血红素结合构成全酶，含有大约分子量的18％的糖基，其等电点为3.9，在pH 3-8之间活性较高，作用范围可达pH 2-11。辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)是一个阳离子酶，SBP和HRP同属于植物过氧化物酶超家族的III类酶，两者的结构和作用机理有许多相似之处。有研究表明，SBP的构象稳定性远高于HRP，HRP的解链温度为74℃(pH 7.0)，远低于SBP的86℃(pH 7.0)，SBP的结合能为43.3KJ/mol,而HRP只有17KJ/mol，主要原因是SBP与HRP的血红素键联不同，特别是与血红素相连的氨基酸活性位点不同。此外，SBP有更能暴露于溶剂的血红素边缘(血红素边缘是和底物相互作用的部位)使得SBP比HRP具有更高的催化活性。当使用SBP代替常用的HRP制备生物探针催化鲁米诺-过氧化氢反应用于化学发光检测时，由于HRP是阳离子酶，会与氧化底物自由基产物相互作用而使酶失活，而SBP是阴离子酶，不会因为氧化反应产物作用失活，会产生一个较长时间的化学发光信号。使用SBP代替常用的HRP作为标记酶，在耐热性能、底物作用范围、酸碱稳定性以及制备成本等多项指标上均有明显优势。
大豆过氧化物酶是从大豆加工副产物大豆皮中提取的一类具有很高活性的酸性同功酶，而大豆皮是制油厂大豆加工的副产物，原料价廉易得，能够用于大批量生产。同时大豆过氧化物酶具有的底物作用范围广、耐热性能高、酸碱稳定性好、pH适用范围宽等优点是同类过氧化物酶不可比拟的，所以采用大豆过氧化物酶代替辣根过氧化物酶、木质素过氧化物酶等过氧化物酶作为标记酶用于生物探针制备具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明目的是提供一种采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，采用大豆过氧化物酶为标记酶，解决了现有技术中HRP催化致使鲁米诺氧化反应产生的化学发光信号持续时间短，发光信号不稳定的问题。
本发明采用以下技术方案：
一种采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，包括如下步骤：
步骤一、利用氧化剂氧化大豆过氧化物酶中的糖苷键；
步骤二、将蛋白与步骤一得到的大豆过氧化物酶反应形成希夫氏碱，形成稳定的酶-蛋白分子；
步骤三、提纯步骤二得到的酶-蛋白分子，得到所述生物探针。
步骤一所述氧化剂包括高碘酸钠，所述高碘酸钠在反应溶液中的浓度为4–8mmoL。
步骤二所述蛋白为甲胎蛋白抗体、人绒毛膜促性腺激素β亚基抗体、游离雌三醇抗体、抑制素A抗体和链酶亲和素。
本发明采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，具体包括如下步骤：
步骤一、取5mg大豆过氧化物酶溶于500μL PBS中，加入12mg/mL NaIO4溶液500μL，混匀，置室温避光反应15min；后加入500μL,0.1–5v/v％乙二醇室温反应30min；利用NaIO4对大豆过氧化物酶进行氧化，氧化速度极为迅速，加入乙二醇及时阻止了氧化环境对酶活的继续损伤，在一定程度上保持了酶活；
步骤二、将步骤一得到的溶液均分为五份，依次加入813μL、1mg/mL甲胎蛋白抗体(AFP抗体)，188μL、1mg/mL抑制素A抗体(InhibinA抗体)，200μL、1mg/mL人绒毛膜促性腺激素β亚基抗体(β-HCG抗体)，100μL、1mg/mL游离雌三醇抗体(uE3抗体)和100uL、5mg/mL链酶亲和素混匀，装入透析袋，于50mM pH 9.6碳酸盐缓冲液4℃透析24h，使大豆过氧化物酶和蛋白结合；向五种溶液中依次加入5mg/mLNaBH4溶液100μL，混匀，置4℃还原反应2h；利用NaBH4使碳氮双键变成单键，从而形成稳定的酶-蛋白分子；
步骤三、步骤二得到的五种溶液中分别加入和溶液等体积的饱和硫酸铵溶液，盐析0.5h，10000rpm离心15min，去上清，沉淀以PBS溶解，装入透析袋，于PBS中4℃透析过夜，重复本步骤中盐析至透析步骤两次；次日取出离心，除去不溶物，上层清液为大豆过氧化物酶-蛋白结合物，每种溶液中分别加入PBS 500μL复溶；效价测定合格后，加入等量甘油，分装小瓶保存。分别偶联五种蛋白的生物探针可作为标记抗体可以用于酶联免疫吸附抗原的检测。
本发明方法制备的生物探针所用的发光底物液为1.2mM 3-(10′-吩噻嗪基)丙基-1-磺酸盐、0.6mM 4-马琳吡啶、0.4mM鲁米诺、0.4mM H2O2以及50mM pH 8.5的Tris-HCL缓冲液组成的混合溶液。
本发明的有益效果：
1、本发明使用大豆过氧化物酶代替现有技术中的HRP作为标记酶制备生物探针，一方面此酶的热稳定性比HRP高，发光信号比HRP强，可以持续较长时间的强化学发光，检测灵敏度能够获得大大提高。其次，本发明制备的五种生物探针，可用于多项蛋白的检测，同时由于大豆过氧化物酶原料来源广，价格低廉，其产业化研究具有广泛的应用前景和重要的意义。
2、本发明控制高碘酸钠氧化的最佳浓度为4–8mmoL，制得的生物探针仅有5％左右的醛化酶(SBP—CHO)发生自身交联，其结合率可以达到95％，酶活性可保留80–90％,制得的生物探针与传统的辣根过氧化物酶标记的生物探针相比较，具有更强的化学发光信号和更长的发光时间。
附图说明
图1是本发明方法反应流程示意图。
图2是实施例2中HRP与SBP两种生物探针发光稳定性的比较。
图3是实施例3中发光底物液中不加入和加入增强剂发光信号强度的比较。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
以下实施例涉及的PBS为10mM pH 7.4，1v/v％乙二醇水溶液为含有二次水配制的1v/v％乙二醇水溶液；使用的大豆过氧化物酶购自美国Bio-Research Products公司；AFP抗体、InhibinA抗体、β-HCG抗体、uE3抗体购自英国Abcam公司，链酶亲和素购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
实施例1采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针
一种采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针，反应流程如图1所示，包括如下步骤：
1、取5mg大豆过氧化物酶溶于500μL PBS中，加入新配制的12mg/mL NaIO4溶液500μL，混匀，置室温避光反应15min；后加入500μL，1v/v％乙二醇室温反应30min；
2、将步骤1得到的溶液平均分为五等份，每份中依次加入813μL、1mg/mL AFP抗体，188uL、1mg/mL InhibinA抗体，200uL、1mg/mLβ-HCG抗体，100μL、1mg/mLuE3抗体和100uL、5mg/mL链酶亲和素混匀，装入透析袋，于50mM pH 9.6碳酸盐缓冲液4℃透析24h，使大豆过氧化物酶和蛋白结合；向五种溶液中依次加入5mg/mLNaBH4溶液100μL，混匀，置4℃还原反应2h；
3、步骤2得到的五种溶液中分别加入和溶液等体积的饱和硫酸铵溶液，轻摇盐析0.5h，10000rpm离心15min，去上清，沉淀以少许PBS溶解，装入透析袋，于大量PBS中4℃透析过夜，重复本步骤中盐析至透析步骤两次；次日取出离心，除去不溶物，上层清液为大豆过氧化物酶-蛋白结合物，每种溶液中分别加PBS 500μL复溶；效价测定合格后，加入等量甘油，分装小瓶，低温保存。
实施例2比较HRP与SBP两种生物探针的发光稳定性
取实施例1制备的SBP标记链酶亲和素的生物探针与商品化的HRP生物探针(HRP生物探针购自上海碧云天生物技术有限公司，型号为A0303)，均分别用PH 7.4的磷酸盐缓冲溶液稀释2500倍、3000倍、5000倍后加至白色96孔板，每孔加入100μL,然后在96孔板内同时加入发光底物液(1.2mM 3-(10′-吩噻嗪基)丙基-1-磺酸盐、0.6mM4-马琳吡啶、0.4mM鲁米诺和0.4mM H2O2以及50mM pH 8.5的Tris-HCl缓冲液组成的混合溶液)，单孔加入100μL，设置CCD曝光时间为1min，利用CCD成像立即采集化学发光信号。比较HRP与SBP两种酶发光信号的强度与信号的稳定性，如图2所示(a为稀释2500倍，b为稀释3000倍，c为稀释5000倍)，加入化学发光底物后立刻发生化学发光反应，如图2-A，对于HRP反应迅速发生，并在第3min达到最大值，而后光强度迅速下降；如图2-B，对于SBP发光强度在第7min达到最大，光强下降速度比较缓慢，且化学发光反应发生10min后，化学发光强度可以保持在最大值的93.5％，说明SBP的化学发光信号持续时间更长，信号更稳定。
实施例3测定制得的生物探针在配制的发光底物液中的信号强度
取实施例1制备的SBP标记β-HCG抗体的生物探针稀释5000倍后，加至白色96孔板，每孔加入100μL,然后在96孔板内同时加入发光底物液。如图3所示(无酶表示不含增强剂SPTZ和MORPH的发光底物液；增强剂表示含增强剂SPTZ和MORPH的发光底物液；酶表示SBP标记β-HCG抗体的生物探针+不含增强剂SPTZ和MORPH的发光底物液；酶+增强剂表示SBP标记β-HCG抗体的生物探针+含增强剂SPTZ和MORPH的发光底物液)，底物液中同时加入增强剂SPTZ和MORPH时，可使得发光体系的发光强度增强近百倍，检测灵敏度大大提高。可以有效克服辣根过氧化物酶标记获得的发光信号弱，即使加入了增强剂对碘苯酚(PIP)，化学发光信号能够放大，但是衰减迅速的缺点。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (5)

1.一种采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、利用氧化剂氧化大豆过氧化物酶中的糖苷键；
步骤二、将蛋白与步骤一得到的大豆过氧化物酶反应形成希夫氏碱，形成稳定的酶-蛋白分子；
步骤三、提纯步骤二得到的酶-蛋白分子，得到所述生物探针。
2.根据权利要求1所述的采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，其特征在于，步骤一所述氧化剂包括高碘酸钠，所述高碘酸钠在反应溶液中的浓度为4–8mmoL。
3.根据权利要求1所述的采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，其特征在于，步骤二所述蛋白为甲胎蛋白抗体、人绒毛膜促性腺激素β亚基抗体、游离雌三醇抗体、抑制素A抗体和链酶亲和素。
4.根据权利要求1所述的采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、取5mg大豆过氧化物酶溶于500μL PBS中，加入12mg/mL NaIO4溶液500μL，混匀，置室温避光反应15min；后加入500μL，0.1–5v/v％乙二醇室温反应30min；
步骤二、将步骤一得到的溶液均分为五份，依次加入813μL、1mg/mL甲胎蛋白抗体，188μL、1mg/mL抑制素A抗体，200μL、1mg/mL人绒毛膜促性腺激素β亚基抗体，100μL、1mg/mL游离雌三醇抗体和100uL、5mg/mL链酶亲和素混匀，装入透析袋，于50mM pH 9.6碳酸盐缓冲液4℃透析24h，使大豆过氧化物酶和蛋白结合；向五种溶液中依次加入5mg/mL NaBH4溶液100μL，混匀，置4℃还原反应2h；
步骤三、步骤二得到的五种溶液中分别加入和溶液等体积的饱和硫酸铵溶液，盐析0.5h，10000rpm离心15min，去上清，沉淀以PBS溶解，装入透析袋，于PBS中4℃透析过夜，重复本步骤中盐析至透析步骤两次；次日取出离心，除去不溶物，上层清液为大豆过氧化物酶-蛋白结合物，每种溶液中分别加入PBS 500μL复溶；效价测定合格后，加入等量甘油，分装小瓶保存。
5.权利要求1-4任一权利要求所述的采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，其特征在于，制备的生物探针所用的发光底物液为1.2mM 3-(10′-吩噻嗪基)丙基-1-磺酸盐、0.6mM 4-马琳吡啶、0.4mM鲁米诺、0.4mM H2O2以及50mMpH 8.5的Tris-HCL缓冲液组成的混合溶液。
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