CN104597245B - 一种可视化微区多色显影塑料基生物芯片的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物芯片领域，具体地涉及一种利用表面微区选择性催化沉积技术制备可视化多色显影塑料基生物芯片的方法。所述方法包括步骤：1)塑料基片表面活化处理；2)探针分子的选区固定；3)基片的首次封闭；4)靶标物的分区捕获；5)信号触发单元―催化剂的选区引入；6)基片二次封闭；7)芯片表面的微区选择性多色显影处理。本发明的优越性在于由此所制备的多色显影生物芯片具备低成本、易操作、易携带、高通量以及易分析等优点，是实施现场快速检测与分析的理想工具。

Description

一种可视化微区多色显影塑料基生物芯片的制备方法
技术领域
本发明涉及生物芯片领域，具体地涉及一种制备可视化微区多色显影塑料基生物芯片的方法。
背景技术
生物芯片(Biochips)是一种功能强大的微型生化分析系统，它以集成了探针分子阵列的固体基片为核心元件,采用光学或电学手段实现对DNA、蛋白质以及其它靶标物的准确、快速、高通量检测；在临床诊断、生物医学、食品工业、环境监测等领域有着广泛的应用价值。生物芯片的定性和定量分析通常是建立在荧光表征技术的基础之上,即需要对靶标物进行荧光标记,并需采用专业的激光共聚焦扫描仪来获取目标信号。因此，常规生物芯片的制造和检测成本高昂，严重限制了它的广泛应用。
近年来发展起来了一种新型生物芯片―可视化芯片技术，该型芯片利用酶或纳米粒子催化沉积等显色反应来“显影放大”探针与靶标物间的特异作用，进而可利用照相机、扫描仪甚至肉眼来观测和定量芯片实验结果。该型芯片既不需要标记靶标物，又不需要使用昂贵的激光共聚焦扫描仪，完全克服了常规生物芯片在制造和应用方面的局限；此外，该型芯片操作简单、使用方便,可“原位现场”实施检测与分析,具有广阔的应用前景。目前，这种可视化芯片主要采用单显色技术，即经显色反应后芯片上所有信号只呈现一种颜色。因此，当需要对多个靶标物进行检测时，这种单显色技术会带来一系列问题；例如所有靶标物信号将只呈现一种颜色，易引起混淆；尤其不利的是由于不同靶标物(样品)显色动力学不同，经常出现一些靶标物尚未显色而另一些靶标物已达到显色饱和。显然，采用多色显影技术可以很好地解决上述难题，是可视化芯片未来的发展方向。
目前不同色彩的单显色技术在生物体组织染色、免疫印迹、酶联免疫等实验中都已采用；但同时将不同色彩的显色技术应用于同一块基片上，特别是同时作用于一个微小(平方毫米甚至亚平方毫米)的区域，实现微区多色彩催化显影具有极大的挑战性。这一挑战性首先源于不同色彩的催化显色反应间常存在较强的相互干扰，在一个微小区域进行分区染色必然会导致不同亚区域间显色的互相污染(即“窜色”)。其次,如何在一个几平方毫米(甚至亚平方毫米)的微小区域实现分区可控染色,在实验技术上也存在较大挑战。这是因为利用现有常规技术很难在一个微小区域既能方便地实现靶标物全区域输送又能方便地实现显色催化剂分区/分段定位可控输送；特别是要能够保证在一个微通道进行分段输送的多个催化剂不能发生相互污染。再次，在进行分区催化显色操作时，必须要确保各个亚区所采用的显影、封闭以及清洗条件不会对其它亚区的显色造成干扰。
因此，只有巧妙地设计样品及试剂的输运方案,合理选取专一高效的多色显色系统(酶/纳米粒子与底物)，通过反复尝试建立各亚区优化的封闭、清洗及显色工艺，才有可能实现可视化生物芯片的微区选择性多色彩催化显影。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种制备可视化微区多色显影塑料基生物芯片的方法。
根据本发明的制备可视化微区多色显影塑料基生物芯片的方法包括以下步骤：
1)塑料基片表面活化处理：将塑料基片放入紫外臭氧或氧等离子体系统中辐射，使其表面产生高密度活性基团，然后浸入活化溶液中活化处理，冲洗基片表面，并用将基片吹干待用；
2)探针分子的分区固定：利用内嵌多条微通道的PDMS模板或通过喷墨打印方式将含有不同探针分子的缓冲溶液定位引入到芯片表面的不同区域从而形成多个不同的“识别区”，然后温育，从而将探针分子固定在芯片表面形成分区阵列，再用清洗溶液冲洗基片表面；
3)基片的首次封闭：掀掉PDMS模板，根据探针分子和靶标物或信号分子的类型，将基片表面浸入封闭型溶液，并温育，钝化和封闭基片表面以避免靶标物在基片表面的非特异性吸附，然后用去离子水冲洗基片表面，并将基片吹干待用；
4)目标分子的分区捕获：利用特殊设计、既可全通道又可分段输送样品的PDMS模板(该模板一面内嵌多条数百微米宽、数厘米长的微通道，另一面沿通道间隔分布数个惯穿孔道作为液体进出模板的通道；具体尺寸参数见附图2)将含有多种靶标分子的样品溶液同时引入到基片表面固定有不同探针分子的“识别区”，其引入方向垂直于探针分子阵列以形成交叉的点阵型反应区域，然后将基片温育，使靶标分子或信号分子与探针分子充分结合，再用同样的缓冲溶液冲洗基片；
5)信号触发单元―催化剂的引入：继续利用上述特殊设计的既可全通道又可分段输送样品的PDMS模板把不同信号触发单元―催化剂定向、分段、可控地引入到芯片表面指定的反应区域，并充分结合，然后再定向清洗相应的通道，去掉PDMS模板，最后用缓冲液彻底冲洗整个基片；
6)基片二次封闭：在芯片显影处理之前，根据不同显影反应的特点，将其浸入或分区域滴加封闭型溶液，然后用清洗型溶液和去离子水彻底冲洗芯片，最后将芯片吹干待用；
7)芯片分区多色显影处理：根据靶标物数量以及“识别区”在芯片表面的分布，通过将芯片交替浸入几种不同显影液或将不同显影液滴加到基片表面各个识别区，选择并搭配合适的显色系统以实现选区多色彩催化显影。
根据本发明的具体实施方式，制备可视化微区多色显影塑料基生物芯片的方法，包括以下步骤：
1)塑料基片表面活化处理：将塑料基片放入紫外臭氧或氧等离子体系统中辐射10～30分钟，使其表面产生高密度羧基活性基团，根据需要可将羧基进一步转化成不同的活性基团(例如硫醇、醛基、氨基等)；然后将表面带有羧基的塑料基片浸入特定活化溶液中(例如EDC浓度为0.02～0.1g/mL、NHS浓度为0.0025～0.01g/mL、pH＝6.0～7.0的100mM磷酸盐PBS或吗啉乙磺酸MES缓冲溶液)活化处理1～5小时，后用清洗溶液(例如20mMTris缓冲溶液)冲洗基片表面，并用将基片吹干待用。
2)探针分子的分区固定：利用内嵌多条微通道的PDMS模板(可分条进行全通道输运)或通过喷墨打印方式将含有不同探针分子的缓冲溶液定位引入到芯片表面的不同区域从而形成多个不同的“识别区”，然后将基片转移到湿盒中温育4～6小时，通过多种共价键合方式将探针分子固定在芯片表面形成分区阵列；然后用特定的清洗溶液(例如20mMTris或PBS缓冲溶液)冲洗基片表面。固定不同探针分子需使用不同的缓冲溶液，例如固定检测铅离子的DNA探针链缓冲液为20mMTris+10～100mMMgCl2，PH＝7.4，固定检测汞离子的DNA探针链缓冲液为20mMPBS+50～250mMNaCl+10～100mMMgCl2，PH＝7.4；固定检测毒品吗啡、安他非命和可卡因的探针分子缓冲液为20mMPBS+50～250mMNaCl，PH＝7.4)需要说明的是，如果芯片是采用的非夹心式或非竞争式的检测方式，探针分子应保留信号链接基团(例如生物素、链霉素等)
3)基片的首次封闭：掀掉PDMS模板，根据探针和靶标物类型，将基片表面浸入特定的封闭型溶液(例如针对DNA类系统可使用10～20mMTris/PBS+0～200mMNaCl+1～6％BSA，pH＝7.4；针对抗体/抗原类系统则使用10～20mMTris/PBS+0～200mMNaCl+1～5％BSA(IgG-free)+1～8％糖原，pH＝7.4)并在湿盒中保持0.5～1.0小时，来钝化和封闭基片表面以避免靶标物在基片表面的非特异性吸附。然后用去离子水冲洗基片表面，并将基片吹干待用。需要特别指出的是，当样品中包含多种不同类型靶标物时，由于样品溶液要穿越基片表面各个测试区，此时宜采用混合型封闭溶液进行封闭(例如采用10～20mMTris/PBS缓冲溶+0～5％BSA+0～5％糖原，pH＝7.4)，并需针对具体体系优化封闭液配方。
4)目标分子的分区捕获：利用特殊设计、既可全通道又可分段输送样品的PDMS模板(见图2)将含有多种目标分子的样品溶液同时引入到基片表面固定有不同探针分子的“识别区”(通常其引入方向垂直于探针阵列以形成交叉的点阵型反应区域)，然后将基片转移到湿盒中温育/保持0.3～1.0小时，使靶标分子(或信号分子)与探针分子充分结合，再用同样的缓冲溶液冲洗基片。需要说明的是，如果芯片采用的是竞争式的检测方式，则这步将是靶标分子和信号分子与探针分子的竞争结合。
5)信号触发单元―催化剂的分区引入：继续利用上述特殊设计的PDMS模板(见图2)把不同信号触发单元―催化剂(例如链霉素-金纳米粒子复合物，各种链霉素-酶复合物)定向、分段、可控地引入到芯片表面指定的反应区域，并在湿盒中温育/保持0.5～1.0小时使其充分结合，然后再定向清洗相应的通道，去掉PDMS模板，最后用缓冲液彻底冲洗整个基片。需要说明的是，若芯片是采用的夹心式的检测方式，则在这步之前还应引入相应的信号连接分子(例如生物素修饰的DNA或二抗)。
6)基片二次封闭：在芯片显影处理之前，根据不同显影反应的特点，需将其浸入或分区域滴加上特定的封闭型溶液(例如对银染色区选择：10～20mMTris+1.0～5.0％BSA+0.01％～0.1％吐温20，pH＝7.4；对TMB染色区选择：10～20mMTris/PBS+3％～8％脱脂奶粉+0.01％～0.1％吐温20，pH＝7.4；对碱性磷酸酶催化BCIP/NBT染色区选择：10～20mMTris+2～9％BSA+0.1％～0.3％明胶+0.01％～0.1％吐温20，pH＝7.4)处理0.5～0.1小时，然后用清洗型溶液(例如10mMTris，pH＝7.4)和去离子水彻底冲洗芯片；最后将芯片吹干待用。需要特别指出的是，如果芯片下一步将采用浸入式的多染色工艺，此时宜采用混合型封闭溶液将整个芯片浸入其中进行封处理(例如，对银染+TMB染色+BCIP/NBT多染色工艺，宜采用10～20mMTris+0～5％BSA+0～5％脱脂奶粉+0.01％～0.1％吐温20，作为芯片的二次封闭液)，并需针对具体体系优化封闭配方。
7)芯片选区多色显影处理：根据靶标物数量以及“识别区”在芯片表面的分布，来选择/搭配数组合适的显色系统以实现选区多色彩催化显影。具体而言，将芯片交替浸入几种不同显影液(可溶性银盐/金盐与还原剂组成的混合液，或各种沉淀型底物混合液)或将不同显影液滴加到基片表面各个识别区。若是将芯片交替浸入几种不同显影液，需特别选择显色顺序(稳定和显影速度慢的显色反应优先)，并且在每次更换显影液前均需用相应缓冲液小心冲洗基片。然后将芯片避光显影处理，每5～10分钟更换一次显影液直至在基片表面出现明显信号点。显影结束后，在芯片表面的形成多个不同颜色的微小显色响应区域(平方毫米至平方厘米量级)；每个显色区域对应于一种靶标物，区域内均匀地分布多个微米尺度的信号点。因此可根据信号点的颜色及其色泽深浅来判断靶标物的种类及含量。
根据本发明的具体实施方式，制备了一种可视化微区多色显影塑料基生物芯片，所述芯片包括：
1)经活化处理的透明塑料基片(PC，PMMA，PET等)；
2)固定在上述基片上呈阵列分布的多种不同类型的探针分子，不同探针分子被固定在同一基片的不同区域；所述探针分子可以是修饰了信号触发/报道基团的发夹式DNA，也可以是无信号修饰的直链DNA或抗体分子。
当该型芯片与含有多种靶标物(target)的液体样品接触时，固定在不同区域的探针分子会捕获相应的靶标物从而形成probe-target结合物。这种结合物的形成，可通过诱导探针构型转变进而暴露出其隐藏的信号触发/报道基团的方式来产生响应信号，也可通过进一步形成probe-target-reporter夹心式传感机构的方式产生响应信号，还可通过竞争反应减少探针与标记抗原分子结合机会的方式来反映信号的响应。
根据本发明的制备可视化多色显影塑料基生物芯片的方法，需要针对靶标物的类型选择合适的显色系统(包括催化剂、显色底物以及封闭液)和相应的显色工艺，以保证每一种靶标物所引入的催化剂(贵金属纳米粒子或酶)只能高选择性地催化选定的一种显色溶液。通过催化剂和显色底物间的高特异性来保证显色的专一性和高效性；并辅以优化的显色和封闭工艺来进一步阻止相邻区域间的显色干扰；最终在芯片表面实现选区多色彩催化显影(见图1)。
根据本发明的制备方法获得的可视化多色显影塑料基生物芯片，对该类生物芯片的定性分析可通过目测完成，即目测信号的颜色及颜色深浅：不同颜色对应不同靶标物，颜色越深则对应的靶标物的浓度越高(或反之)。对该类生物芯片进行定量分析，需首先建立各种靶标物的标准信号响应曲线，即首先将一系列靶标物浓度已知的芯片通过照相或扫描方式，统一处理成彩色数字图像，再利用图像处理软件获得不同颜色信号的平均亮度信息，从而建立该种靶标物的标准信号响应曲线；然后采用同样方式获得未知样品的数字图像；从中抽取各种信号的颜色及亮度信息，然后根据各种颜色对应的标准信号响应曲线，获得未知样品中不同靶标物的浓度信息。
制备可视化微区多色显影塑料基生物芯片的关键之处在于：首先，合理选取专一高效的多色显色系统(酶/纳米粒子与底物)以保证每一种酶高选择性地催化一种底物,避免不同酶和不同底物间的干扰(例如做选区双色显影时，可以采用纳米金催化银染和HRP催化TMB染色，这两种染色反应没有相互干扰)；其次，巧妙地实现催化剂的可控选区负载/输运，为此需要借助特殊设计的PDMS模板(例如图2所示)，在该模板的每一个通道内，可以分段加入几种不同催化剂，每段之间有空气阻隔，避免不同段内之间催化剂间污染；再次，针对不同催化显色体系，需要使用最佳的封闭和清洗工艺(不同显色体系，需要无数次尝试才能找到最优化的封闭工艺)；此外，还需根据不同显色反应的特点，选择合适显色顺序，从而实现选区多色彩催化显影所特殊采取的措施。
本发明提供一种制备可视化多色显影塑料基生物芯片的方法。本发明的优越性在于由此所制备的生物芯片具备低成本、易操作、易携带、高通量以及易分析等优点，是实施现场快速检测与分析的理想工具。
附图说明
图1为可视化微区多色显影塑料基生物芯片实验设计与检测原理；
图2为能同时实施全通道和部分通道(分段)输送样品的PDMS模板；
图3为互相干扰小的多色催化显色系统的筛选实例；
图4为高效封闭条件的选择和应用实例；
图5为同时检测Pb2+和Hg2+离子的灰-蓝双染色可视化塑料基DNA生物芯片的实验原理图；
图6为同时检测Pb2+和Hg2+离子的双染色可视化塑料基DNA生物芯片的彩色扫，描图片及分析结果，其中(a)为彩色图像，(b)为响应情况柱状图；
图7为同时检测HumanIgG和DNA的灰-红双染色可视化塑料基DNA生物芯片的实验原理图；
图8为同时检测HumanIgG和DNA的双染色可视化塑料基DNA生物芯片的彩色扫描图片；
图9为同时检测三种毒品分子吗啡(MOR)、安非他命(AMP)和可卡因(COC)的多染色可视化微区塑料基生物芯片的实验原理图；
图10为同时检测三种毒品分子吗啡(MOR)、安非他命(AMP)和可卡因(COC)的多染色可视化微区塑料基生物芯片的彩色扫描图片和分析结果，其中(a)为彩色图像，(b)为响应情况柱状图。
具体实施方式
实施例1.筛选互相干扰小的多色催化显色系统
为了保证选定的不同染色系统间不会发生显著地交叉反应(即“窜色”)，进行搭配的这几组染色系统最好从不同类型的染色体系中筛选；尽管如此，由于沉淀型染色系统的复杂性再加上多染色芯片对显色反应的色差要求，只有通过系统地实验筛选，才有可能找到相互间干扰较小的多染色系统。在这里，我们将HumanIgG固定在基片上，以生物素修饰的anti-humanIgG为信号引发基团，然后通过biotin–streptavidin特异相互作用分别在芯片不同区域引入不同的显色系统(例如金纳米催化的银染和金染反应，辣根过氧化物酶催化的TMB和DAB染色反应，碱性磷酸酶催化BCIP/NBT染色反应等)来考察它们之间是否存在显著的交叉反应以及色彩差异。如图3所示，当在芯片不同位置通过微流体技术形成金纳米粒子催化区、辣根过氧化物酶催化区和碱性磷酸酶催化区，在正常的封闭处理之后，如果采用金染色处理芯片，则会发现整个区域都出现了较强的背景，说明金染色液不仅对金纳米催化区有响应，而且对其它催化区也有背景响应。而当使用银染液、TMB染色液以及BCIP/NBT染色液分别处理整个芯片时(如图3所示)，只有对应的催化区出现特征显色(即银染在纳米金标记区显灰色、TMB染在辣根过氧化物酶标记区出现蓝色、BCIP/NBT染在碱性磷酸酶标记区呈现红色)，而其它区域没有出现明显的背景响应，说明这三对“催化剂―染色液”间催化显色专一性强，相互无明显交叉干扰。
实施例2.高效封闭条件的选择与应用
当需要将不同的显影液滴加到芯片不同区域进行分区染色时，宜采用相应的二次封闭液处理各自的区域，以取得较好的整体显色效果。如图4所示，对芯片进行分区银染和TMB双染色处理时，如果整个芯片都采用针对银染的二次封闭液(例如10mMTris+1.0～5.0％BSA+0.01％～0.1％吐温20，pH＝7.4)时，则银染区显色干净，背景低；而TMB染色区背景很高，出现明显的“拖尾”现象(如图4(a)所示)。而当将TMB染色区封闭液改为针对TMB的二次封闭液(例如10mMTris+3％～8％脱脂奶粉+0.01％～0.1％吐温20，pH＝7.4)并保持银染区封闭液不变时；经双染色处理后，芯片的两个显色区，背景都比较低，显色的特异性高(如图4(b)所示)。需要特别指出的是，如果芯片采用浸入式的多染色工艺，此时宜采用混合型封闭溶液将整个芯片浸入其中进行封处理(例如，对银染+TMB双染色,宜采用10mMTris+0～5％BSA+0～5％脱脂奶粉+0.01％～0.1％吐温20，作为芯片的二次封闭液)。
实施例3、灰-蓝双色显影塑料基生物芯片的制备及其对金属离子Pb2+和Hg2+的同时检测
表1
DNA探针链 碱基序列
TBA 5’-NH2-(CH2)6-TAGCCAACAAGGTTGGTGTGGTTGGCAT-biotin-3’
T-T 5’-NH2-(CH2)6-CAAATGAACTTTGGTTTCCCTTTTCATTTT-biotin-3’
灰-蓝双色染可视化塑料基生物芯片(芯片结构示意图如图5所示)的制备及其对目标金属离子Pb2+和Hg2+同时检测的步骤如下：
1)将塑料基片浸入乙醇中超声清洗，吹干后放入紫外臭氧系统中辐射10～30分钟，使基片表面改性带上活性的羧基。
2)把PDMS模板贴紧塑料基片，通过真空泵的吸管把TBA探针链和T-T探针链(检测铅离子的DNA探针链用10mMTris-HCl缓冲盐(含50mMMg2+,pH＝7.4)溶液稀释，检测汞离子的DNA探针链用20mMPBS缓冲盐溶液(含100mMNaCl+50mMMg2+,pH＝7.4)稀释)分别加入PDMS模板左右两边的微通道中，然后在湿润的盒子里培养4.0～6.0小时，使DNA探针链固定在基片上。随后用10mMTris-HCl缓冲盐溶液沿PDMS通道抽洗基片以减小背景信号。
3)把PDMS模板掀掉，用特定的封闭型溶液(20mMTris+0～100mMNaCl+2～4％BSA，pH＝7.4)封闭约0.5～1.0小时。然后用缓冲液冲洗基片，并用N2将基片吹干待用。
4)将特殊设计的既可全通道又可分段输送样品的PDMS模板按垂直于第一块PDMS模板的方向贴在基片表面，将含Pb2+和Hg2+的溶液(用10mMTris-HCl缓冲溶液稀释)加入到通道内，使其与探针链充分反应0.5～1.0小时，然后用缓冲液抽洗基片。
5)在PDMS模板中分段引入信号触发单元―催化剂：在TBA探针链区的通道中加入链霉亲和素-金纳米粒子复合物，在富T探针链区的通道中加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶复合物，在湿盒中培育0.5～1.0小时，然后用缓冲液冲洗基片。
6)剥去PDMS模板，用去离子水冲洗基片，氮气吹干，用10mMTris+1～5％BSA+0.01％～0.1％吐温20的封闭溶液(pH＝7.4)封闭TBA探针链区约0.5～1.0小时，用20mMPBS+3～5％脱脂奶粉+0.01％～0.1％吐温20的封闭溶液(pH＝7.4)封闭富T探针链区0.5～1.0小时；然后用20mMTris溶液冲洗芯片；最后用二次去离子水彻底清洗芯片，并将其吹干待用。
7)将TMB溶液滴加在组装富T探针链的芯片表面，将新鲜配制的银染色显影液滴加TBA探针链区；在暗处静置放置，每10分钟更换一次显影液直至在基片表面出现明显的信号点或信号线。TMB区和银染色区最好利用“阱状”PDMS模板分隔，TMB通常在4～8分钟完成显影，而银染通常在15～20分钟完成显影。
8)将显影处理后的生物芯片放置到透扫型扫描仪的扫描平台上(例如中晶ScanMaker5900或i700)，利用随机带的专用软件获得DNA对目标离子特异性识别的彩色数字图像(图6是可视化双色显影塑料基生物芯片对混合目标金属离子Pb2+和Hg2+的识别图像)；根据图像中信号点的颜色及颜色深浅，即可对目标离子Pb2+和Hg2+进行定性和定量分析。
实施例4.灰-红双色显影塑料基生物芯片的制备及其对DNA和HumanIgG的同时检测
灰-红双色染可视化塑料基生物芯片(芯片结构示意图如图7所示)的制备及其对目标DNA和HumanIgG同时检测的步骤如下：
1)塑料基片表面活化步骤同实施例3中的步骤1)和步骤2)。
2)在基片表面组装PDMS模板，经通道在基片的不同区域分别加10μMDNA探针链(5'-Biotin-GCGAGGTAAAACGACGGCCAGTCCTCGC-(CH2)6-NH2-3')和100μg/mLanti-humanIgG抗体探针，在湿润的盒子里培育4～8小时，使探针分子充分固定在基片上。
3)撤去PDMS模板后，封闭冲洗芯片同实施例3中的步骤3)，需要强调的是抗体探针区使用的BSA为IgG-free级。
4)不同靶标物引入步骤同实施例3中的步骤4)，此时靶标分子为DNA和humanIgG。
5)仅在抗体探针区域引入20～50μg/mL生物素标记的二抗溶液(所用溶液为20mMphosphate+150mMNaCl，pH＝7.4；DNA探针区不必引入此二抗溶液)，并将基片转移到湿盒中温育0.5～1小时，然后用20mM磷酸盐缓冲溶液彻底冲洗基片。
6)利用PDMS模板中分段引入信号触发单元―催化剂：在DNA探针区的通道中加入链霉亲和素-金纳米粒子复合物，而在抗体探针区的通道中加入链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物，在湿盒中培育0.5～1.0小时，然后用缓冲液冲洗基片。
7)剥去PDMS模板，用去离子水冲洗基片，氮气吹干，用10mMTris+1～5％BSA+0.01％～0.1％吐温20的封闭溶液(pH＝7.4)封闭DNA探针区；用10mMTris+2～6％BSA+0.1～0.3％明胶+0.01％～0.1％吐温20的封闭溶液(pH＝7.4)封闭抗体探针区约0.5～1.0小时；然后用20mMTris溶液冲洗芯片；最后用二次去离子水彻底清洗芯片，并将其吹干待用。
8)将新鲜配制的银染色显影液滴加到DNA探针区；将BCIP/NBT染色液滴加到抗体探针区，在暗处静置放置，每6～10分钟更换一次显影液直至在基片表面出现明显的信号点或信号线(如图8所示)。银染色区和BCIP/NBT区最好利用“阱状”PDMS模板分隔，BCIP/NBT通常在10～20分钟完成显影，而银染通常在15～20分钟完成显影。
7)扫描分析多色染塑料基生物芯片同实施例3中的步骤8)
实施例5、灰-红-蓝三色显影塑料基生物芯片的制备及其对毒品吗啡、安非他命和可卡因的同时检测
三色显影可视化塑料基生物芯片(芯片结构示意图如图9所示)的制备及其对吗啡、安非他命和可卡因同时检测的步骤如下：
1)塑料基片表面活化步骤同实施例3中的步骤1)和步骤2)。
2)在基片表面组装PDMS模板，经通道在基片的不同区域分别加入牛血清白蛋白包被的吗啡(BSA-MOR)、牛血清白蛋白包被安非他命(BSA-AMP)、牛血清白蛋白包被可卡因(BSA-COC)，然后在湿润的盒子里培养4.0～6.0小时，使三种探针分子分别固定在基片不同区域。随后用10mMTris-HCl缓冲盐溶液沿PDMS通道抽洗基片。
3)掀掉PDMS模板，用特定封闭型溶液(20mMTris+150mMNaCl+1～5％BSA(IgG-free)+1～8％糖原，pH＝7.4)封闭0.5～1.0小时
4)将特殊设计、既可全通道又可分段输送样品的PDMS模板(如图2所示)按垂直于第一块PDMS模板的方向贴在基片表面，将含生物素标记的吗啡抗体、安非他命抗体、可卡因抗体以及它们的标准品混合溶液通过全通道(完整通道)输运到塑料基片表面所有识别区，并将芯片转移到湿盒子培育20分钟，再用上述封闭型溶液冲洗基片。
5)在上述PDMS模板(如图2所示)中分段引入不同信号触发单元―催化剂：将链酶亲和素-金纳米粒子、链霉亲和素-碱性磷酸酶、链霉亲和素-辣根过氧化物酶复合体溶液通过部分通道分别输运到相应的三个识别区(即MOR、AMP和COC各自的识别区)，在湿盒中室温培育0.5-1.0小时，然后用缓冲液抽洗各自通道。
6)剥去PDMS模板，用去离子水冲洗基片，氮气吹干，用不同配方缓冲液分别封闭相应的识别区，即用10mMTris+1～5％BSA+0.01％～0.1％土温20，10mMTris+2～5％BSA+0.1～0.3％明胶+0.01％～0.1％土温20，10mMTris+3～5％脱脂奶粉+0.01％～0.1％土温20封闭溶液(pH＝7.4)分别封闭MOR、AMP和COC识别区0.5～1.0小时。
7)利用“阱状”PDMS模板将新鲜配制的银染色显影液、碱性磷酸酶底物BCIP/NBT显影液和辣根过氧化物酶底物TMB显影液分别滴加到芯片表面吗啡、安非他命和可卡因的识别区；根据各自催化显影速度选择合适的显影时间，最终在芯片表面实现选区三色显影。
8)扫描分析多色染塑料基生物芯片同实施例3中的步骤8)。

Claims (7)

1.制备可视化微区多色显影塑料基生物芯片的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)塑料基片表面活化处理：将塑料基片放入紫外臭氧或氧等离子体系统中辐射，使其表面产生高密度活性基团，然后浸入活化溶液中活化处理，冲洗基片表面，并将基片吹干待用；
2)探针分子的分区固定：利用内嵌多条微通道的PDMS模板或通过喷墨打印方式将含有不同探针分子的缓冲溶液定位引入到基片表面的不同区域从而形成多个不同的“识别区”，然后温育，从而将探针分子固定在基片表面形成分区阵列，再用清洗溶液冲洗基片表面；
3)基片的首次封闭：根据探针分子和靶标物或信号分子的类型，将基片表面浸入封闭型溶液，并温育，钝化和封闭基片表面以避免靶标物或信号分子在基片表面的非特异性吸附，然后用缓冲液冲洗基片表面，并将基片吹干待用；
4)靶标物的分区捕获：利用PDMS模板将含有多种目标分子的样品溶液同时引入到基片表面固定有不同探针分子的“识别区”，所述PDMS模板的一面内嵌多条微通道，另一面沿通道间隔分布数个惯穿孔道作为液体进出模板的通道，既可全通道又可分段输送样品，
其引入方向垂直于探针分子阵列以形成交叉的点阵型反应区域，然后将基片温育，使靶标分子或信号分子与探针分子充分结合，再用同样的缓冲溶液冲洗基片；5)信号触发单元―催化剂的分区引入：继续利用上述特殊设计的PDMS模板把不同信号触发单元―催化剂定向、分段、可控地引入到基片表面指定的反应区域，并充分结合，然后再定向清洗相应的通道，去掉PDMS模板，最后用缓冲液彻底冲洗整个基片；
6)基片二次封闭：在基片显影处理之前，根据不同显影反应的特点，将其浸入或分区域滴加封闭型溶液，然后用清洗型溶液和去离子水彻底冲洗基片，最后将基片吹干待用；
7)基片分区多色显影处理：根据靶标物或信号分子的数量以及“识别区”在基片表面的分布，通过将基片交替浸入几种不同显影液或将不同显影液滴加到基片表面各个识别区，选择并搭配合适的显色系统以实现微区选区多色催化显影。
2.根据权利要求1所述的制备可视化微区多色显影塑料基生物芯片的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述活化溶液为：EDC浓度为0.02～0.1g/mL、NHS浓度为0.0025～0.01g/mL、pH＝6.0～7.0的100mM磷酸盐PBS或吗啉乙磺酸MES缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述的制备可视化微区多色显影塑料基生物芯片的方法，其特征在于，在步骤2)中，采用20mMTris+10～100mMMgCl2,pH＝7.4缓冲液固定含有富G片段的DNA探针链，采用20mMTris+50～250mMNaCl+10～100mMMgCl2pH＝7.4缓冲液固定普通DNA探针链，采用20mMPBS+50～250mMNaClpH＝7.4缓冲液固定抗体类探针。
4.根据权利要求1所述的制备可视化微区多色显影塑料基生物芯片的方法，其特征在于，在步骤3)中，针对DNA类系统，封闭型溶液为10～20mMTris/PBS+0～200mMNaCl+1～6％BSA，pH＝7.4；针对抗体/抗原类系，封闭溶液为：10～20mMTris/PBS+0～200mMNaCl+1～5％BSA+1～8％糖原，pH＝7.4。
5.根据权利要求1所述的制备可视化微区多色显影塑料基生物芯片的方法，其特征在于，在步骤3)中，当样品中包含多种不同类型靶标物时，采用混合型封闭溶液进行封闭，所述封闭溶液为：10～20mMTris/PBS缓冲溶+0～5％BSA+0～5％糖原，pH＝7.4。
6.根据权利要求1所述的制备可视化微区多色显影塑料基生物芯片的方法，其特征在于，在步骤6)中，当选择滴加式分区显影工艺时，对银染色区选择封闭型溶液：10～20mMTris+1.0～5.0％BSA+0.01％～0.1％吐温20，pH＝7.4；对TMB染色区选择封闭型溶液：10～20mMTris/PBS+3％～8％脱脂奶粉+0.01％～0.1％吐温20，pH＝7.4；对碱性磷酸酶催化BCIP/NBT染色区选择封闭型溶液：10～20mMTris+2～9％BSA+0.1％～0.3％明胶+0.01％～0.1％吐温20，pH＝7.4。
7.根据权利要求1所述的制备可视化微区多色显影塑料基生物芯片的方法，其特征在于，在步骤6)中，当选择浸入式显影工艺时，采用混合型封闭溶液进行二次封闭，所述混合型封闭溶液为：10～20mMTris+0～5％BSA+0～5％脱脂奶粉+0.01％～0.1％吐温20。
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