CN104597007A

CN104597007A - 基于核酸适体荧光探针HCy5的同型半胱氨酸试剂盒及其检测方法

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Publication number: CN104597007A
Application number: CN201410715903.8A
Authority: CN
Inventors: 陈燕婷; 张莘蔓; 李红梅
Original assignee: 陈燕婷; 张莘蔓; 李红梅
Current assignee: The international Fanmei Regenerative Medicine Technology Co. Ltd.
Priority date: 2014-11-30
Filing date: 2014-11-30
Publication date: 2015-05-06
Anticipated expiration: 2034-11-30
Also published as: CN104597007B

Abstract

本发明涉及一种基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸HCy试剂盒，同时本发明还涉及测定同型半胱氨酸HCy浓度的方法、测定试剂组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：红细胞裂解液、磷酸缓冲液PBS、同型半胱氨酸HCy标准品、同型半胱氨酸HCy核酸适体荧光探针；通过血样裂解、混合卵育处理，结合荧光分光光度计检测，从而测算出同型半胱氨酸HCy的浓度大小。本发明具有样品处理简单，操作简便，检测时间短，检测特异性强，灵敏度高，检测结果重复性高等优点。

Description

基于核酸适体荧光探针HCy5的同型半胱氨酸试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于医学检验测定技术领域，特别是涉及基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸HCy试剂盒及其检测方法。

背景技术

同型半胱氨酸为一种含硫氨基酸，是生物体内蛋氨酸代谢的中间产物，与半胱氨酸相比，侧链中多一个亚甲基。同型半胱氨酸是多种疾病的危险因子,目前认为同型半胱氨酸增高是动脉粥样硬化所致心脑血管疾病最广泛、最强独立的致病因素。同型半胱氨酸还与神经管畸形、帕金森病、老年性痴呆、慢性肾功能衰竭等多种疾病及某些药物、肿瘤的影响有关。检测同型半胱氨酸的方法主要色谱法、免疫学方法和循环酶法。

色谱法：气相色谱―质谱法测定同型半胱氨酸。该法可同时测定半胱氨酸、蛋氨酸、胱硫醚和甲基甘氨酸等多种物质。色谱法灵敏度高、特异性好，但样品处理、分离条件、色谱柱制备诸多变异，使其难以标准化。而且HPLC设备价格昂贵、技术条件要求高，需专门的维护人员，使其推广困难。

免疫学法：该法应用特异性的抗S-腺苷同型半胱氨酸单克隆技术，采用荧光偏振法或免疫法测定。同型半胱氨酸在S腺苷同型半胱氨酸水解酶和过量腺苷存在下，被转换成S腺苷同型半胱氨酸；预稀释的混合物、抗-S-腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体及标记的荧光S腺苷同型半胱氨酸示踪物一同孵育，仪器自动检测偏振光的改变，即可测出标本总同型半胱氨酸水平。抗体荧光分析法和比浊法不能直接检测同型半胱胺酸，需一小时以上才能出结果，操作步骤繁琐。

循环酶法；是利用酶底物特性，放大靶物质(被测物)的检测方法。血浆氧化型同型半胱氨酸经三乙羧乙基膦(TCEP)还原成游离型同型半胱氨酸，基于同型半胱氨酸甲基转移酶，S腺苷同型半胱氨酸水解酶构成的循环酶体系以及脱氢酶辅酶体系的原理，分解产物显色，用自动生化分析仪在600nm波长测OD值得出血浆中的同型半胱氨酸的含量。

目前没有能够直接识别同型半胱氨酸的抗体和其它分子探针。因此设计一种高度设别同型半胱氨酸的分子探针，并基于此建立简单快速和廉价的检测方法将提高对心脑血管等于同型半胱氨酸相关的疾病的的监控。

核酸适配体是近年发展起来的一类新型识别分，是指能够高特异性和高亲和力地域靶分子结的单链核苷酸分子。核酸适体可以通过配体指数富集系统进化技术(SystematicEvolution of Ligands by ExponentialEnrichment，SELEX)筛选获得。SELEX技术是指应用化学法合成大容量的随机寡核苷酸(由两端的固定序列和中间的随机序列组成)文库,通过施加选择压力(结合靶目标，淘选与靶目标高度特异结合片段的过程),并结合体外扩增技术,经过多轮的循环选择富集,获得与靶物质高度特异结合的寡核苷酸分子,可以是RNA也可以是DNA,长度一般为25～60个核苷酸。核酸适体主要通过发生适应性折叠，通过氢键、疏水堆积作用、范德华力与靶分子相互作用，与插入或包被的靶分子形成稳定的三维空间结构。核酸适体不与靶分子结合时，核酸适体处于比较松散的结构，5'和3'两端相互游离。与靶分子结合时，靶分子诱导核酸适体结构发生改变，核酸适体的5'端和3'端都将参与与靶分子特定区域(类似于与抗体结合的抗原位点)的相互作用，导致5'和3'两端相互靠近。这一特点使核酸适体适于分子信标探针设计。其中一种分子信标设计利用了荧光染料芘分子。当一个激发态芘分子和另一个基态芘分子近距离遭遇的时候能形成激发态二聚体，能在比芘单体波长更长的位置释放一个光子。芘激发态二聚体发射峰在480到500nm，而芘单体的发射峰在370到400nm之间。另外，芘分子荧光寿命比生物样品中的非特异激发荧光的寿命长，检测时可以在非特异激发荧光消失后，再来收集激发态二聚体的荧光信号，大大提高检测的特异性和灵敏度。识别同型半胱氨酸的核酸适体可以应用于同型半胱氨酸的临床检测，提高检测效率，降低检测成本。

核酸适体与靶物质结合所呈现的高敏感性和高特异性,使其在疾病诊断中具有良好的应用前景,尽管目前成熟的临床应用报道较少,但应用适体检测靶蛋白的研究却不断增多,基于适体的检测新技术也不断出现。核酸适体由于其独特的化学抗体特性成为新一代针对特定蛋白的分子药物或靶向载体，以及用于检测其特异性识别的靶分子物质。但是目前基于核酸适体的针对于同型半胱氨酸HCy诊断试剂还很缺乏，且针对于同型半胱氨酸HCy的核酸适体荧光探针检测试剂盒的开发尚未见有报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有的易产生操作技术误差、重复性欠佳、干扰因素很多、操作繁琐、测试成本高等不足，提供一种基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸HCy试剂盒及其检测方法。

本发明的方案是通过这样实现的：

一种基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒，其特征在于，主要成分包括：含NH₄Cl、Tris、EDTA-Na₂的红细胞裂解液；含MgCl₂的0.2M磷酸缓冲液；同型半胱氨酸标准品；同型半胱氨酸核酸适体荧光探针；所述同型半胱氨酸核酸适体荧光探针为5'和3'两端分别标记荧光芘分子单体的核苷酸单链，该核苷酸单链序列为：gggctaatgc attgccatta atgcctacctttgcctgggt ggtctaaccc。该序列命名为HCy5。

以上所述的一种基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒，所述含NH₄Cl、Tris、EDTA-Na₂的红细胞裂解液为含有1～280mmol/L NH₄Cl,1～34mmol/L Tris,1～2mmol/LEDTA-Na₂,pH 7.0～7.2；所述含MgCl₂的0.2M磷酸缓冲液为含有1～10mmol/L MgCl₂。

以上任一所述的一种基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒，其特征在于，所述含NH₄Cl、Tris、EDTA-Na₂的红细胞裂解液、含MgCl₂的0.2M磷酸缓冲液、同型半胱氨酸标准品、同型半胱氨酸核酸适体荧光探针为配制好直接使用的液体试剂或是使用前需加水溶解的干粉状态。

以上所述的一种基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于检测肝素抗凝全血或末梢血中的同型半胱氨酸浓度。

一种用以上任一所述基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒来检测同型半胱氨酸浓度的方法，其特征在于，方法步骤包括：

(1)血样裂解：将血样和含NH₄Cl、Tris、EDTA-Na₂的红细胞裂解液按1:0.5～5体积比混匀，静置5～30min，再中速离心5～10min，收集上清液；

(2)混合卵育：混合卵育：取20～100μl步骤1)得到的上清液和30～50ul的用含MgCl₂的0.2M磷酸缓冲液，溶解同型半胱氨酸核酸适体荧光探针得到的同型半胱氨酸核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育5～15min，使同型半胱氨酸核酸适体荧光探针与血样充分结合，得到测试液；

(3)荧光检测：荧光检测仪检测步骤2)得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480～500nm的荧光值；

(4)结果计算：使用生物医学作图软件，参照同型半胱氨酸标准样品制作的标准曲线，结合步骤3)中检测到的荧光值计算出血样中同型半胱氨酸的浓度。

以上所述的生物医学软件为Sigma plot软件，于市面上可以购买到。

以上所述的一种用基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒来检测同型半胱氨酸浓度的方法，其特征在于，所述同型半胱氨酸核酸适体荧光探针试剂中同型半胱氨酸核酸适体荧光探针浓度为200～400nmol/L，其特性还在于,所述同型半胱氨酸核酸适体荧光探针为5'和3'两端分别标记荧光芘分子单体的核苷酸单链，该核苷酸单链序列为：gggctaatgc attgccattaatgcctacct ttgcctgggt ggtctaaccc。

同型半胱氨酸核酸适体荧光探针不与同型半胱氨酸结合时，核酸适体处于比较松散的结构，5'和3'两端的芘分子单体相互游离,荧光激发后发射波长在370～400nm之间；同型半胱氨酸核酸适体荧光探针与同型半胱氨酸结合时，同型半胱氨酸诱导其发生结构改变，核酸适体5'和3'两端的芘分子单体相互靠近，形成激发态二聚体，荧光激发后激发态二聚体发射波长在480到500nm之间。

以上所述的一种用基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒来检测同型半胱氨酸浓度的方法，其特征在于，所述的血样为肝素抗凝全血或末梢血，所述含NH₄Cl、Tris、EDTA-Na₂的红细胞裂解液为含有1～280mmol/L NH₄Cl,1～34mmol/L Tris,1～2mmol/LEDTA-Na₂,pH7.0～7.2；所述含MgCl₂的0.2M磷酸缓冲液为含有1～10mmol/L MgCl₂；所述荧光检测仪为具有时间分辨荧光测定的荧光检测仪。

以上所述的一种用基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒来检测同型半胱氨酸浓度的方法，其特征在于，该检测方法用于检测肝素抗凝全血或末梢血中的同型半胱氨酸浓度。

本发明的原理是：在不与同型半胱氨酸时，核酸适体处于比较松散的结构，5'和3'两端的芘分子单体相互游离,荧光发射波长在370到400nm之间；与同型半胱氨酸结合时，同型半胱氨酸诱导核酸适体结构发生改变，核酸适体的5'和3'两端的芘分子单体相互靠近，形成二聚体，芘激发态发射波长二聚体在480到500nm之间。芘激发态二聚体荧光寿命有着长达100ns，比生物样品自发荧光寿命(约为5ns)长，通过检测同型半胱氨酸核酸适体探针和样品混合后的荧光强度和荧光寿命，计算样品中同型半胱氨酸的浓度。

本发明的实质性特点和显著进步是：

(1)检测操作简单快速，无需复杂样品加工和分离，将核酸适体探针直接加入裂解后的血样液，用荧光分光光度计短时间内就可以检测480～500nm处的荧光值；

(2)本试剂盒及其检测方法具有灵敏度高，检测结果重复性高，样品检测误差在0.01～0.1％之间，特异性强，同型半胱氨酸核酸适体荧光探针不与同型半胱氨酸结合时，核酸适体处于比较松散的结构，5'和3'两端的芘分子单体相互游离,荧光激发后发射波长在370～400nm之间；其与同型半胱氨酸结合时，同型半胱氨酸诱导其发生改变，核酸适体5'和3'两端的芘分子单体相互靠近，形成二聚体，荧光激发后二聚体发射波长在480～500nm之间。

(3)所用的试剂可以使配制好可直接使用的液体试剂或是使用前加水溶解后使用的干粉状态，检测试剂可以常温贮存，运输方便。

具体实施方式

以下结合表1和实施例描述本发明基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸HCy试剂盒及其检测方法。

表1.实施例中的试剂盒试剂成分组成

实施例1

按照表1中实施例1所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：

(1)血样裂解：将肝素抗凝全血、红细胞裂解液按体积比1:0.5混匀，静置30min，再中速离心7min，收集上清；

(2)混合卵育：取20μl步骤1)得到的上清和45ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解同型半胱氨酸核酸适体荧光探针得到的同型半胱氨酸核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育5min，得到测试液；

样品的3个平行测定误差为0.05±0.01％。

实施例2

按照表1中实施例2所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：

(1)血样裂解：将末梢血、红细胞裂解液按体积比1:2.5混匀，静置5min，再中速离心6min，收集上清；

(2)混合卵育：取50μl步骤1)得到的上清和30ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解同型半胱氨酸核酸适体荧光探针得到的同型半胱氨酸核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育6min，得到测试液；

(4)结果计算：使用生物医学作图软件，参照同型半胱氨酸标准样品制作的标准曲线，结合步骤3)中检测到的荧光值计算出血样中同型半胱氨酸的浓度。样品的3个平行测定误差为0.02±0.01％。

实施例3

按照表1中实施例3所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：

(1)血样裂解：将末梢血、红细胞裂解液按体积比1:3.5混匀，静置10min，再中速离心5min，收集上清；

(2)混合卵育：取75μl步骤1)得到的上清和45ul的

用0.2M磷酸缓冲液溶解同型半胱氨酸核酸适体荧光探针得到的同型半胱氨酸核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育7min，得到测试液；

样品的3个平行测定误差为0.04±0.01％。

实施例4

按照表1中实施例4所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：

(1)血样裂解：将肝素抗凝全血、红细胞裂解液按体积比1:0.5混匀，静置25min，再中速离心8min，收集上清；

(2)混合卵育：取100μl步骤1)得到的上清和50ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解同型半胱氨酸核酸适体荧光探针得到的同型半胱氨酸核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育8min，得到测试液；

样品的3个平行测定误差为0.06±0.01％。

实施例5

按照表1中实施例5所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：

(1)血样裂解：将肝素抗凝全血、红细胞裂解液按体积比1:1.0混匀，静置20min，再中速离心9min，收集上清；

(2)混合卵育：取80μl步骤1)得到的上清和30ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解同型半胱氨酸核酸适体荧光探针得到的同型半胱氨酸核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育9min，得到测试液；

样品的3个平行测定误差为0.07±0.01％。

实施例6

按照表1中实施例6所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：

(1)血样裂解：将肝素抗凝全血、红细胞裂解液按体积比1:4.5混匀，静置15min，再中速离心10min，收集上清；

(2)混合卵育：取30μl步骤1)得到的上清和40ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解同型半胱氨酸核酸适体荧光探针得到的同型半胱氨酸核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育10min，得到测试液；

样品的3个平行测定误差为0.08±0.01％。

实施例7

按照表1中实施例7所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：

(1)血样裂解：将末梢血、红细胞裂解液按体积比1:3.0混匀，静置18min，再中速离心8min，收集上清；

(2)混合卵育：取50μl步骤1)得到的上清和20ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解同型半胱氨酸核酸适体荧光探针得到的同型半胱氨酸核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育12min，得到测试液；

样品的3个平行测定误差为0.1±0.01％。

实施例8

按照表1中实施例8所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：

(1)血样裂解：将末梢血、红细胞裂解液按体积比1:2.0混匀，静置26min，再中速离心6min，收集上清；

(2)混合卵育：取60μl步骤1)得到的上清和25ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解同型半胱氨酸核酸适体荧光探针得到的同型半胱氨酸核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育13min，得到测试液；

样品的3个平行测定误差为0.02±0.01％。

实施例9

按照表1中实施例9所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：

(1)血样裂解：将末梢血、红细胞裂解液按体积比1:4.0混匀，静置8min，再中速离心7min，收集上清；

(2)混合卵育：取40μl步骤1)得到的上清和35ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解同型半胱氨酸核酸适体荧光探针得到的同型半胱氨酸核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育15min，得到测试液；

样品的3个平行测定误差为0.01±0.01％。

Claims

1.一种基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒，其特征在于，主要成分包括：含NH₄Cl、Tris、EDTA-Na₂的红细胞裂解液；含 MgCl₂的0.2M磷酸缓冲液；同型半胱氨酸标准品；同型半胱氨酸核酸适体荧光探针；所述同型半胱氨酸核酸适体荧光探针为5'和3'两端分别标记荧光芘分子单体的核苷酸单链，该核苷酸单链序列为：gggctaatgc attgccatta atgcctacct ttgcctgggt ggtctaaccc。

2.根据权利要求1所述的一种基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒，其特征在于，所述含NH₄Cl、Tris、EDTA-Na₂的红细胞裂解液为含有1～280 mmol/L NH₄Cl, 1~34 mmol/L Tris,1~2mmol/LEDTA-Na₂, pH 7.0~7.2；所述含 MgCl₂的0.2M磷酸缓冲液为含有1~10mmol/L MgCl₂。

3.根据权利要求1或2所述的一种基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒，其特征在于，所述含NH₄Cl、Tris、EDTA-Na₂的红细胞裂解液、含 MgCl₂的0.2M磷酸缓冲液、同型半胱氨酸标准品、同型半胱氨酸核酸适体荧光探针为配制好直接使用的液体试剂或是使用前需加水溶解的干粉状态。

4.根据权利要求1~3所述的一种基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于检测肝素抗凝全血或末梢血中的同型半胱氨酸浓度。

5.一种用权利1~3任一所述基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒来检测同型半胱氨酸浓度的方法，其特征在于，方法步骤包括：

（1）血样裂解：将血样和含NH₄Cl、Tris、EDTA-Na₂的红细胞裂解液按1:0.5~5体积比混匀，静置5~30min，再中速离心5~10min，收集上清液；

（2）混合卵育：取20~100μl步骤1）得到的上清液和30~50ul的用含 MgCl₂的0.2M磷酸缓冲液，溶解同型半胱氨酸核酸适体荧光探针得到的同型半胱氨酸核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育5~15min，使同型半胱氨酸核酸适体荧光探针与血样充分结合，得到测试液；

（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值；

（4）结果计算：使用生物医学作图软件，参照同型半胱氨酸标准样品制作的标准曲线，结合步骤3）中检测到的荧光值计算出血样中同型半胱氨酸的浓度。

6.根据权利要求5所述的一种用基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒来检测同型半胱氨酸浓度的方法，其特征在于，所述同型半胱氨酸核酸适体荧光探针试剂中同型半胱氨酸核酸适体荧光探针浓度为200~400 nmol/L，所述同型半胱氨酸核酸适体荧光探针为5'和3'两端分别标记荧光芘分子单体的核苷酸单链，该核苷酸单链序列为：gggctaatgc attgccatta atgcctacct ttgcctgggt ggtctaaccc。

7.根据权利要求6所述的一种用基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒来检测同型半胱氨酸浓度的方法，其特征在于，所述的同型半胱氨酸核酸适体荧光探针不与同型半胱氨酸结合时，核酸适体处于比较松散的结构，5'和3'两端的芘分子单体相互游离, 荧光激发后发射波长在 370~ 400nm 之间；所述的同型半胱氨酸核酸适体荧光探针与同型半胱氨酸结合时，同型半胱氨酸诱导其发生结构改变，核酸适体5'和3'两端的芘分子单体相互靠近，形成激发态二聚体，荧光激发后激发态二聚体发射波长在 480 到 500nm之间。

8.根据权利要求5所述的一种用基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒来检测同型半胱氨酸浓度的方法，其特征在于，所述的血样为肝素抗凝全血或末梢血，所述含NH₄Cl、Tris、EDTA-Na₂的红细胞裂解液为含有1~280 mmol/L NH₄Cl, 1~34 mmol/L Tris,1~2mmol/LEDTA-Na₂, pH 7.0~7.2；所述含 MgCl₂的0.2M磷酸缓冲液为含有1~10mmol/L MgCl₂；所述荧光检测仪为具有时间分辨荧光测定的荧光检测仪。

9.根据权利要求5~7所述的一种用基于核酸适体荧光探针的同型半胱氨酸试剂盒来检测同型半胱氨酸浓度的方法，其特征在于，该检测方法用于检测肝素抗凝全血或末梢血中的同型半胱氨酸浓度。