CN104592523B - 一种多肽修饰的聚阳离子基因载体及制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多肽修饰的聚阳离子基因载体及制备方法及应用，其制备方法为：(1)单甲醚封端的聚乙二醇‑聚(乳酸‑co‑己内酯)嵌段共聚物的制备；(2)琥珀酰化的单甲醚封端的聚乙二醇‑聚(乳酸‑co‑己内酯)嵌段共聚物的制备；(3)单甲醚封端的聚乙二醇‑聚(乳酸‑co‑己内酯)‑聚乙烯亚胺嵌段共聚物的制备；(4)多肽修饰的聚阳离子基因载体的制备，本发明提供的基因载体可以高效负载基因，连接的多肽可以有效地与内皮细胞膜表面的α4β1整合素结合，提高该聚阳离子基因载体与基因形成的复合物在内皮细胞表面的富集。本发明提供的多肽修饰的聚阳离子基因载体可以应用于内皮细胞的转染，基因转染效率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽修饰的聚阳离子基因载体及制备方法及应用，属于具有生物靶向识别功能的基因载体技术领域。
背景技术
在发达国家及中等发达国家，心脑血管疾病已经成为威胁人类生命安全的最主要疾病之一。目前对于心脑血管疾病的介入治疗主要是基于小口径人工血管的构建。但是小口径人工血管术后往往引起再狭窄和血栓，会对患者的生命安全造成二次威胁。研究表明，对人工血管材料表面实现快速全面的内皮化是解决再狭窄及血栓的有效方法。基因治疗和多肽靶向治疗可以有效实现快速全面内皮化。
基因治疗就是将目的基因导入体内，通过目的基因的表达达到治愈的效果。有效的基因载体是基因治疗得以成功的关键。常用的基因载体有两类，一类是病毒类的，一类是非病毒类的。由于病毒类载体存在安全系数低、制备难度大和对目的基因要求程度高等问题，在实际应用中不如非病毒类载体应用广泛。非病毒载体有多种，但效果最好的是聚乙烯亚胺类。考虑到高数均分子量聚乙烯亚胺的毒性，因此在实际研究中低数均分子量的聚乙烯亚胺是广受欢迎的。我们课题组一直致力于研究可生物降解的聚阳离子型基因载体。可通过自组装的技术，有效提高载体表面的正电荷密度，高效负载基因，同时可生物降解的聚合物核又不会带来高的生物毒性。
血管内皮细胞表面具有区别于其他种类细胞的膜蛋白受体，可以特异性的识别一些多肽分子。REDV(精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸)多肽就能够与内皮细胞膜表面的α4β1整合素发生特异性的识别作用，从而提高REDV多肽在内皮细胞表面的粘附。如果将REDV多肽接枝到基因载体表面，通过REDV多肽与内皮细胞的特异性结合作用，可以提高基因复合物在内皮细胞表面的富集，从而增加基因复合物被内吞的概率，基因转染效率就会随之增加。目前对于这种REDV多肽靶向的基因载体在促进内皮细胞转染方面的研究还较少。
发明内容
本发明的目的是在提供一种生物靶向识别性能好，转染效率高，生物毒性低的多肽修饰的聚阳离子基因载体。
本发明的第二个目的是提供一种多肽修饰的聚阳离子基因载体的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种多肽修饰的聚阳离子基因载体的应用。
本发明的技术方案概述如下：
一种多肽修饰的聚阳离子基因载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)琥珀酰化的单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)嵌段共聚物(II)的制备：
在氮气氛保护下，将数均分子量为5800-10500的单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)嵌段共聚物(I)，琥珀酸酐以及催化剂4-二甲氨基吡啶，缚酸剂三乙胺加入到溶剂无水二氧六环中使溶解，在室温搅拌下反应20-30h，在冰甲醇或冰乙醚中沉析得到粗产物，真空干燥，干燥物用N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜溶解，用截留分子量为5000-10000的透析管在蒸馏水中透析48-60h，冷冻干燥，得到白色的琥珀酰化的单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)嵌段共聚物(II)，所述单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)嵌段共聚物、琥珀酸酐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺的摩尔比为1:(5-10):(5-10):(3-6)，所述单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)嵌段共聚物中亲水段单甲醚封端的聚乙二醇数均分子量为2000-3500，疏水段聚(乳酸-co-己内酯)的数均分子量为3800-7000；
(2)单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)-聚乙烯亚胺嵌段共聚物(III)的制备：
在氮气氛保护下，以摩尔比为1：(5-10)：(5-10)：(4-6)，将式(II)所示共聚物、(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、数均分子量为1800-3500的支链的聚乙烯亚胺加入到N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中使溶解，在室温搅拌下反应18-28h，用截留分子量为5000-10000的透析管在蒸馏水中透析48-60h，冷冻干燥，得到白色的单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)-聚乙烯亚胺嵌段共聚物(III)；
(3)由式(III)共聚物合成多肽修饰的聚阳离子基因载体(IV)：
在氮气氛保护下，按比例将1质量份的式(III)所示共聚物、0.1-0.2质量份的数均分子量为2000的两端分别为吡啶二硫基和琥珀酰亚胺酯基修饰的聚乙二醇，加入到混合溶剂中使溶解，在避光条件下，于室温下反应2-4h，加入简写为CREDVW的多肽，室温下反应4-6h，产物用截留分子量为5000-12000的透析管在蒸馏水中透析48-60h，冷冻干燥，得到白色的多肽修饰的聚阳离子基因载体(IV)，所述混合溶剂为2体积份的pH＝8.4的0.1mol/L磷酸缓冲溶液和3体积份的二甲基亚砜混合而成；所述两端分别为吡啶二硫基和琥珀酰亚胺酯基修饰的聚乙二醇与CREDVW多肽的摩尔比为1：(0.7-1)。
上述方法制备的一种多肽修饰的聚阳离子基因载体。
上述多肽修饰的聚阳离子基因载体在提高内皮细胞转染效率方面的应用。
本发明的一种多肽修饰的聚阳离子基因载体集靶向识别与基因治疗于一身。通过CREDVW多肽中的REDV多肽与内皮细胞表面的整合素的特异性识别作用，可以提高基因载体复合物在内皮细胞表面的富集，从而增强基因复合物被内皮细胞内吞的概率，目的基因在内皮细胞中的转染效率就会随之增加。
附图说明
图1A为单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)嵌段共聚物(I)的1HNMR图。
图1B为琥珀酰化的单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)嵌段共聚物(II)的1HNMR图。
图1C为单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)-聚乙烯亚胺嵌段共聚物(III)的1H NMR图。
图2为荧光性能比较图：(1)0.50mg/mL的单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)-聚乙烯亚胺嵌段共聚物(III)的发射光谱图，(2)0.78mg/mL多肽修饰的聚阳离子基因载体(IV)的发射光谱图，(3)0.15mg/mL的CREDVW多肽的发射光谱图。(mPEG-P(LA-co-CL)-PEI指代单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)-聚乙烯亚胺嵌段共聚物，mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV指代多肽修饰的聚阳离子基因载体)。
图3为多肽修饰的聚阳离子基因载体的透射电镜图。
图4为多肽修饰的聚阳离子基因载体的动态光散射粒径分布图。
图5为多肽修饰的聚阳离子基因载体与pZNF580基因形成的复合物在不同氮磷比(N/P)结合时的流体学粒径和Zeta电位分布图。
图6为多肽修饰的聚阳离子基因载体与pZNF580基因形成的复合物在不同N/P结合时的凝胶成像电泳图。
图7为PEI1800/pZNF580基因复合物(N/P＝10)，多肽修饰的聚阳离子基因载体与pZNF580基因形成的复合物(N/P＝10)对EA.hy926内皮细胞的存活率考察效果图。
图8(A)为单独pZNF580基因在EA.hy926内皮细胞的转染结果(空白对照)；
图8(B)为PEI1800/pZNF580基因复合物在EA.hy926内皮细胞的转染结果(阴性对照)；
图8(C)为PEI25000/pZNF580基因复合物在EA.hy926内皮细胞的转染结果(阳性对照)；
图8(D)为多肽修饰的聚阳离子基因载体/pZNF580基因复合物在EA.hy926内皮细胞的转染结果。(PEI1800和PEI25000分别是指数均分子量为1800和25000的聚乙烯亚胺)
本发明各个共聚物的聚(乳酸-co-己内酯)部分的数均分子量由核磁积分面积计算得到。
具体实施方式
半胱氨酸-精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-色氨酸的多肽简称为CREDVW，委托上海吉尔生化有限公司制备。
数均分子量为2000的两端分别为吡啶二硫基和琥珀酰亚胺酯基修饰的聚乙二醇简称为OPSS-PEG-NHS，购于北京键凯科技有限公司。
数均分子量为2000-3500的单甲醚封端的聚乙二醇，购于天津希恩思生化科技有限公司。
聚乙烯亚胺购于Sigma试剂公司。
具有绿色荧光蛋白的ZNF580基因由武警医学院病理生理学教研室张文成教授课题组构建得到，可以通过监测绿色荧光的强度判断该基因在内皮细胞中的转染效率。这种具有绿色荧光蛋白的ZNF580基因简称为pZNF580。其中，ZNF580基因也是由该组首先克隆得到的，并在Genbank中注册，注册号为AF184939。构建pZNF580基因的详细方法可参照文献：绿色荧光蛋白报告基因与ZNF580基因重组真核表达载体的构建与鉴定，武警医学院学报，2005,14(1)：8-10。
EA.hy926内皮细胞购于中国科学院细胞库中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
式(I)所示的单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)嵌段共聚物简称为
mPEG-P(LA-co-CL)。
式(II)所示的琥珀酰化的单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)嵌段共聚物简称
为mPEG-P(LA-co-CL)-COOH。
式(III)所示的单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)-聚乙烯亚胺嵌段共聚物简
称为mPEG-P(LA-co-CL)-PEI。
式(IV)所示的多肽修饰的聚阳离子基因载体简称为mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV。
(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐简称为EDC·HCl。
N-羟基琥珀酰亚胺简称为NHS。
实施例1:数均分子量为5800的mPEG-P(LA-co-CL)(I-1)的制备:
在氮气氛保护下，将干燥的引发剂单甲醚封端的聚乙二醇，丙交酯和ε-己内酯单体以及催化剂辛酸亚锡加入到彻底干燥的带支口的反应瓶中，反复进行抽真空、通氮气操作3次，在110℃聚合反应20h，冷却到室温，用二氯甲烷溶解得到粗产物，粗产物经冰甲醇沉析、分离，沉淀物真空干燥后得到白色的式(I-1)所示的mPEG-P(LA-co-CL)嵌段共聚物，所述丙交酯和ε-己内酯的总摩尔量与单甲醚封端的聚乙二醇的摩尔量之比为100：1，所述催化剂辛酸亚锡的摩尔量与单体丙交酯和ε-己内酯的总摩尔量之比为1：800，丙交酯和ε-己内酯单体的摩尔比为2:3；
1H NMR(CDCl3,δ,ppm):1.41ppm和1.68ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,6H)，1.68ppm(-OCCH(CH3)O-,3H),2.36ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,2H),3.67ppm(-OCH2CH2-,4H),4.10ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,2H),5.20ppm(-OCCH(CH3)O-,1H)。见图1A。
实施例2:数均分子量为8776的mPEG-P(LA-co-CL)(I-2)的制备:
在氮气氛保护下，将干燥的引发剂单甲醚封端的聚乙二醇，丙交酯和ε-己内酯单体以及催化剂辛酸亚锡加入到彻底干燥的带支口的反应瓶中，反复进行抽真空、通氮气操作3次，在110℃聚合反应20h，冷却到室温，用二氯甲烷溶解得到粗产物，粗产物经冰甲醇沉析、分离，沉淀物真空干燥后得到白色的式(I-2)所示的mPEG-P(LA-co-CL)嵌段共聚物，所述丙交酯和ε-己内酯的总摩尔量与单甲醚封端的聚乙二醇的摩尔量之比为150：1，所述催化剂辛酸亚锡的摩尔量与单体丙交酯和ε-己内酯的总摩尔量之比为1：1000，丙交酯和ε-己内酯单体的摩尔比为1:8；
1H NMR(CDCl3,δ,ppm):1.40ppm和1.67ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,6H)，1.68ppm(-OCCH(CH3)O-,3H),2.34ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,2H),3.66ppm(-OCH2CH2-,4H),4.11ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,2H),5.22ppm(-OCCH(CH3)O-,1H)。
实施例3:数均分子量为10500的mPEG-P(LA-co-CL)(I-3)的制备：
在氮气氛保护下，将干燥的引发剂单甲醚封端的聚乙二醇，丙交酯和ε-己内酯单体以及催化剂辛酸亚锡加入到彻底干燥的带支口的反应瓶中，反复进行抽真空、通氮气操作3次，在110℃聚合反应20h，冷却到室温，用二氯甲烷溶解得到粗产物，粗产物经冰甲醇沉析、分离，沉淀物真空干燥后得到白色的式(I-3)所示的mPEG-P(LA-co-CL)嵌段共聚物，所述丙交酯和ε-己内酯的总摩尔量与单甲醚封端的聚乙二醇的摩尔量之比为200：1，所述催化剂辛酸亚锡的摩尔量与单体丙交酯和ε-己内酯的总摩尔量之比为1：1200，丙交酯和ε-己内酯单体的摩尔比为3：7；
1H NMR(CDCl3,δ,ppm):1.44ppm和1.68ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,6H)，1.68ppm(-COCH(CH3)O-,3H),2.36ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,2H),3.67ppm(-OCH2CH2-,4H),4.10ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,2H),5.24ppm(-OCCH(CH3)O-,1H)。
实施例4：多肽修饰的聚阳离子基因载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)mPEG-P(LA-co-CL)-COOH(II-1)的制备：
在氮气氛保护下，将实施例1制备的mPEG-P(LA-co-CL)嵌段共聚物，琥珀酸酐以及催化剂4-二甲氨基吡啶，缚酸剂三乙胺加入到溶剂无水二氧六环中使溶解，在室温搅拌下反应20h，在冰甲醇中沉析得到粗产物，真空干燥，干燥物用N,N-二甲基甲酰胺溶解，用截留分子量为5000的透析管在蒸馏水中透析48h，冷冻干燥，得到白色的mPEG-P(LA-co-CL)-COOH(II-1)，所述mPEG-P(LA-co-CL)嵌段共聚物、琥珀酸酐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺的摩尔比为1:5:5:3，所述单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)嵌段共聚物中亲水段单甲醚封端的聚乙二醇数均分子量为2000，疏水段聚(乳酸-co-己内酯)的数均分子量为3800；
1H NMR(CDCl3,δ,ppm):1.43ppm和1.65ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,6H)，1.67ppm(-COCH(CH3)O-,3H),2.34ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,2H),2.67ppm(-OCCH2CH2COOH,4H),3.40ppm(-OCH3,3H),3.66ppm(-OCH2CH2-,4H),4.12ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,2H),5.22ppm(-OCCH(CH3)O-,1H)。见图1B；
(2)mPEG-P(LA-co-CL)-PEI(III-1)的制备：
在氮气氛保护下，以摩尔比为1：1：5：5：4，将式(II-1)所示共聚物、EDC·HCl、NHS、数均分子量为1800的支链的聚乙烯亚胺加入到N,N-二甲基甲酰胺使溶解，在室温搅拌下反应18h，用截留分子量为5000的透析管在蒸馏水中透析48h，冷冻干燥，得到白色的mPEG-P(LA-co-CL)-PEI嵌段共聚物(III-1)；
1H NMR(CDCl3,δ,ppm):1.40ppm和1.66ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,6H)，1.67ppm(-COCH(CH3)O-,3H),2.32ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,2H),2.52-3.23ppm(-CH2CH2NH-),3.66ppm(-OCH2CH2-,4H),4.08ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,2H),5.14ppm(-OCCH(CH3)O-,1H)。见图1C。
(3)由式(III-1)共聚物合成多肽修饰的聚阳离子基因载体：
在氮气氛保护下，按比例将1质量份的式(III-1)所示共聚物、0.1质量份的数均分子量为2000的OPSS-PEG-NHS，加入到混合溶剂中使溶解，在避光条件下，于室温下反应2h，加入简写为CREDVW的多肽，室温下反应4h，产物用截留分子量为5000的透析管在蒸馏水中透析48h，冷冻干燥，得到白色的多肽修饰的聚阳离子基因载体mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV(IV-1)，所述混合溶剂为2体积份的pH＝8.4的0.1mol/L磷酸缓冲溶液和3体积份的二甲基亚砜混合而成；所述OPSS-PEG-NHS与CREDVW多肽的摩尔比为1：0.7。
通过式(III)中的聚乙烯亚胺的氨基与OPSS-PEG-NHS中的琥珀酰亚胺酯反应，将OPSS-PEG-NHS引入到式(III)中，再通过CREDVW中半胱氨酸的巯基与OPSS-PEG-NHS的吡啶二硫基反应，从而将CREDVW多肽引入，制备得到多肽修饰的聚阳离子基因载体。
在激发波长为290nm时，CREDVW多肽与mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV(IV-1)在360nm处有明显的荧光发射峰,而mPEG-P(LA-co-CL)-PEI(III-1)则没有，据此可以判断CREDVW多肽已经连接到mPEG-P(LA-co-CL)-PEI上了。见图2。
实施例5：多肽修饰的聚阳离子基因载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)mPEG-P(LA-co-CL)-COOH(II-2)的制备：
在氮气氛保护下，将实施例2制备的mPEG-P(LA-co-CL)嵌段共聚物，琥珀酸酐以及催化剂4-二甲氨基吡啶，缚酸剂三乙胺加入到溶剂无水二氧六环中使溶解，在室温搅拌下反应25h，在冰乙醚中沉析得到粗产物，真空干燥，干燥物用二甲基亚砜溶解，用截留分子量为7000的透析管在蒸馏水中透析52h，冷冻干燥，得到白色的mPEG-P(LA-co-CL)-COOH(II-2)，所述mPEG-P(LA-co-CL)嵌段共聚物、琥珀酸酐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺的摩尔比为1:7:7:4，所述单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)嵌段共聚物中亲水段单甲醚封端的聚乙二醇数均分子量为3500，疏水段聚(乳酸-co-己内酯)的数均分子量为5300；
1H NMR(CDCl3,δ,ppm):1.42ppm和1.65ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,6H)，1.66ppm(-COCH(CH3)O-,3H),2.32ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,2H),2.68ppm(-OCCH2CH2COOH,4H),3.41ppm(-OCH3,3H),3.66ppm(-OCH2CH2-,4H),4.13ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,2H),5.26ppm(-OCCH(CH3)O-,1H)。
(2)mPEG-P(LA-co-CL)-PEI(III-2)的制备：
在氮气氛保护下，以摩尔比为1：7：7：5，将式(II-2)所示共聚物、EDC·HCl、NHS、数均分子量为2500的支链的聚乙烯亚胺加入到二甲基亚砜使溶解，在室温搅拌下反应24h，用截留分子量为7000的透析管在蒸馏水中透析55h，冷冻干燥，得到白色的mPEG-P(LA-co-CL)-PEI嵌段共聚物(III-2)；
1HNMR(CDCl3,δ,ppm):1.40ppm和1.66ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,6H)，1.67ppm(-COCH(CH3)O-,3H),2.32ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,2H),2.54-3.33ppm(-CH2CH2NH-),3.66ppm(-OCH2CH2-,4H),4.08ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,2H),5.16ppm(-OCCH(CH3)O-,1H)。
(3)由式(III-2)共聚物合成多肽修饰的聚阳离子基因载体：
在氮气氛保护下，按比例将1质量份的式(III-2)所示共聚物、0.15质量份的数均分子量为2000的OPSS-PEG-NHS，加入到混合溶剂中使溶解，在避光条件下，于室温下反应3h，加入简写为CREDVW的多肽，室温下反应5h，产物用截留分子量为7000的透析管在蒸馏水中透析50h，冷冻干燥，得到白色的多肽修饰的聚阳离子基因载体mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV(IV-2)，所述混合溶剂为2体积份的pH＝8.4的0.1mol/L磷酸缓冲溶液和3体积份的二甲基亚砜混合而成；所述OPSS-PEG-NHS与CREDVW多肽的摩尔比为1：0.8。
实施例6：多肽修饰的聚阳离子基因载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)mPEG-P(LA-co-CL)-COOH(II-3)的制备：
在氮气氛保护下，将实施例3制备的mPEG-P(LA-co-CL)嵌段共聚物，琥珀酸酐以及催化剂4-二甲氨基吡啶，缚酸剂三乙胺加入到溶剂无水二氧六环中使溶解，在室温搅拌下反应30h，在冰甲醇中沉析得到粗产物，真空干燥，干燥物用N,N-二甲基甲酰胺，用截留分子量为10000的透析管在蒸馏水中透析60h，冷冻干燥，得到白色的mPEG-P(LA-co-CL)-COOH(II-3)，所述mPEG-P(LA-co-CL)嵌段共聚物、琥珀酸酐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺的摩尔比为1:10:10:6，所述单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)嵌段共聚物中亲水段单甲醚封端的聚乙二醇数均分子量为3500，疏水段聚(乳酸-co-己内酯)的数均分子量为7000；
1H NMR(CDCl3,δ,ppm):1.43ppm和1.66ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,6H)，1.67ppm(-COCH(CH3)O-,3H),2.32ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,2H),2.67ppm(-OCCH2CH2COOH,4H),3.40ppm(-OCH3,3H),3.66ppm(-OCH2CH2-,4H),4.08ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,2H),5.12ppm(-OCCH(CH3)O-,1H)。
(2)mPEG-P(LA-co-CL)-PEI(III-3)的制备：
在氮气氛保护下，以摩尔比为1：10：10：6，将式(II-3)所示共聚物、EDC·HCl、NHS、数均分子量为3500的支链的聚乙烯亚胺加入到N,N-二甲基甲酰胺使溶解，在室温搅拌下反应28h，用截留分子量为10000的透析管在蒸馏水中透析60h，冷冻干燥，得到白色的mPEG-P(LA-co-CL)-PEI嵌段共聚物(III-3)；
1H NMR(CDCl3,δ,ppm):1.43ppm和1.66ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,6H)，1.67ppm(-COCH(CH3)O-,3H),2.32ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,2H),2.55-3.34ppm(-CH2CH2NH-),3.66ppm(-OCH2CH2-,4H),4.08ppm(-OCH2(CH2)3CH2CO-,2H),5.12ppm(-OCCH(CH3)O-,1H)。
(3)由式(III-3)共聚物合成多肽修饰的聚阳离子基因载体：
在氮气氛保护下，按比例将1质量份的式(III-3)所示共聚物、0.2质量份的数均分子量为2000的OPSS-PEG-NHS，加入到混合溶剂中使溶解，在避光条件下，于室温下反应4h，加入简写为CREDVW的多肽，室温下反应6h，产物用截留分子量为12000的透析管在蒸馏水中透析60h，冷冻干燥，得到白色的多肽修饰的聚阳离子基因载体mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV(IV-3)，所述混合溶剂为2体积份的pH＝8.4的0.1mol/L磷酸缓冲溶液和3体积份的二甲基亚砜混合而成；所述OPSS-PEG-NHS与CREDVW多肽的摩尔比为1：1。
实施例7:mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV(IV-1)纳米粒及其与pZNF580基因复合物的制备：
采用透析法制备mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV(IV-1)纳米粒:
称取10mg mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV(IV-1)共聚物，用2mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后将溶液转移至截留分子量为5000的透析管中在蒸馏水中透析48h后得到分散均一的mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV(IV-1)纳米粒悬浮液。
用pH＝7.4的0.01M PBS缓冲溶液将pZNF580基因稀释至60μg/mL,按照氮磷比(N/P)＝0,1,2.5,3,5,7,10,15,20在室温下轻微震荡混匀，即可得到不同N/P的mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV(IV-1)/pZNF580复合物。
图3为mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV(IV-1)纳米粒的透射电子显微镜图片，平均粒径为56.1±8.2nm。图4为该mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV(IV-1)纳米粒在水中的粒径分布图，其粒径范围在30-300nm之间，平均粒径为97.4nm。图5为mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV(IV-1)/pZNF580基因复合物在不同N/P时的流体学粒径和Zeta电位分布图。在N/P＝2-20范围内，该复合物的Zeta电位均为正值，这为其进入细胞提供了必要条件。而随着N/P的增加，该复合物的流体学粒径逐渐趋于稳定，说明其复合物逐渐趋于稳定。
实施例8:mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV(IV-1)/pZNF580复合物的凝胶成像电泳分析：
将制备好的不同N/P的mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV(IV-1)/pZNF580复合物，纯的pZNF580基因分别在室温条件下培养半个小时，然后在凝胶电泳仪上跑电泳，电泳完毕后将琼脂糖凝胶置于凝胶自动成像系统的平台中间，打开紫外光，可以看到发荧光的pZNF580基因条带，在电脑中观测并保存图像。从图6中可以看出，当N/P≧10时，没有看到游离的pZNF580基因出孔，说明在该N/P时，mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV(IV-1)/pZNF580基因复合物很稳定，阻滞了带负电荷的pZNF580基因电离。图6中，0孔为纯的pZNF580基因。
实施例9:mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV(IV-1)/pZNF580复合物对EA.hy926细胞的存活率考察：
运用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)测试mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV(IV-1)/pZNF580复合物(N/P＝10)、PEI1800/pZNF580复合物(N/P＝10)对EA.hy926细胞的毒性影响。从图7可以看出在20-100μg/mL之间时，mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV(IV-1)/pZNF580基因复合物的细胞毒性均大大弱于PEI1800/pZNF580复合物的毒性，且细胞存活率都大于100％，说明该mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV(IV-1)/pZNF580基因复合物对EA.hy926内皮细胞的毒性很低。
实施例10:mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV(IV-1)/pZNF580基因复合物在EA.hy926内皮细胞中的转染实验：
通过激光共聚焦显微镜考察不同复合物在细胞中的转染效果。
图8(A)单独pZNF580基因在EA.hy926内皮细胞的转染结果(空白对照)；图8(B)PEI1800/pZNF580基因复合物在EA.hy926内皮细胞的转染结果(阴性对照)；图8(C)PEI25000/pZNF580基因复合物在EA.hy926内皮细胞的转染结果(阳性对照)；图8(D)mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV/pZNF580基因复合物在EA.hy926内皮细胞的转染结果。(PEI1800和PEI25000分别是指数均分子量为1800和25000的聚乙烯亚胺)
图8(A)中由于没有基因载体，目的基因不可能进入细胞表达出绿色荧光。图8(B)中显示的PEI1800/pZNF580基因复合物在EA.hy926内皮细胞中的转染情况，转染效率较低。图8(C)显示的PEI25000/pZNF580基因复合物在EA.hy926内皮细胞中的转染效果较好。图8(D)显示的mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV(IV-1)/pZNF580基因复合物在EA.hy926内皮细胞的转染结果是最好的。
实验证明，实施例5、6制备的多肽修饰的聚阳离子基因载体的效果与实施例4的效果相似。
Claims (3)
1.一种多肽修饰的聚阳离子基因载体的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)琥珀酰化的单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)嵌段共聚物(II)的制备：
在氮气氛保护下，将数均分子量为5800-10500的单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)嵌段共聚物(I)，琥珀酸酐以及催化剂4-二甲氨基吡啶，缚酸剂三乙胺加入到溶剂无水二氧六环中使溶解，在室温搅拌下反应20-30h，在冰甲醇或冰乙醚中沉析得到粗产物，真空干燥，干燥物用N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜溶解，用截留分子量为5000-10000的透析管在蒸馏水中透析48-60h，冷冻干燥，得到白色的琥珀酰化的单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)嵌段共聚物(II)，所述单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)嵌段共聚物、琥珀酸酐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺的摩尔比为1:(5-10):(5-10):(3-6)，所述单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)嵌段共聚物中亲水段单甲醚封端的聚乙二醇数均分子量为2000-3500，疏水段聚(乳酸-co-己内酯)的数均分子量为3800-7000；
(2)单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)-聚乙烯亚胺嵌段共聚物(III)的制备：
在氮气氛保护下，以摩尔比为1：(5-10)：(5-10)：(4-6)，将式(II)所示共聚物、(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、数均分子量为1800-3500的支链的聚乙烯亚胺加入到N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中使溶解，在室温搅拌下反应18-28h，用截留分子量为5000-10000的透析管在蒸馏水中透析48-60h，冷冻干燥，得到白色的单甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己内酯)-聚乙烯亚胺嵌段共聚物(III)；
(3)由式(III)共聚物合成多肽修饰的聚阳离子基因载体(IV)：
在氮气氛保护下，按比例将1质量份的式(III)所示共聚物、0.1-0.2质量份的数均分子量为2000的两端分别为吡啶二硫基和琥珀酰亚胺酯基修饰的聚乙二醇，加入到混合溶剂中使溶解，在避光条件下，于室温下反应2-4h，加入简写为CREDVW的多肽，室温下反应4-6h，产物用截留分子量为5000-12000的透析管在蒸馏水中透析48-60h，冷冻干燥，得到白色的多肽修饰的聚阳离子基因载体(IV)，所述混合溶剂为2体积份的pH＝8.4的0.1mol/L磷酸缓冲溶液和3体积份的二甲基亚砜混合而成；所述两端分别为吡啶二硫基和琥珀酰亚胺酯基修饰的聚乙二醇与CREDVW多肽的摩尔比为1：(0.7-1)。
2.权利要求1所述的方法制备的一种多肽修饰的聚阳离子基因载体。
3.权利要求2所述的多肽修饰的聚阳离子基因载体在提高内皮细胞转染效率方面的应用。
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