CN104587466B - 蛋白‑聚吡咯复合物及蛋白‑聚吡咯复合物衍生物的制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及蛋白‑聚吡咯复合物及蛋白‑聚吡咯复合物衍生物的制备方法与应用。本发明提供的蛋白‑聚吡咯复合物中吡咯以原位聚合的方式包裹于蛋白表面。该蛋白‑聚吡咯复合物被细胞吞噬后在激光的照射下会产生很高的热量，可以杀死肿瘤细胞，是一种良好的光热试剂；且还可以用作担载光敏剂的载体。本发明提供的蛋白‑聚吡咯复合物衍生物中吡咯以原位聚合的方式包裹于载有二氢卟吩e6的蛋白表面，是理想的光热治疗剂、光动力治疗剂，或光热光动力联合治疗剂。另外，由于二氢卟吩e6还可以作肿瘤的荧光成像，因此本发明还公开了蛋白‑聚吡咯复合物衍生物作为肿瘤的成像剂的应用。

Description

蛋白-聚吡咯复合物及蛋白-聚吡咯复合物衍生物的制备方法 与应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及蛋白-聚吡咯复合物及蛋白-聚吡咯复合物衍生物的制备方法与应用。

背景技术

癌症是威胁人类健康的重大恶性疾病之一，在癌症治疗中，传统的手术疗法、放射疗法和化学疗法会伤害到体内正常的组织以及带来一些其他的副作用。近年来，新的治疗手段，如在近红外激光中利用近红外光热转换的光热治疗(PTT)已经开始被研究应用于癌症治疗。光热治疗的基本原理是在激光照射条件下，利用光热转换产生的高热量来破坏消除癌细胞，其中，在癌细胞位点上较强的近红外光学吸收以及高的光热转换效率是光热治疗能否成功实施的关键。由于近红外光对人体自身组织的穿透能力较强，人体组织的主要组成成分如水等对近红外光的吸收能力较差，因而，与传统的治疗方法相比，光热治疗不会对其他正常的组织造成损伤，副作用较小。

目前广泛研究的光热材料主要包括无机材料以及有机材料。无机材料主要集中在以金，银，钯为基础的新型金属纳米颗粒以及以铜为基础的半导体纳米材料。以碳为基础的石墨烯，碳管也是无机光热材料的一大类。但是这些无机材料在作为光热治疗材料中也存在着不可忽略的问题如金属纳米离子的生物代谢差，长期毒性，以及碳纳米材料诱发的毒性反应。鉴于这些原因，有机光热试剂由于其具有良好的生物相容性，光学稳定性，较高的光热转化效率脱颖而出成为新型光热试剂。光动力治疗是指在光敏剂参与下，在光的作用下，使肿瘤细胞发生机能或形态变化，严重时导致细胞损伤和坏死作用。

聚吡咯(结构式如式I所示)作为一种有机导电聚合物，由于其高导电率以及优良的稳定性，常常被用于有机导电薄膜的制备。同时聚吡咯在近红外表现出较强的光学吸收并且其具有良好的生物相容性，聚吡咯已经实现了在生物传感器，药物输送以及神经再生中的应用。

二氢卟吩e6(Chorin e6，简称Ce6，结构式如式II所示)是光动力学疗法(PDT)治疗恶性肿瘤的光敏剂之一，其机理是：光敏剂或其代谢产物聚集于靶组织，在适当波长光的作用下，将恶性组织周围的三重态O₂分子激发成单重态氧而诱导肿瘤细胞坏死。Ce6是第二代新型光敏剂，与第一代光动力抗肿瘤药物，如：血卟啉衍生物(HPD)、光敏素II(photofrinII)等复杂的混合卟啉制剂相比，具有结构明确，红光区(＞600nm)吸收系数高等优点。且肿瘤光动力疗效更理想，对肿瘤的选择性较高。此外，Ce6还具有亲脂性和一定的亲水性，稳定性有所提高，但亲水性还不足以提高药物的吸收效果。

目前，对于肿瘤的治疗尚还没有切实有效的方法，因此，采用多种技术方案联合使用，或采用多种有效物质联合使用，以达到更好的治疗肿瘤是目前研究的重点。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供蛋白-聚吡咯复合物及蛋白-聚吡咯复合物衍生物的制备方法与应用。本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物或蛋白-聚吡咯复合物衍生物皆具有良好的光热效应，能够产生良好的光动力学治疗效果。

本发明提供的一种蛋白-聚吡咯复合物，由蛋白和聚吡咯组成；

其中，聚吡咯通过原位聚合的方式包裹于蛋白表面。

在本发明的实施例中，蛋白为牛血清白蛋白或转铁蛋白。

在一些实施例中，蛋白为牛血清白蛋白。

在本发明的实施例中，蛋白-聚吡咯复合物的粒径为16nm～22nm。

在本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物中，蛋白为表面活性剂。其中，牛血清白蛋白(BSA)是牛血清中的一种球蛋白，包含607个氨基酸残基，分子量为66.43KDa，等电点为4.7，可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。转铁蛋白又名运铁蛋白(transferrin，TRF，siderophilin)是血浆中主要的含铁蛋白质，负责运载由消化管吸收的铁和由红细胞降解释放的铁。转铁蛋白的分子量为77KDa。

本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物的制备方法，包括：在催化剂的作用下，吡咯和蛋白在水中发生聚合反应，得到蛋白-聚吡咯复合物。

在一些实施例中，催化剂为氯化铁。

在一些实施例中，吡咯与蛋白的质量比为1:1。

在一些实施例中，蛋白溶于去离子水后，经超声得到蛋白溶液。

在一些实施例中，蛋白溶液中，蛋白的浓度为2.5mg/mL。

在一些实施例中，吡咯单体溶于去离子水后，经超声得到吡咯溶液。

在一些实施例中，吡咯溶液中，吡咯的浓度为20μL/mL。

在一些实施例中，吡咯与氯化铁的质量比为1:1。

在一些实施例中，步骤2中，混合具体为，搅拌1h。

在一些实施例中，反应的时间为24小时，条件为常压搅拌，温度为室温。

在本发明的实施例中，室温为10℃～30℃。

经试验证明，本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物在近红外区有着较高的光学吸收，被细胞吞噬后在激光的照射下会产生很高的热量，可以杀死肿瘤细胞，是一种良好的光热试剂。且该蛋白-聚吡咯复合物再水或生理条件下都具有较好的分散性。另外，细胞实验表明，该蛋白-聚吡咯复合物即便在高浓度下，未经激光照射也不会产生细胞毒性。

由于本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物在近红外区有着较高的光学吸收，因此，该蛋白-聚吡咯复合物作为光热治疗剂的应用。

另外，由于本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物中的包含蛋白成分，而蛋白上的氨基可以和多种光敏剂结合，因此，其还可以用作担载光敏剂的载体。而由于本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物具有良好的水溶性和生物相容性，因此，能够很好的解决大部分光敏剂不易溶于水的问题，提高了药物的吸收效果。

本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物能够担载的光敏剂为用于光热治疗、光动力治疗或荧光成像的光敏剂。

在本发明的实施例中，光敏剂为二氢卟吩e6。

本发明还提供了一种蛋白-聚吡咯复合物衍生物，由蛋白、二氢卟吩e6和聚吡咯组成；

二氢卟吩e6负载于蛋白上，聚吡咯通过原位聚合的方式包裹于载有二氢卟吩e6的蛋白表面。在本发明的实施例中，蛋白为牛血清白蛋白或转铁蛋白。

在一些实施例中蛋白为牛血清白蛋白。

在本发明的实施例中，本发明提供给的蛋白-聚吡咯复合物衍生物其粒径为19nm～22nm。

本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物衍生物，以蛋白-聚吡咯复合物为载体，担载有二氢卟吩e6。该蛋白-聚吡咯复合物衍生物具有很好的水溶性和生物相容性，担载二氢卟吩e6后与蛋白-聚吡咯复合物的粒径未见显著差异，粒径分布状态也未见显著变化。表明担载化合物后，蛋白-聚吡咯复合物的性质未见显著变化，性质较稳定。

本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物衍生物的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：将N-(3-二甲基氨丙基)-N'-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和二氢卟吩e6溶于二甲亚砜，得到二氢卟吩e6溶液；

步骤2：二氢卟吩e6溶液与蛋白水溶液反应，得到中间产物；

步骤3：将中间产物与吡咯水溶液溶液混合，在氯化铁的作用下反应得到蛋白-聚吡咯复合物衍生物。

在一些实施例中，吡咯和蛋白的质量比为1:1，蛋白与二氢卟吩e6的摩尔比为1:3。

在一些实施例中，N-(3-二甲基氨丙基)-N'-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和二氢卟吩e6溶于二甲亚砜后，经震荡30min，得到二氢卟吩e6溶液。

N-(3-二甲基氨丙基)-N'-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的作用是活化二氢卟吩e6，从而使蛋白上的氨基能够与二氢卟吩e6发生反应。

在一些实施例中，N-(3-二甲基氨丙基)-N'-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺与二氢卟吩e6的摩尔比为1:1:1。

在一些实施例中，蛋白溶于去离子水后，经超声得到蛋白溶液。

在一些实施例中，蛋白溶液中，蛋白的浓度为2.5mg/mL。

在一些实施例中，吡咯单体溶于去离子水后，经超声得到吡咯溶液。

在一些实施例中，步骤2中反应具体为，将二氢卟吩e6溶液加入蛋白溶液中，常温常压反应。

在一些实施例中，吡咯溶液中，吡咯的浓度为20μL/mL。

在一些实施例中，吡咯与氯化铁的质量比为1:1。

本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物衍生物在近红外具有较强的光学吸收，被细胞吞噬后在激光的照射下会产生很高的热量，可以杀死肿瘤细胞，是理想的光热治疗剂；同时由于其载有光动力治疗用的光敏分子二氢卟吩e6，在661nm波长激光照射下能产生单线态氧从而破坏肿瘤细胞，因此，其还可以作为光动力治疗剂，或者，将其用于光热光动力联合治疗剂。另外，由于二氢卟吩e6还可以作肿瘤的荧光成像，因此本发明还公开了蛋白-聚吡咯复合物衍生物作为肿瘤的成像剂的应用。

因此，本发明提供了本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物衍生物在制备光热治疗剂、光动力治疗剂、光热光动力联合治疗剂或荧光成像剂中的应用。

实验表明，利用本发明制备的蛋白-聚吡咯复合物的衍生物纳米颗粒，对小鼠通过尾静脉注射，并由荧光成像技术对其进行监测；发现纳米颗粒能够在肿瘤的部位具有很高的富集。用808纳米激光进行光热治疗、660纳米激光做光动力治疗，或采用光热光动力联合治疗的效果都非常显著(p<0.01)，并且不会对其他的部位造成损失。

经试验证实，小鼠通过尾静脉注射蛋白-聚吡咯复合物衍生物后，初期，该蛋白-聚吡咯复合物衍生物均匀的分布与小鼠的体内。而随着时间的推移，肿瘤区域的蛋白-聚吡咯复合物衍生物的荧光信号逐渐增强，6小时后在肿瘤部位的富集量达到最大。可见，本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物衍生物具有良好的生物相容性和靶向性。

本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物中吡咯以原位聚合的方式包裹于蛋白表面。该蛋白-聚吡咯复合物被细胞吞噬后在激光的照射下会产生很高的热量，可以杀死肿瘤细胞，是一种良好的光热试剂；且还可以用作担载光敏剂的载体。本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物衍生物中吡咯以原位聚合的方式包裹于载有二氢卟吩e6的蛋白表面。本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物衍生物是理想的光热治疗剂；同时由于其载有光动力治疗用的光敏分子二氢卟吩e6，在661nm波长激光照射下能产生单线态氧从而破坏肿瘤细胞，因此，其还可以作为光动力治疗剂，或者，将其用于光热光动力联合治疗剂。另外，由于二氢卟吩e6还可以作肿瘤的荧光成像，因此本发明还公开了蛋白-聚吡咯复合物衍生物作为肿瘤的成像剂的应用。

附图说明

图1示本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物的在水中的粒径分布；其中，线1示实施例1制得的蛋白-聚吡咯复合物在水中的分布粒径；线2示实施例2制得的蛋白-聚吡咯复合物在水中的分布粒径；

图2示本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物的透射电镜图；其中，图2-a示实施例1制得的蛋白-聚吡咯复合物的透射电镜图；图2-b示实施例2制得的蛋白-聚吡咯复合物的透射电镜图；

图3示本发明实施例1～2提供的蛋白-聚吡咯复合物的紫外吸收效果图；

图4示4T1细胞与不同浓度的蛋白-聚吡咯复合物孵育后活性检测结果；其中，*示具有显著性差异(p<0.01)；

图5示对BSA-Ce6-PPy和BSA-PPy的动态光散射检测结果；其中，线1示对BSA-PPy的动态光散射检测结果；线2示对BSA-Ce6-PPy的动态光散射检测结果；

图6示对BSA-Ce6-PPy和BSA-PPy的紫外吸收检测结果；其中，线1示对BSA-Ce6-PPy的紫外吸收检测结果；线2示对BSA-PPy的紫外吸收检测结果；

图7示不同浓度BSA-Ce6-PPy水溶液对4T1细胞的毒性检测结果；

图8示不同浓度BSA-Ce6-PPy光热活性检测结果；其中，线1示水经808nm的激光照射后的温度变化；线2示Ce6经808nm的激光照射后的温度变化；线3示浓度为0.004mg/mL的BSA-Ce6-PPy经808nm的激光照射后的温度变化；线4示浓度为0.008mg/mL的BSA-Ce6-PPy经808nm的激光照射后的温度变化；线5示浓度为0.016mg/mL的BSA-Ce6-PPy经808nm的激光照射后的温度变化；线6示浓度为0.031mg/mL的BSA-Ce6-PPy经808nm的激光照射后的温度变化；

图9不同溶液经661nm的激光照射后单线态氧的含量；其中，图9-a示Ce6经661nm的激光照射后产生单线态氧的量；图9-b示BSA-Ce6-PPy经661nm的激光照射后产生单线态氧的量；图9-c示BSA-PPy经661nm的激光照射后产生单线态氧的量；图9-d示水经661nm的激光照射后产生单线态氧的量；图9-e示BSA经661nm的激光照射后产生单线态氧的量；图9-f示PPy-PVA经661nm的激光照射后产生单线态氧的量；

图10蛋白-聚吡咯复合物衍生物对细胞活性的影响；其中，*示具有显著性差异(p<0.01)；

图11示经激光照射后小鼠肿瘤体积变化；其中，线1示对照组小鼠经PDT+PTT；线2示实验组小鼠经PDT；线3实验组小鼠经PTT；线4示实验组小鼠经PDT+PTT；

图12示BSA-Ce6-PPy在小鼠肿瘤部位的富集情况图；

图13示BSA-Ce6-PPy在小鼠各器官内的分布情况；

图14示小鼠经激光照射后肿瘤部位发热情况；其中，图14-a示对照组小鼠经激光照射0min后肿瘤部位发热情况；图14-b示对照组小鼠经激光照射1min后肿瘤部位发热情况；图14-c示对照组小鼠经激光照射2min后肿瘤部位发热情况；图14-d示对照组小鼠经激光照射3min后肿瘤部位发热情况；图14-e示对照组小鼠经激光照射4min后肿瘤部位发热情况；图14-f示对照组小鼠经激光照射5min后肿瘤部位发热情况；图14-g示实验组小鼠经激光照射0min后肿瘤部位发热情况；图14-h示实验组小鼠经激光照射1min后肿瘤部位发热情况；图14-i示实验组小鼠经激光照射2min后肿瘤部位发热情况；图14-j示实验组小鼠经激光照射3min后肿瘤部位发热情况；图14-k示实验组小鼠经激光照射4min后肿瘤部位发热情况；图14-l示实验组小鼠经激光照射5min后肿瘤部位发热情况；

图15示小鼠经激光照射后肿瘤部位温度变化；其中，线1示实验组小鼠经激光照射后肿瘤部位温度变化；线2示对照组小鼠经激光照射后肿瘤部位温度的变化。

具体实施方式

本发明提供了蛋白-聚吡咯复合物及蛋白-聚吡咯复合物衍生物的制备方法与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1蛋白-聚吡咯复合物的制备

称取20mg牛血清白蛋白溶于5mL水中，超声溶解，得到牛血清白蛋白溶液。

取吡咯20μL(与蛋白的质量比为1:1)溶解于1mL去离子水中，超声溶解，得到吡咯溶液。

六水合氯化铁溶于去离子水，制得浓度为1ml浓度为20mg/ml的FeCl₃溶液。

将吡咯溶液滴加入牛血清蛋白溶液，室温常压搅拌1h，然后滴加氯化铁溶液，室温常压搅拌24h。制得蛋白-聚吡咯复合物。

实施例2蛋白-聚吡咯复合物的制备

称取20mg转铁蛋白溶于5mL水中，超声溶解，得到转铁蛋白溶液。

取吡咯20μL(与蛋白的质量比为1:1)溶解于1mL去离子水中，超声溶解，得到吡咯溶液。

六水合氯化铁溶于去离子水，制得1ml浓度为20mg/ml的FeCl₃溶液。

将吡咯溶液滴加入转铁蛋白溶液，室温常压搅拌1h，然后滴加氯化铁溶液，室温常压搅拌24h。制得蛋白-聚吡咯复合物。

实施例3蛋白-聚吡咯复合物的性质检测

对实施例1～2制得的蛋白-聚吡咯复合物进行定性检测，分别进行动态光散射、紫外吸收、透射电镜检测。

其中，对动态光散射检测的结果如图1所示，结果显示，本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物在水中粒径主要集中在16nm～22nm。

对透射电镜检测的结果如图2所示，结果显示，本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物在水中呈单分散状态分布，表明本发明制得的蛋白-聚吡咯复合物的粒径均一，在水中分散良好。

紫外吸收检测结果如图3所示，结果显示，本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物在近红外局域有较强的吸收。

实施例4蛋白-聚吡咯复合物的光热活性和细胞毒性检测

取实施例1制备的牛血清白蛋白-聚吡咯复合物(BSA-PPy)，和实施例2制备的转铁蛋白-聚吡咯复合物(Trf-PPy)，分别配制成不同浓度的水溶液，每个浓度溶液设9次重复，别与4T1细胞孵育24h。然后，采用808纳米激光在0.6W/cm2的功率下照射5分钟后测试细胞相对活性，结果如图4所示。

如图所示，4T1细胞与不同浓度的牛血清白蛋白-聚吡咯复合物孵育后，仍保持良好的活性，未见明显细胞毒性。转铁蛋白-聚吡咯复合物与4T1细胞孵育后，细胞活性的检测结果与此相似。

经激光照射后，细胞活性则显著(p＜0.01)降低，表明本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物具有良好的光热效应，能够作为光热治疗剂使用。并且，细胞活性随蛋白-聚吡咯复合物浓度的升高而降低，说明本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物的光热效应与浓度呈正相关。

实施例5蛋白-聚吡咯复合物衍生物的制备

将N-(3-二甲基氨丙基)-N'-乙基碳二亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺以及二氢卟吩e6溶于二甲亚砜中得到二氢卟吩e6的混合溶液。其中，N-(3-二甲基氨丙基)-N'-乙基碳二亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺与二氢卟吩e6的摩尔比为1:1:1。

称取20mg牛血清白蛋白溶于5mL水中，超声溶解，得到牛血清白蛋白溶液。

取吡咯20μL(与蛋白的质量比为1:1)溶解于1mL去离子水中，超声溶解，得到吡咯溶液。

将六水合氯化铁溶于去离子水，制得1ml浓度为20mg/ml的FeCl₃溶液。

将二氢卟吩e6溶液入蛋白溶液中，常温常压反应12小时后，滴加入吡咯溶液，室温常压搅拌1h，然后滴加氯化铁溶液，室温常压搅拌24h。制得牛血清白蛋白-聚吡咯复合物衍生物(BSA-Ce6-PPy)。

实施例6蛋白-聚吡咯复合物衍生物的性质检测

对实施例5制得的牛血清白蛋白-聚吡咯复合物衍生物(BSA-Ce6-PPy)进行定性检测，分别进行动态光散射、紫外吸收检测。

其中，对动态光散射检测的结果如图5所示，结果显示，本发明提供的BSA-Ce6-PPy在水中粒径主要集中在19nm～22nm，装载药物后粒径没有发生较大的变化，表明本发明提供的蛋白-聚吡咯复合物作为载体使用性质稳定。

紫外吸收检测结果如图6所示，结果显示，本发明提供的BSA-Ce6-PPy在近红外局域有较强的吸收，与BSA-PPy相比，其在波长为660nm出现了吸收峰，这由于担载了Ce6，表明本发明成功制备得到了BSA-Ce6-PPy。

实施例7蛋白-聚吡咯复合物衍生物的细胞毒性检测

取不同浓度的牛血清白蛋白-聚吡咯复合物衍生物(BSA-Ce6-PPy)水溶液与4T1细胞孵育24h，以Ce6水溶液与4T1细胞孵育24h为阳性对照。细胞活性检测采用标准的MTT试剂进行检测。结果如附图7所示，4T1细胞与不同浓度的BSA-Ce6-PPy孵育后，仍保持良好的活性，未见明显细胞毒性。

实施例8蛋白-聚吡咯复合物衍生物的光热活性检测

配制不同浓度的牛血清白蛋白-聚吡咯复合物衍生物(BSA-Ce6-PPy)，经808nm的激光照射，检测升温曲线，以水作为阴性对照，以Ce6作为阳性对照。结果如图8所示。

从图中可以看出BSA-Ce6-PPy在近红外有着较强的光学吸收并且有较强的荧光，且在一个较低的浓度下BSA-Ce6-PPy也可以达到较高的升温，从而可以有效的作为光热试剂。并且，升温的程度与BSA-Ce6-PPy浓度呈正相关。

实施例9蛋白-聚吡咯复合物衍生物的光动力活性检测

配制牛血清白蛋白-聚吡咯复合物衍生物(BSA-Ce6-PPy)水溶液，经661nm的激光照射，检测单线态氧含量，分别设立对照组：Ce6水溶液、实施例1制备的蛋白-聚吡咯复合物水溶液、水、牛血清白蛋白水溶液、聚吡咯(传统的合成聚吡咯的方法即以聚乙烯醇为分散剂合成的聚吡咯纳米颗粒PPy-PVA)水溶液。其中，BSA-Ce6-PPy的浓度以Ce6的浓度计为0.0012毫克/毫升，Ce6的浓度为0.0012毫克/毫升，聚吡咯的浓度为0.0057毫克/毫升。

结果如图9所示。Ce6水溶液和BSA-Ce6-PPy水溶液经661nm激光照射后皆产生了单线态氧，可以作为光动力治疗剂。

实施例10细胞水平上蛋白-聚吡咯复合物衍生物的作为光热光动力联合治疗的效果检测

配制不同浓度(以二氢卟吩e6的浓度定量)的牛血清白蛋白-聚吡咯复合物衍生物(BSA-Ce6-PPy)。与4T1细胞孵育24h后采用不同的治疗方式，分别为：

光热治疗(PDT)：808纳米激光照射5min；

光动力治疗(PTT)：661纳米激光照射1h；

光热光动力联合治疗(PDT+PTT)：先采用661纳米激光照射1h后在用808纳米激光照射5min。

然后，采用标准的MTT试剂进行细胞活性检测。结果如图10所示。

结果显示：光热光动力联合治疗后细胞活性降低的最为显著，当达到有效浓度后，光热光动力联合治疗效果显著优于单纯的光热治疗或光动力治疗。表明，本发明提供的BSA-Ce6-PPy能够有效的作为光动力治疗剂或光热治疗剂。而作为光热光动力联合治疗剂应用时具有更加有效的治疗效果。

实施例11蛋白-聚吡咯复合物衍生物作为荧光呈像剂的应用

将本发明提供的牛血清白蛋白-聚吡咯复合物衍生物(BSA-Ce6-PPy)通过尾静脉注射到小鼠体内，在小动物成像系统(CRI)上进行在不同的时间点进行实时采集图片，观察BSA-Ce6-PPy在肿瘤部位的富集量。选用的激发光源是661nm，曝光时间是100ms。结果如图11所示：随着时间的推移，肿瘤区域BSA-Ce6-PPy的荧光信号先逐渐增强，大约6小时后，BSA-Ce6-PPy通过被动靶向的作用，在肿瘤部位的富集量达到最大值。之后肿瘤区域的荧光信号又逐渐减弱，表明BSA-Ce6-PPy被逐渐代谢出去；

将BSA-Ce6-PPy通过尾静脉注射到小鼠体内，6小时后，实验小鼠牺牲，取出重要的器官置于表面皿中，加入细胞裂解液匀浆后去上层清液测荧光，根据荧光的值定量分析出BSA-Ce6-PPy在各个器官内的分布情况。结果如图12所示：结果显示，肿瘤组织中含有BSA-Ce6-PPy的量较大，另外，肝、肾、脾由于存在网状内皮系统，因此，其中含有BSA-Ce6-PPy的量较大，而其他组织，如心、肺、胃、肠、肌肉中则含量较少。

实施例12动物水平上蛋白-聚吡咯复合物衍生物的作为光热光动力联合治疗的效果检测

随机将肿瘤模型小鼠分为两组，其中：

实验组小鼠：通过尾静脉注射实施例2制备的牛血清白蛋白-聚吡咯复合物衍生物(BSA-Ce6-PPy)水溶液；

对照组小鼠：通过尾静脉注射等量注射用水。

分别采用激光照射实验组小鼠和对照组小鼠，分别在0min～5min观察小鼠肿瘤部位的温度变化，每分钟观察一次。观察选用的激发光源是661nm，曝光时间是100ms。实验结果如图13和图14所示。其中，图13示实验组小鼠和对照组小鼠经激光照射后，肿瘤部位发热情况。图14示，实验组小鼠和对照组小鼠经激光照射后，肿瘤部位温度变化。

如图12所示，实验组小鼠肿瘤部位的温度有明显的升高，而对照组小鼠肿瘤的温度升高不明显，不会影响小鼠肿瘤的生长。

将实验组小鼠随机分为3个小组，分别采用光热治疗、光动力治疗、光热光动力联合治疗，连续14天观察并记录模型小鼠的肿瘤相对体积，每两天观察一次。将对照组小鼠也随机分为3个小组，同样分别采用光热治疗、光动力治疗、光热光动力联合治疗，连续14天观察并记录模型小鼠的肿瘤相对体积，每两天观察一次。

光热治疗(PDT)：808纳米激光照射5min；

光动力治疗(PTT)：661纳米激光照射1h；

光热光动力联合治疗(PDT+PTT)：先采用661纳米激光照射1h后在用808纳米激光照射5min。

实验结果如图15所示。其中，结果显示：实验组小鼠的肿瘤在光热和光动力联合治疗作用下，肿瘤生长得到很好的抑制，该效果要显著(p<0.01)优于对照组小鼠，或仅采用光热治疗、仅采用光动力治疗的小鼠。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种蛋白-聚吡咯复合物，其特征在于，由蛋白和聚吡咯组成；

其中，聚吡咯通过原位聚合的方式包裹于所述蛋白表面；

该蛋白-聚吡咯复合物的制备方法为：在催化剂的作用下，吡咯和蛋白在水中发生聚合反应，得到蛋白-聚吡咯复合物；

所述吡咯与所述蛋白的质量比为1:1。

2.根据权利要求1所述的蛋白-聚吡咯复合物，其特征在于，所述蛋白为牛血清白蛋白或转铁蛋白。

3.蛋白-聚吡咯复合物的制备方法，其特征在于，包括：在催化剂的作用下，吡咯和蛋白在水中发生聚合反应，得到蛋白-聚吡咯复合物；所述吡咯与所述蛋白的质量比为1:1。

4.如权利要求1或2所述的蛋白-聚吡咯复合物作为担载光敏剂的载体的应用，或在制备光热治疗剂中的应用；

所述光敏剂用于光热治疗，光动力治疗或荧光成像。

5.一种蛋白-聚吡咯复合物衍生物，其特征在于，由蛋白、二氢卟吩e6和聚吡咯组成；

其中，二氢卟吩e6负载于蛋白上，聚吡咯通过原位聚合的方式包裹于载有二氢卟吩e6的蛋白表面；

其制备方法包括：

步骤1：将N-(3-二甲基氨丙基)-N'-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和二氢卟吩e6溶于二甲亚砜，得到二氢卟吩e6溶液；

步骤2：所述二氢卟吩e6溶液与蛋白水溶液反应，得到中间产物；

步骤3：将所述中间产物与吡咯水溶液混合，在氯化铁的作用下反应得到蛋白-聚吡咯复合物衍生物；

所述吡咯与蛋白的质量比是1:1，蛋白与二氢卟吩e6的摩尔比为1:3。

6.根据权利要求5所述的蛋白-聚吡咯复合物衍生物，其特征在于，所述蛋白为牛血清白蛋白或转铁蛋白。

7.蛋白-聚吡咯复合物衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将N-(3-二甲基氨丙基)-N'-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和二氢卟吩e6溶于二甲亚砜，得到二氢卟吩e6溶液；

步骤2：所述二氢卟吩e6溶液与蛋白水溶液反应，得到中间产物；

步骤3：将所述中间产物与吡咯水溶液混合，在氯化铁的作用下反应得到蛋白-聚吡咯复合物衍生物；

所述吡咯与蛋白的质量比是1:1，蛋白与二氢卟吩e6的摩尔比为1:3。

8.权利要求5或6所述的蛋白-聚吡咯复合物衍生物在制备光热治疗剂、光动力治疗剂、光热光动力联合治疗剂或荧光成像剂中的应用。