CN104586766A - 一种酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂。本发明提供的超氧化物歧化酶制剂中含有超氧化物歧化酶、醇类溶剂、乳化剂和油，借助乳化剂的作用，使分散于醇类溶剂中的超氧化物歧化酶被包裹于油相内，由此获得单相、透明的超氧化物歧化酶油包醇制剂，从而避免了超氧化物歧化酶的降解，增强了超氧化物歧化酶的稳定性，利于其发挥活性功能。本发明进一步提供了所述制剂的制备方法以及应用。本发明提供的制剂稳定性好，且酶的活性稳定，制备方法简单，利于超氧化物歧化酶在食品、保健品、化妆品、医药等领域的应用。

Description

一种酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂

技术领域

本发明涉及制剂领域，具体涉及一种酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂。

背景技术

目前，对于具有抗氧化、清除自由基功能的酶正在被越来越多地应用到化妆品领域。超氧化物歧化酶是一类广泛存在于生物体内的金属酶，是生物体重要的细胞防御系统之一，它能催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，从而能有效清除机体内超氧阴离子自由基，具有抗辐射、抗肿瘤及延缓机体衰老等功能，在保健品、医药和化妆品行业中有重要的应用价值。同多数蛋白质一样，SOD稳定性差，易失活。

研究人员通过化学修饰等手段，以期获得稳定性好的SOD，用于化妆品、医药等领域。但是，超氧化物歧化酶的化学修饰过程复杂，成本高，并且其潜在的安全性问题，亟需提供一种活性稳定的超氧化物歧化酶制剂，以解决其在实际应用中存在的问题。

发明内容

本发明针对超氧化物歧化酶易被降解的缺陷，提供一种酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂，从而充分保证其在实际应用中的稳定性以及活性。

本发明提供了一种酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂。

本发明所述超氧化物歧化酶可以是任意一种亚型，优选为生物技术领域常用的含铜锌辅基的亚型CuZn-SOD。在本发明所述制剂中，为了维持超氧化物歧化酶的活性，还可以根据其它原料的选择和体系的酸碱性加入适量的pH值调节剂，使体系的pH值处在可以保持超氧化物歧化酶活性的范围内。

具体的，本发明提供的酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂，由包括如下步骤的方法制备而成：

1)将0.01～10份超氧化物歧化酶与1～20份醇类溶剂混合，在100～500rpm条件下搅拌，形成透明溶液；

2)将1～30份乳化剂与40～95份油混合，在20～50℃、200～8000rpm条件下搅拌，形成透明液体；

3)将步骤1)和步骤2)所得液体混合，在室温、200～800rpm条件下搅拌，形成均一、透明的液体，即得酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂。

本发明所述份数均为重量份，单位可以是本领域的任意重量单位，如kg、g、mg等。

其中，步骤1)所述超氧化物歧化酶优选为0.1～1份；

步骤1)所述醇类溶剂优选为5～10份；所述醇类溶剂作为亲水性的分散介质，可以使超氧化物歧化酶充分地分散其中。所述醇类溶剂选自乙醇、丙二醇或甘油中的一种或几种，优选为甘油或丙二醇。

步骤2)所述乳化剂优选为5～10份；所述乳化剂可以使亲水性介质均匀悬浮于油相之中。所述乳化剂选自大豆磷脂、蛋黄磷脂、司盘80、聚甘油油酸酯中的一种或几种，优选为大豆磷脂或大豆磷脂与司盘80或/和聚甘油油酸酯的组合物。

步骤2)所述油优选为80～90份；作为连续相包裹在溶解了超氧化物歧化酶的醇类溶剂之外，从而避免了超氧化物歧化酶的降解。所述油选自辛酸/癸酸甘油酯、橄榄油、大豆油、花生油、红花油或油酸中的一种或几种，优选为辛酸/癸酸甘油酯或橄榄油。

作为优选方案，本发明所述制剂由包括以下步骤的方法制备而成：

1)将0.1～1份超氧化物歧化酶与5～10份丙二醇或甘油混合，在100～500rpm条件下搅拌，形成透明溶液；

2)将5～7份大豆磷脂和0～1.5份司盘80或/和聚甘油油酸酯与80～90份辛酸/癸酸甘油酯或橄榄油混合，在20～50℃、200～8000rpm条件下搅拌，形成透明液体；

3)将步骤1)和步骤2)所得液体混合，在室温、200～800rpm条件下搅拌，形成均一、透明的液体，即得超氧化物歧化酶油包醇制剂。

进一步优选地，本发明所述制剂由包括如下步骤的方法制备而成：

1)将0.1～1份超氧化物歧化酶与5～10份甘油混合，在100～500rpm条件下搅拌，形成透明溶液；

2)将5～7份大豆磷脂和0.5～1.5份司盘80与80～90份橄榄油混合，在20～50℃、200～8000rpm条件下搅拌，形成透明液体；

3)将步骤1)和步骤2)所得液体混合，在室温、200～800rpm条件下搅拌，形成均一、透明的液体，即得酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂。

本发明所述步骤1)中，还可以包括将所得溶液的pH值调节至可以保持超氧化物歧化酶活性的范围内，具体为：使用pH调节剂将溶液pH值调节至4～5。

本发明所述pH值调节剂为不影响超氧化物歧化酶活性的任意酸、碱或盐，包括盐酸、硫酸、乳酸、醋酸、枸橼酸、磷酸、三乙胺、氢氧化钠、磷酸氢二钠或磷酸二氢钠中的一种或几种。在加入pH值调节剂之前，当溶液pH值小于4时，使用碱性pH值调节剂将pH值调节至4～5；当溶液pH值大于5时，使用酸性pH值调节剂将pH值调节至4～5，所述酸性调节剂优选为1mol/L盐酸。本发明所述pH值优选为4.5。

作为一种优选方案，本发明所述制剂由包括以下步骤的方法制备而成：

1)将0.1份超氧化物歧化酶与5份甘油混合，在400rpm条件下搅拌，形成透明溶液，用pH值调节剂将溶液pH值调节至4.5；

2)将5份大豆磷脂和0.5份司盘80与89.4份橄榄油混合，在50℃、8000rpm条件下搅拌，形成透明液体；

3)将步骤1)和步骤2)所得液体混合，在室温、800rpm条件下搅拌，形成均一、透明的液体，即得酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂。

本发明进一步保护所述制剂在食品、保健品、化妆品以及药品领域的应用。

本发明提供的制剂稳定性好，且酶的活性稳定，制备方法简单。具体的，本发明提供的技术方案借助乳化剂的作用，使分散于醇类溶剂中的超氧化物歧化酶被包裹于油相内，由此获得单相、透明的超氧化物歧化酶油包醇制剂，从而避免了超氧化物歧化酶的降解，利于超氧化物歧化酶在食品、保健品、化妆品、医药等领域的应用。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

按照以下步骤制备酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂：

1)将0.1g超氧化物歧化酶与5g甘油混合，在400rpm条件下搅拌，形成透明溶液，用1mol/L盐酸将溶液pH值调解至4.5；

2)将5g大豆磷脂、0.5g司盘80与89.4g橄榄油混合，在50℃、8000rpm条件下搅拌，形成透明液体；

3)将步骤1)和步骤2)所得液体混合，在室温、800rpm条件下搅拌，形成均一、透明的液体，即得酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂。

实施例2

按照以下步骤制备酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂：

1)将0.3g超氧化物歧化酶与5.5g甘油混合，在500rpm条件下搅拌，形成透明溶液，用1mol/L盐酸将溶液pH值调解至4.5；

2)将7g大豆磷脂与87.2g橄榄油混合，在20℃、3000rpm条件下搅拌，形成透明液体；

3)将步骤1)和步骤2)所得液体混合，在室温、200rpm条件下搅拌，形成均一、透明的液体，即得酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂。

实施例3

按照以下步骤制备酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂：

1)将1g超氧化物歧化酶与10g丙二醇混合，在100rpm条件下搅拌，形成透明溶液，用1mol/L盐酸将溶液pH值调解至4.5；

2)将7g大豆磷脂、0.5g司盘80、0.5g聚甘油油酸酯与81g辛酸甘油酯混合，在40℃、200rpm条件下搅拌，形成透明液体；

3)将步骤1)和步骤2)所得液体混合，在室温、600rpm条件下搅拌，形成均一、透明的液体，即得酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂。

实施例4

按照以下步骤制备酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂：

1)将0.5g超氧化物歧化酶与7g丙二醇混合，在500rpm条件下搅拌，形成透明溶液，用1mol/L盐酸将溶液pH值调解至4.5；

2)将5g大豆磷脂、1.5g聚甘油油酸酯与86g癸酸甘油酯混合，在30℃、5000rpm条件下搅拌，形成透明液体；

3)将步骤1)和步骤2)所得液体混合，在室温、200rpm条件下搅拌，形成均一、透明的液体，即得酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂。

对比例1：

与实施例1相比，区别仅在于，所述原料中，用聚乙二醇代替甘油。

对比例2：

与实施例1相比，区别仅在于，所述原料中，用吐温80代替大豆磷脂和司盘80组成的乳化剂。

对比例3：

与实施例1相比，区别仅在于，按照以下步骤制备制剂：

将超氧化物歧化酶、甘油、大豆磷脂、司盘80与橄榄油混合，用1mol/L盐酸将pH值调节至4.5，在室温、800rpm条件下充分搅拌即得。

实验例

取各实施例和对比例得的超氧化物歧化酶制剂，分别在37℃、密闭、避光的条件下放置，在第0个月(制备完毕后立即检测)、第0.5个月、第1个月和第3个月，检测各制剂的均一性和酶活性。检测方法如下所述，检测结果如表1所示。

1、均一性检测：用日立U-2001紫外可见分光光度计，在600nm测定各实施例和对比例所得制剂的光密度。本发明提供的超氧化物歧化酶油包醇制剂的均一性可以用光密度表示；光密度反映了光的透过性，光密度数值越低，则光的透过性越好，样品越均一。

2、超氧化物歧化酶活性检测：将待测样品统一稀释至超氧化物歧化酶浓度为0.1mg/ml，利用超氧化物歧化酶试剂盒(总SOD活性检测试剂盒(NBT法)，海门市碧云天生物技术研究所，产品编号S0109)进行检测。该试剂盒检测原理是基于氮蓝四唑显色法(NBT法)，通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子，将氮蓝四唑还原为蓝色的甲臜，后者在560nm处有强吸收，而超氧化物歧化酶可清除超氧阴离子，从而抑制了甲臜的形成；反应液蓝色愈深，说明超氧化物歧化酶活性愈低，反之则酶活性愈高，据此通过比色分析就可以计算出超氧化物岐化酶活性水平。具体的说明和操作步骤，详见该试剂盒的说明书。此处SOD的活性用酶的比活(U/mg)表示。

表1：检测结果

由表1结果可知，本发明提供的酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂在制备后在第0个月、第0.5个月、第1个月和第3个月的光密度值均在0左右，酶的比活没有明显下降，3个月后仍然维持在了3000以上，其中，实施例1所得的制剂的综合性能最佳。经对比可知，对比例1、2、3制备得到的制剂随着时间的推移，稳定性和酶活性均显著下降。综上所述，本发明提供的超氧化物歧化酶制剂的稳定性好，酶活性好，适合实际应用。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂，其特征在于，由包括如下步骤的方法制备而成：

1)将0.01～10份超氧化物歧化酶与1～20份醇类溶剂混合，在100～500rpm条件下搅拌，形成透明溶液；

2)将1～30份乳化剂与40～95份油混合，在20～50℃、200～8000rpm条件下搅拌，形成透明液体；

3)将步骤1)和步骤2)所得液体混合，在室温、200～800rpm条件下搅拌，形成均一、透明的液体，即得超氧化物歧化酶油包醇制剂。

2.根据权利要求1所述的酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂，其特征在于，所述超氧化物歧化酶的重量份为0.1～1份，所述醇类溶剂的重量份为5～10份，所述乳化剂的重量份为5～10份，所述油的重量份为80～90份。

3.根据权利要求1或2所述的酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂，其特征在于，所述醇类溶剂选自乙醇、丙二醇或甘油中的一种或几种。

4.根据权利要求1或2所述的酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂，其特征在于，所述乳化剂选自大豆磷脂、蛋黄磷脂、司盘80、聚甘油油酸酯中的一种或几种。

5.根据权利要求1或2所述的酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂，其特征在于，所述油选自辛酸/癸酸甘油酯、橄榄油、大豆油、花生油、红花油或油酸中的一种或几种。

6.根据权利要求1所述的酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂，其特征在于，由包括如下步骤的方法制备而成：

1)将0.1～1份超氧化物歧化酶与5～10份丙二醇或甘油混合，在100～500rpm条件下搅拌，形成透明溶液；

2)将5～7份大豆磷脂和0～1.5份司盘80或/和聚甘油油酸酯与80～90份辛酸/癸酸甘油酯或橄榄油混合，在20～50℃、200～8000rpm条件下搅拌，形成透明液体；

3)将步骤1)和步骤2)所得液体混合，在室温、200～800rpm条件下搅拌，形成均一、透明的液体，即得超氧化物歧化酶油包醇制剂。

7.根据权利要求1所述的酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂，其特征在于，由包括如下步骤的方法制备而成：

1)将0.1～1份超氧化物歧化酶与5～10份甘油混合，在100～500rpm条件下搅拌，形成透明溶液；

2)将5～7份大豆磷脂和0.5～1.5份司盘80与80～90份橄榄油混合，在20～50℃、200～8000rpm条件下搅拌，形成透明液体；

3)将步骤1)和步骤2)所得液体混合，在室温、200～800rpm条件下搅拌，形成均一、透明的液体，即得超氧化物歧化酶油包醇制剂。

8.根据权利要求1、2、6或7所述的酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂，其特征在于，所述步骤1)还包括用pH值调节剂将溶液pH值调节至4～5。

9.根据权利要求1所述的酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂，其特征在于，由包括如下步骤的方法制备而成：

1)将0.1份超氧化物歧化酶与5份甘油混合，在400rpm条件下搅拌，形成透明溶液，用pH值调节剂将溶液pH值调节至4.5；

2)将5份大豆磷脂和0.5份司盘80与89.4份橄榄油混合，在50℃、8000rpm条件下搅拌，形成透明液体；

3)将步骤1)和步骤2)所得液体混合，在室温、800rpm条件下搅拌，形成均一、透明的液体，即得超氧化物歧化酶油包醇制剂。

10.权利要求1～9任意一项所述酶活性稳定的超氧化物歧化酶制剂的应用。