CN104583408A - 用于降低免疫测定的干扰且稳定免疫测定的分子伴侣-分子伴侣融合多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含几个分子的折叠辅助多肽的融合多肽,其包含一个多聚化结构域(特别是Skp)和至少一个分子的SlyD或SlpA,其中没有进一步的目标多肽序列融合至所述融合多肽。本发明进一步涉及免疫测定和所述融合多肽在免疫测定中用于降低干扰或尽可能减少假阳性结果或用于稳定蛋白测定试剂的用途。进一步,本发明涉及用于免疫测定中使用的试剂盒,其包含所述融合多肽。
Description
发明领域
本发明涉及包含几个分子的折叠辅助多肽的融合多肽,其包含一个多聚化结构域(特别是Skp)和至少一个分子的SlyD或SlpA,其中没有进一步的目标多肽序列融合至所述融合多肽。本发明进一步涉及免疫测定和所述融合多肽在免疫测定中用于降低干扰或尽可能减少假阳性结果或用于稳定蛋白测定试剂的用途。进一步,本发明涉及用于免疫测定中使用的试剂盒,其包含所述融合多肽。
发明背景
分子伴侣,其已知为经典折叠辅助分子,是帮助其他蛋白的折叠和结构完整性的维持的蛋白。它们结合蛋白的变性或疏水性表面,并且帮助复性且保持蛋白溶解。由于它们优异的物理化学特性,分子伴侣在蛋白技术中被用作折叠助手和融合伴侣。一类分子伴侣是FKBP分子伴侣(结合免疫抑制剂药物FK506的蛋白)的家族。
FKBP分子伴侣如SlyD、FkpA和SlpA (= SlyD-样蛋白A)作为困难蛋白的融合伴侣的用途已得到广泛描述 (WO 2003/000878、WO 2009/074318、EP
2127679)。
用于检测针对病原体如,例如,人免疫缺陷病毒(HIV)、风疹病毒、巨细胞病毒(CMV)或单纯疱疹病毒(HSV)的抗体的市售免疫测定含有多肽融合蛋白,其中分子伴侣融合至特定目标抗原序列。此类融合蛋白描述于,例如,Scholz等人, J. Mol. Biol. (2005) 345, 1229-1242,Scholz等人, Biochemistry
(2006) 45, 20-33或Scholz等人, Biochemistry (2008) 47, 4276-4287。
SlyD、FkpA和SlpA具有突出的增溶(即分子伴侣)特性,并且特征在于它们能够在化学或热诱导的解折叠后可逆地再折叠。作为困难目标多肽的融合伴侣,它们发挥至少三重作用:首先,它们增加在原核生物中异源过表达的目标蛋白的产生,其次,它们促进和帮助目标多肽的体外再折叠,且第三,它们增加各目标多肽的总体溶解度和稳定性。
然而,分子伴侣如SlyD、FkpA和SlpA以其自身即为免疫原。因为它们是丰富的细菌蛋白,所以它们被人(或一般而言,哺乳动物)免疫系统识别为非自身的,引发强有力的体液免疫应答,这导致产生具有高亲和力的特异性抗体。因此,相当百分比的成人血清含有针对这些分子伴侣的显著免疫球蛋白滴度。作为结果,存在很大可能性人血清样品可在免疫测定(特别是使用融合至细菌分子伴侣模块的抗原特定物(antigen specifiers)的双抗原夹心形式的免疫测定)中变成假阳性。
为了避免由于融合伴侣的抗体诱导的桥接(bridging)导致的此类不希望的交叉反应,通常以不对称的方式设计免疫测定。这意味着,例如在以众所周知的双抗原夹心形式(DAGS)设计的用于检测抗体的免疫测定中,本领域技术人员对于测定的两侧上的应用抗原使用不同的融合伴侣以避免非特异性桥接。如果相同融合伴侣用于固相和检测侧上的抗原,则样品中的干扰组分可以建立所述相同融合伴侣之间的桥接,从而引发(假)阳性反应。
作为防止不希望结合至作为抗原融合蛋白的一部分的融合伴侣的进一步方式,通常将化学聚合形式的所采用的融合模块(即没有任何特异性抗原的融合部分)以大过量添加至测定中。由于它们的高表位密度和它们的高有效浓度,这些化学聚合的融合模块优选引诱、结合和猝灭针对所述融合模块的那些IgG和IgM。化学聚合的融合模块充当诱饵,并且它们非常有效地猝灭样品中的干扰化合物,使得干扰可以受到抑制并排除。当,例如,大肠杆菌SlyD用作双抗原夹心类型的免疫测定中的给定抗原的融合伴侣时,高度建议生成化学聚合的大肠杆菌SlyD(借助于与例如戊二醛交联)且将该聚合物作为抗干扰物质添加至测定。
然而,使用化学聚合蛋白的相当大的缺点在于化学产生过程本身。根据应用的交联剂,化学聚合过程不是完全可重复的。化学交联的聚合物通常显示不同大小的聚合物的大分布,即它们在连接性方面强烈变化,并且它们的特征在于相当大的异质性。为了选择有效的聚合物级分(即具有所需抗干扰能力的聚合物级分),聚合物合并物需要通过费时且麻烦的层析方法纯化和分级分离。此外,仅仅可以获得有限的产率,因为仅仅小百分比的产物将洗脱在期望的级分中。
为了克服在免疫测定中使用未充分表征的化学聚合的材料的障碍,我们搜索替代方式来生成抗干扰物质。我们努力获得简单且方便的方式的具有足够高且良好定义的表位密度的抗干扰模块。因此,我们致力于是否可能以完全重组的方式生成良好定义、高度可溶且高度有效的抗干扰模块的问题。简而言之,待解决的问题是以可重复且可标准化的方式获得具有高表位密度的可溶形式的分子伴侣融合伴侣。
发明概述
所述问题通过如权利要求表征的本发明解决。具体而言,本发明涉及包含几个分子的折叠辅助多肽的融合多肽,其包含一个多聚化结构域和至少一个分子的SlyD或SlpA,其中没有进一步的目标多肽序列融合至所述融合多肽。作为优选的多聚化结构域,使用Skp。优选地,一个分子的Skp融合至两个相邻分子的SlyD或两个相邻分子的SlpA。在另一个优选实施方案中,一个分子的Skp N末端融合至两个相邻分子的SlyD或两个相邻分子的SlpA,或融合至充当融合伴侣的另一个单体分子伴侣。术语“N末端融合的”意指,Skp融合至另一蛋白分子的N末端,在该情况下,融合至SlyD或SlpA的N末端。以进一步优选的方式,根据本发明的融合多肽包含SEQ ID NO. 1,其也可以被命名为Skp-串联-SlyD或Skp-SlyD-SlyD。优选的融合多肽是由SEQ
ID NO. 1 (Skp-串联-SlyD)组成的多肽。进一步优选的融合多肽是包含SEQ
ID NO. 9的多肽,其也可以被命名为Skp-串联-SlpA或Skp-SlpA-SlpA。特别优选的是由SEQ ID NO. 9组成的多肽。
本发明的另一个实施方案是融合多肽作为免疫测定中的添加剂或作为测定试剂的添加剂的用途,使得所述融合多肽可以用于降低干扰或用于尽可能减少假阳性结果。根据本发明,所述融合多肽还可以用于增加测定试剂中蛋白成分的溶解度。本发明的一个进一步优选实施方案还考虑包含所述融合多肽的用于通过免疫测定检测分离样品中的分析物的试剂盒。
在一个进一步优选的实施方案中,考虑用于检测分离样品中的分析物的方法,其中如上表征的融合多肽用作用于降低干扰或尽可能减少假阳性结果的试剂。
本发明的另一个实施方案是用于检测分离样品中的分析物,诸如,例如,抗体的方法,所述方法包括
a) 通过混合体液样品与特异性结合伴侣形成免疫反应混合物,所述特异性结合伴侣可以被所述样品中存在的所述分析物特异性结合
b) 在将所述特异性结合伴侣添加至所述样品之前、同时或之后,将根据本发明的融合多肽添加至所述免疫反应混合物
c) 保持所述免疫反应混合物一段时期,所述时期足以允许所述体液样品中存在的所述分析物与所述特异性结合伴侣免疫反应,以形成免疫反应产物;和
d) 检测任何所述免疫反应产物的存在和/或浓度。
本发明的一个进一步方面是用于通过免疫测定检测分离样品中的分析物、具体而言用于检测抗体的试剂盒,所述试剂盒包含根据本发明的融合多肽。试剂盒的其他成分对于本领域技术人员是已知的,并且包括特异性结合试剂,诸如例如抗原。进一步试剂盒组分是缓冲剂、防腐剂、标记物质和使用说明书。
附图简述
图1至7显示表1a-c、2a-c和3(参见实施例3),其呈现融合多肽在用于检测HIV抗gp41抗体的免疫测定中的抗干扰活性的结果。
详细而言,图1显示表1a。
图2显示表1b。
图3显示表1c。
图4显示表2a。
图5显示表2b。
图6显示表2c。
图7显示表3。
图8显示如在近UV区以280 nm的检测波长监测的Skp-SlyD-SlyD的热诱导的解折叠和再折叠。
图9显示250-330 nm范围内Skp-SlyD-SlyD的近UV CD光谱(参见实施例5)。
图10显示表4,其呈现融合多肽在用于检测抗HSV2抗体的免疫测定中的抗干扰活性的结果(参见实施例4)。
图11显示250-330 nm范围内Skp-SlpA-SlpA的近UV CD光谱(参见实施例5)。
SEQ
ID NO. 1显示Skp-串联-SlyD或Skp-SlyD-SlyD的氨基酸序列。已经添加Skp和SlyD单元之间的富含甘氨酸的间隔区(加下划线)以实现融合伴侣的最大柔性,并确保Skp单元可形成有序的三聚体,而不具有对C末端融合的SlyD蛋白的任何干扰。已经添加额外的C末端八组氨酸标签用于纯化目的(参见实验部分)。SEQ ID NO. 1包含串联形式的大肠杆菌SlyD(完整分子参见SEQ
ID NO. 3)的氨基酸残基1-165,即排成一列的两个大肠杆菌SlyD(1-165)。
SEQ
ID NO. 2显示根据SwissProt登录号P11457的大肠杆菌Skp (161 aa)的完整氨基酸序列。对于根据本发明的融合多肽,去除大肠杆菌Skp的信号序列(aa 1-20),以便确保目标分子产生并保留在过度产生的原核宿主(overproducing
prokaryotic host)的胞质溶胶中。优选地,使用大肠杆菌Skp的成熟形式,即下面列出的序列的aa 21-161。
SEQ
ID NO. 3代表完整的大肠杆菌SlyD氨基酸序列(196个氨基酸残基),其也可经由SwissProt数据库中的ID P0A9K9获得。对于根据本发明的融合多肽,优选地使用大肠杆菌SlyD的C末端截短版本,其跨越下面列出的序列的氨基酸残基1-165。
SEQ
ID NO. 4显示富含甘氨酸的间隔物(spacer)的氨基酸序列(包含由丝氨酸隔开的三联甘氨酸单元),其可以用作几个分子伴侣部分之间的柔性、可溶性且蛋白酶抗性的间隔物或接头。
SEQ
ID NO. 5显示八组氨酸标签或“His标签”(包含八个组氨酸单元)的氨基酸序列,其可添加至蛋白的C-末端,以允许Ni-NTA辅助的蛋白纯化。
SEQ
ID NO:6显示也经由SwissProt数据库登录号P45523可获得的FkpA的完整氨基酸序列(270 aa)。对于根据本发明的融合多肽,去除大肠杆菌FkpA的信号序列(aa
1-25),以便确保目标分子产生并保留在过度产生的原核宿主的胞质溶胶中。优选地,使用大肠杆菌FkpA的成熟形式,即下面列出的序列的aa 26-270。
SEQ
ID NO. 7显示从SwissProt数据库登录号P0AEM0获得的大肠杆菌SlpA的完整氨基酸序列(149个氨基酸)。
SEQ
ID NO. 8显示根据Swiss Prot ID: Q9CKP2的多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)SlyD(全长)的氨基酸序列。
SEQ
ID NO. 9显示Skp-串联-SlpA或Skp-SlpA-SlpA的氨基酸序列。已添加Skp和SlpA单元之间的富含甘氨酸的间隔区(spacer region)
(加下划线)以实现融合伴侣的最大柔性,并确保Skp单元可形成有序的三聚体,而不具有对C末端融合的SlpA蛋白的任何干扰。已经添加额外的C末端六组氨酸标签用于纯化目的。SEQ ID NO. 9包含串联形式的大肠杆菌SlpA(完整分子参见SEQ
ID NO. 7,但缺乏N末端甲硫氨酸和C末端丙氨酸)的氨基酸残基2-148,即排成一列的两个大肠杆菌SlpA (2-148)。
发明详述
在使用含有SlyD融合模块的稀有试剂的市售免疫测定中,通常添加化学交联的分子伴侣分子诸如串联SlyD(两个分子的SlyD,经由短肽序列连接,借助于戊二醛聚合)用于降低干扰。如背景部分所提及,由于生产过程,这些化学交联的添加剂是相当异质的,并且不能在令人满意的产率情况下以严格可重现的方式提供。
尽管以前已经非常详细地描述了其中分子伴侣融合至特定目标抗原序列的多肽融合蛋白的用途(参见本发明的背景),但现有技术没有提及如何克服免疫测定中的干扰。WO
2003/000878描述了FkpA作为分子伴侣,其以可以融合至目标多肽序列的寡聚物的形式发挥其功能。EP
1982993公开了包含至少一个多聚化结构域和多个拷贝的来自病原体的表位区段的融合多肽。这些多肽作为特定抗原目标序列应用。然而,消除由于结合分子伴侣模块且因此引起假阳性结果的交叉反应抗体导致的干扰的问题至今没有得到解决。
令人惊讶的是,通过将分子伴侣多聚化结构域融合至至少一个分子的SlyD或SlpA,我们已经能够产生高度有效的抗干扰剂。最重要的是,在某些血清中,化学交联的现有技术试剂不能有效地尽可能降低或抑制暗示阳性结果的显著背景信号,而根据本发明的融合多肽能够通过降低干扰抑制高背景信号。当作为抗干扰试剂添加至样品时,无一真阳性样品被显著影响,即包含抗-HIV抗体的真阳性样品总是被检测为阳性样品。
出乎意料的是,通过将分子伴侣多聚化结构域融合至至少一个分子的SlyD或SlpA,我们已经能够产生形成规则三聚体的良好折叠的高度可溶的人工嵌合蛋白。远非不言而喻的是,经由柔性接头区段融合两个分子伴侣得到可溶的且功能性的蛋白,其中组分主要维持它们的真正特性。因为分子伴侣诸如Skp、SlyD和SlpA具有已经进化为识别且可逆地结合疏水蛋白表面的多肽结合位点,并且由于这些多肽结合位点本身是疏水性质,所以非常可能两个分子伴侣的多肽结合位点结合且彼此饱和,导致用于表位呈递目的价值有限的锁定复合物(locked
complexes)。也已经可以想象的是,两个(立体上有要求的)SlyD单元融合至Skp的C末端损害了Skp的结构完整性,并且可能废除Skp的固有三聚化。
但是,我们发现的是Skp-SlyD、Skp-SlyD-SlyD和Skp-SlpA-SlpA的确形成规则三聚体,其是高度稳定的且可溶的,并且其显示 - 即使它们是寡聚的 - 主要可逆的折叠行为。也已经可以想象的是,由于疏水性多肽结合区域(其由分别Skp和SlyD或SlpA的共价融合变得密切靠近)的高有效浓度,人工融合多肽(即两个不相关的分子伴侣的组合)的溶解度变差。令我们惊讶的是,相反情况是真实的:Skp-SlyD-SlyD具有突出的溶解度,并且它可以被浓缩至> 100 mg/ml (在50 mM磷酸钾pH 7.0,250 mM KCl,0.5
mM EDTA中),而无任何聚集倾向。当来自此类浓缩溶液的Skp-SlyD-SlyD在Superdex 200柱上进行分析凝胶过滤时,融合多肽洗脱在单一对称峰中,这指向完全可溶且稳定的三聚体。
Skp-SlyD-SlyD不仅高度可溶,而且其再折叠行为也是可逆的。以下事实强调了这一点:我们能够制定纯化方案,所述纯化方案包括基质偶联再折叠的步骤:目标分子以解折叠形式经由其C末端八组氨酸标签结合至Ni-NTA支持物。尽管它仍然结合固体支持物,但简单缓冲液改变使其再折叠。随后,再折叠蛋白由咪唑脉冲(imidazole
pulse)洗脱。令我们惊讶的是,在咪唑洗脱时,洗脱的Skp-SlyD-SlyD单体几乎定量地形成可溶性三聚体。对我们而言,令人震惊的是,三聚体蛋白诸如Skp-SlyD-SlyD的基质偶联再折叠运作如此好,且具有令人印象深刻的高产率。我们发现对于Skp-SlpA-SlpA同样如此:非常类似于Skp-SlyD-SlyD,Skp-SlpA-SlpA可以大量获得自大肠杆菌过度产生菌株,并且它可以通过基质辅助再折叠以良好有序的三聚体形式复性。而且,十分类似于其SlyD对应物,Skp-SlpA-SlpA是高度可溶的,并且具有非常有利的理化特性。
根据本发明,当所述融合多肽用于干扰降低或蛋白稳定时,所获得的融合多肽 - 不像现有技术中所述的融合多肽 - 不含进一步目标多肽抗原序列。它不作为特异性抗原多肽用于结合分析物分子诸如抗体。重要的是,样品中存在的分析物 - 如例如针对病原体的抗体 - 不结合本发明的融合多肽。因此,目标多肽序列如源自哺乳动物病原体如病毒、细菌、单细胞或多细胞寄生虫的抗原序列不是融合多肽的部分。
根据本发明的融合多肽可以以可重复的方式以同质的级分以高产率获得。它具有良好定义的表位密度,这对于识别、结合和猝灭IgG和IgM类型的干扰因子是必要且充分的。融合多肽能够以不仅等效而且优于现有技术的化学产生试剂的方式抑制免疫测定中的假阳性反应。其产生过程是直接、简单且易于标准化的,并且必然导致具有优异抗干扰特性的良好定义的同质融合多肽的高产率。
根据本发明,融合多肽优选包含一个多聚化结构域。多聚化结构域是介导和支持含有该多聚化结构域的几个蛋白亚基的非共价结合的结构域。例如,二聚化结构域是触发两个亚基结合的结构域,三聚化结构域是支持三个亚基的非共价结合的结构域等等。
融合多肽的第二部分是至少一个分子的SlyD,优选大肠杆菌SlyD,但也可以使用来自其他生物的SlyD分子,例如,如多杀巴斯德菌SlyD(参见SEQ ID NO. 8)。进一步优选的是融合多肽,其中一个分子的Skp融合至两个相邻分子的SlyD。在本发明的另一个实施方案中,其他单体分子伴侣诸如SlpA也适合作为融合至单一多聚化结构域的融合伴侣。
本发明的进一步方面是上述融合多肽用于降低干扰或用于尽可能减少假阳性结果的用途。可以在将所述特异性结合伴侣体添加至样品之前、同时或之后,将本发明的融合多肽添加至免疫测定混合物(包含样品和特异性结合样品中的分析物的结合伴侣)。优选地,在使含有分析物(例如抗体)的体液样品与特异性结合伴侣(在这种情况下,特异性结合伴侣将是抗原)接触之前,将融合多肽添加至测试试剂。
用于检测分析物的免疫测定的各种形式和原理以及不同的检测模式已经广泛地描述,并且对于本领域技术人员是熟悉的。特别感兴趣的是其中分析物是抗体的免疫测定。优选地,根据本发明的免疫测定检测针对以下的抗体:哺乳动物病毒或细菌病原体,诸如例如甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒,HIV(人免疫缺陷病毒),HSV(单纯疱疹病毒),HTLV(人T细胞白血病病毒),EBV (EB病毒),风疹病毒,CMV(巨细胞病毒),梅毒螺旋体(Treponema pallidum)或伯氏疏螺旋体(Borrelia
burgdorferi)。
本发明在实施例部分进一步说明。
实施例
实施例
1
:融合多肽的制备
Skp/SlyD
分子伴侣融合多肽的克隆和纯化
表达盒的克隆
为了生成合适的表达构建体,通过两步克隆策略将编码EcSkp-EcSlyD-EcSlyD的表达盒连接入表达质粒pQE80L (Qiagen, Hilden, Germany)。
大肠杆菌Skp (EcSkp)的序列从SwissProt数据库(SwissProt ID P0AEU7)中检索。在第一步中,包含来自表达载体pQE80L的SD序列、成熟Skp分子伴侣氨基酸21-161的编码序列(省略跨越氨基酸残基1-20的信号肽,框内(in frame)添加ATG起始密码子(甲硫氨酸))与富含甘氨酸的接头区域的部分以及用于限制性内切核酸酶EcoRI (5’末端)和BamHI (3’末端)的合适的识别位点的合成基因购自Sloning
(Vaterstetten, Germany)。合成的489 bp DNA片段用各自的限制性内切核酸酶水解,并连接至EcoRI/BamHI打开的表达载体pQE80L中,在T5启动子(PT5)的控制下。
其次,编码经由富含甘氨酸的接头区连接的两个大肠杆菌SlyD单元(EcSlyD,残基1-165,SwissProt登录号P0A9K9)且包含N-末端的其他接头区的部分以及用GGGS基序连接至C末端的八His标签的进一步的合成基因同样购自Sloning
(Vaterstetten, Germany)。将BamHI和HindIII限制性位点分别在该盒的5’和3’末端添加。设计基因和限制性位点以便通过简单连接使EcSlyD-EcSlyD部分框内融合至EcSkp部分的5’末端。因此,1146 bp跨越片段用限制性内切核酸酶BamHI和HindIII水解,并连接至BamHI/HindIII打开的含有Skp的载体pQE80L。
连接后,大肠杆菌XL1Blue (Stratagene, La Jolla, CA, USA)的感受态细胞用各个DNA转化。从合适的转化体制备质粒后,通过序列分析再次证实表达构建体的正确性。所得表达质粒已被命名为pQE80Skp-diSlyD。
下图展示了包含通过富含甘氨酸的接头区连接的一个大肠杆菌Skp分子伴侣单元和两个大肠杆菌SlyD分子伴侣单元和随后为允许Ni-NTA辅助的蛋白纯化的C末端八His标签的全长融合多肽EcSkp-EcSlyD-EcSlyD的示意图。
(富含甘氨酸的接头区),参见SEQ ID NO.: 4
参见SEQ ID NO.: 5
所需融合多肽的完整氨基酸序列显示于SEQ ID No. 1。
编码迭代SlyD构建体(SlyD,
SlyD-SlyD, SlyD-SlyD-SlyD…)的表达盒已经如Biochemistry (2006) 45, 20-33中所述进行克隆。编码Skp-SlpA-SlpA融合多肽的表达盒已经根据Scholz等人, J. Mol. Biol. (2005) 345, 1229-1242生成。
Ec
Skp-EcSlyD-EcSlyD
在大肠杆菌宿主中的重组表达
为了获得足够量的推定的抗干扰多肽,在大肠杆菌中重组表达EcSkp-EcSlyD-EcSlyD。为了这个目的,大肠杆菌BL21密码子+的感受态细胞(Merck (Novagen®), Darmstadt, Germany)用生成的表达构建体pQE80Skp-diSlyD转化。
50 mL补充氨苄青霉素(100 µg/mL)的SB培养基(32.0 g蛋白胨,20.0 g酵母提取物,5.0 g NaCl和1000
mL A. dest.)用携带pQE80Skp-diSlyD质粒的单个菌落接种,并且在37 ℃ (250 rpm)孵育过夜。随后,1.5 L SB培养基(+ 100 µg/mL氨苄青霉素)用过夜培养物接种直到~0.5的O.D.600。在~3.0的O.D.600,胞质溶胶过表达通过添加0.5
mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至培养物进行诱导。诱导后四小时,细胞通过离心(20
min,6000 g)收获并储存在-20℃。
在诱导之前和之后四小时取0.4 O.D.600的等分试样,并且通过SDS-PAGE分析测试全细胞提取物的EcSkp-EcSlyD-EcSlyD的表达。发现目标分子的过度产生是高丰度的。
SlyD和SlpA融合蛋白的过表达如Scholz等人, J. Mol. Biol. (2005) 345, 1229-1242和Scholz等人, Biochemistry
(2006) 45, 20-33所述实施。
Skp/SlyD/SlpA
多肽融合体的纯化
Skp/SlyD多肽融合体和SlyD和SlpA融合蛋白通过使用几乎相同的方案纯化。对于细胞裂解,将冷冻的沉淀重悬浮在冷却的50 mM磷酸钠pH 8.0、7.0 M GdmCl、5 mM咪唑中,并将悬浮液在冰上搅拌至少2小时,以完成细胞裂解。在离心和过滤(0.45 µm/0.2 µm)后,将粗裂解物应用至用包括5.0 mM TCEP的裂解缓冲液平衡的Ni-NTA柱上。随后的洗涤步骤针对各个目标蛋白进行定制,范围为5-15 mM咪唑(在50 mM磷酸钠pH 8.0、7.0 M GdmCl、5.0
mM TCEP中)。应用至少10-15体积的洗涤缓冲液。然后,通过50 mM磷酸钾pH
8.0、100 mM KCl、10 mM咪唑、5.0 mM TCEP替代GdmCl溶液,以诱导基质结合蛋白的构象再折叠。为了避免共纯化的蛋白酶的再活化,将蛋白酶抑制剂混合物(Complete®,无EDTA,Roche)包括在再折叠缓冲液中。在过夜反应中应用总共15-20个柱体积的再折叠缓冲液。然后,通过用3-5个柱体积的50 mM磷酸钾pH 8.0、100 mM KCl、10 mM咪唑洗涤去除TCEP和Complete®无EDTA的抑制剂混合物。随后,将咪唑浓度 - 仍然在50 mM磷酸钾pH 8.0, 100 mM
KCl – 对于EcSkp-EcSlyD融合蛋白升至60-70 mM,对于EcSkp-EcSlpA-EcSlpA升至50 mM,且对于SlyD融合多肽升至30 mM,以去除非特异性结合的蛋白污染物。然后通过在相同缓冲液中的500
mM咪唑洗脱天然蛋白。通过Tricine-SDS-PAGE评价含蛋白级分的纯度,并且合并。最后,对蛋白进行大小排阻层析(Superdex HiLoad, Amersham
Pharmacia),合并含蛋白级分,并在Amicon单元(YM10)中浓缩至10-20 mg/ml。
在偶联的纯化和再折叠方案之后,根据各个目标蛋白,可从1 g大肠杆菌湿细胞获得约15-25
mg的蛋白产量。
实施例
2
光谱测量
用Uvikon XL双束分光光度计进行蛋白浓度测量。使用Pace
(1995), Protein Sci. 4, 2411-2423描述的程序测定摩尔消光系数(ε280)。对于EcSkp-EcSlyD-EcSlyD,使用13410 M-1cm-1的摩尔消光系数(ε M280),对于EcSkp-EcSlyD,使用7450 M-1cm-1的摩尔消光系数(ε M280)。对于EcSkp-EcSlpA-EcSlpA,使用4470 M-1cm-1的摩尔消光系数(ε M280)。对于重复大肠杆菌SlyD构建体SlyD、SlyD-SlyD、SlyD-SlyD-SlyD、SlyD-SlyD-SlyD-SlyD 和SlyD-SlyD-SlyD-SlyD-SlyD,使用5960 M-1cm-1、11920 M-1cm-1、17880 M-1cm-1、23840 M-1cm-1和29800 M-1cm-1的摩尔消光系数。
实施例
3
SlyD
多肽融合蛋白的抗干扰活性
在自动化的Elecsys® 2010分析仪(Roche Diagnostics GmbH)中评价SlyD多肽融合蛋白的抗干扰活性。Elecsys®是Roche集团的注册商标。以双抗原夹心形式进行测量。
在Elecsys® 2010中的信号检测基于电化学发光。将生物素-缀合物(即捕获-抗原)固定在包被链霉抗生物素蛋白的磁珠表面上,而检测-抗原携带复合的钌阳离子(在氧化还原态2+和3+之间切换)作为信号传导部分。在存在特异性免疫球蛋白分析物的情况下,发色钌复合物与固相桥接,并在激发后于铂电极处发射620
nm的光。信号输出为任意光单位。
重组抗干扰SlyD多肽以双抗原夹心(DAGS)免疫测定形式进行评价。为此,EP 1 402 015中公开的FkpA-FkpA-gp41和SlyD-SlyD-gp41分别用作生物素和钌缀合物,以特异性检测人血清中的抗gp41抗体。gp41是HIV的免疫显性抗原,并且gp41胞外域的可溶性变体 - 如EP 1 402 015中所述 - 是用于检测HIV感染的宝贵工具。FkpA-FkpA-gp41-生物素和SlyD-SlyD-gp41-钌以各750
ng/ml的浓度用于R1(试剂缓冲液1)和R2(试剂缓冲液2)中。
在第一个实验中,HIV阴性的Trina血清用前述DAGS免疫测定设置进行评价。为了得到假阳性的发生率的提示,在SS-螺旋(GDA,P),GDA-交联的可溶性异质SlyD聚合物(其用作抗干扰物质)不存在和存在的情况下进行评价。将SS-螺旋(GDA,P)以大过量(25 µg/ml)添加至R1(含有生物素缀合物的试剂缓冲液1)。然后将60 µl R1(试剂缓冲液1、生物素缀合物和抗干扰SlyD聚合物)、60 µl R2(试剂缓冲液2,钌缀合物)、30 µl样品(人血清)和50 µl珠粒悬浮液混合并孵育,以得到大致200 µl的反应体积。
表1a-c(图1-3)表明在抗干扰聚合物不存在的情况下升高(假阳性)信号的高发生率。即使两种不同的分子伴侣,诸如SlyD和FkpA,用在双抗原夹心免疫测定的两侧,我们也发现了在人血清的充分表征的实验对象组(Trina
Bioreactives AG, Nänikon, Switzerland)(对其已明确排除HIV感染)中许多显著升高的信号。该发现的原因在于,SlyD和FkpA,尽管不同,却是属于分子伴侣的FKBP家族且共有高度保守的FKBP结构域的相关分子。免疫交叉反应的发生可能正是经由该共有基序,引发高信号,且因此在HIV测定中假装阳性结果。将化学聚合抗干扰物质SS-螺旋(GDA,P)添加至测定混合物将升高的信号降低至正常阴性值。表1 c(图3)显示,甚至非常强的干扰,即高假阳性,也可以通过添加SS-螺旋(GDA,P)有效地消除。表1 a-c(图1-3)中显示的结果的底线如下:由于DAGS免疫测定中的融合伴侣导致的干扰是频繁的,并且它们可以通过添加一种融合伴侣的交联的聚合物变体而有效地减轻。
表2a-c(图4-6)说明了不同的重组SlyD变体的抗干扰能力。来自Trina实验对象组(Trina Bioreactives AG, Nänikon, Switzerland)的五种HIV阴性血清、五种抗HIV阳性血清和两种假阳性血清用所述FkpA-FkpA-gp41-生物素和SlyD-SlyD-gp41钌进行评价。所述测定在不同抗干扰候选不存在和存在的情况下进行。将所研究的抗干扰模块以5 µg/ml和25 µg/ml的浓度添加至R1(试剂缓冲液1),以揭示可能的剂量效应。SS-螺旋(GDA,P)被包括在实验中作为阳性参考(即非常适合和有效的抗干扰模块)。没有抗干扰添加剂(表2a,V0),假阳性的Trina血清的信号总计为几乎60,000个计数,强烈暗示作为HIV感染的结果的高抗gp41抗体滴度。然而,在添加SS-螺旋(GDA,P)后,假阳性信号降低至HIV阴性血清的水平(表2a,V1)。当添加Skp-SlyD时,假阳性信号也显著降低,但它们仍然升高 – 甚至在25 µg/ml存在的情况下 - 并且是强烈误导性的,因为它们表明健康个体中的HIV感染(表2a,V2)。然而,当添加Skp-SlyD-SlyD时,假阳性信号降低至HIV阴性血清的信号水平(表2a,V3)。Skp-SlyD-SlyD在其抗干扰能力的方面变得与化学聚合的SS-螺旋(GDA,P)一样有效。显然,Skp-SlyD-SlyD的表位密度足够高,足以有效地结合且猝灭据推测属于免疫球蛋白的IgM类型的干扰因子。重组产生的模块诸如Skp-SlyD-SlyD与交联的SlyD聚合物诸如SS-螺旋(GDA,P)的等效性(关于抗干扰)是我们实验的令人震惊的结果。
在表2b(图5)中,显示两个对照:不但添加单独的大肠杆菌SlyD没有缓解测试的两种Trina干扰血清的假阳性信号,而且添加单独的大肠杆菌Skp也没有对假性升高的信号具有任何有利的影响(表2b,V4和V5)。甚至在高达25 µg/ml的浓度,任何单一组分都没有能够影响假阳性信号。然而,组合地,作为Skp-SlyD-SlyD融合多肽,Skp和SlyD构成了强大的抗干扰工具(表2a(图4),V3)。单一单体大肠杆菌SlyD不能应付Trina血清16097448和47101943的干扰,强烈表明,各干扰因子属于免疫球蛋白的M类型(IgM)。显然,伴随较高有效SlyD浓度的较高表位密度对于有效结合和猝灭干扰因子是强制性的。
为了关键性地挑战这个假设,我们进行了表2c(图6)中显示的进一步抗干扰研究。作为分析工具,我们使用已经通过如Biochemistry (2006) 45, 20-33中所述的标准克隆技术生成的大肠杆菌SlyD聚合物。简而言之,大肠杆菌SlyD单元通过柔性的富含甘氨酸和丝氨酸的接头连接以形成一排。多达五个SlyD单元在单一融合多肽中是可行的,在大肠杆菌中具有令人满意的表达产率和方便的纯化程序。
表2c(图6)说明对于有效抗干扰需要高SlyD表位密度,并且它指向以下事实:我们可以利用亲合力(avidity)效应(亲合力意指当多价结合分子诸如IgM分子遇到聚合基质诸如聚合的SlyD时发生的高表观亲和力)。无任何抗干扰添加剂,Trina干扰血清16097448和47101943的信号分别总计为59827和53491个计数,并且明确暗示抗gp41抗体的存在,即使所述血清已明确证实为抗HIV阴性。当将串联SlyD
(SlyD-SlyD)以25 µg/ml的浓度添加至R1(试剂缓冲液1)时,信号保持几乎不受影响(表2c,V8)。当将三重SlyD(SlyD-SlyD-SlyD)以25
µg/ml的浓度添加至R1时,信号降低为~
4000个计数(表2c,V7)。尽管被强烈猝灭,剩余信号仍然会假装阳性结果。然而,当将五重SlyD
(SlyD-SlyD-SlyD-SlyD-SlyD)以仅5 µg/ml的浓度添加至R1时,信号降低与通过以相同浓度添加化学聚合的SS-螺旋(GDA,P)实现的信号降低是相当的(表2a,V1;表2c,V6)。换言之,SlyD的抗干扰能力随着构成各构建体的SlyD单元数增加。抗干扰能力的增加不是线性的,表明我们正面临着协同效应,而不是累加效应。
简而言之,表2 (图4-6)显示抗干扰潜能随着互连的SlyD单元数显著增加。这表明,密切靠近的至少五个SlyD单元对于有效的抗干扰是必要且足够的。五重SlyD (SlyD-SlyD-SlyD-SlyD-SlyD)因此将是有希望的抗干扰添加剂,但其在大肠杆菌宿主中的表达产率相当差并且引起关于生产放大方面的严重障碍。Skp-SlyD-SlyD在其抗干扰潜能的方面至少等同于SS-螺旋(GDA,P)。因此,通过三聚Skp融合至串联SlyD (SlyD-SlyD)建立的表位密度显然足以满足对于有效抗干扰的要求。这是显著的,更加由于重组产生Skp-SlyD-SlyD模块的可用性要好得多,并且其生产方法迄今为止更可重复且方便。
表3(图7)显示,在一些情况下,Skp-SlyD-SlyD的抗干扰能力甚至优于SS-螺旋(GDA,P) 的抗干扰能力。同样,五种阴性血清、五种抗HIV阳性血清和具有显著升高信号的三种干扰血清已经在Elecsys® 2012自动化分析仪中进行评价。没有任何抗干扰添加剂,三种干扰血清的信号总计为10351、1437和778个计数。当将交联的SlyD聚合物SS-螺旋(GDA,P)以20 µg/ml的浓度添加至R1时,该信号仅略微降低至8042、903和772个计数的值(表3,V1)。然而,当将Skp-SlyD-SlyD以5 µg/ml或15 µg/ml 的浓度添加至R1时,信号显著降低至阴性血清的水平,更确切地说,它们降低至566、537和507个计数。值得注意的是,添加Skp-SlyD-SlyD对阴性血清的信号具有明显的平滑效果,并且它略微改善变异系数。该效果用Skp-SlyD-SlyD比其用SS-螺旋(GDA,P)更明显。综上所述,表3突出以下事实:Skp-SlyD-SlyD,在一些情况下,在其抗干扰能力方面优于SS-螺旋(GDA,P)。在干扰血清C133202的情况下,它将信号从假阳性降低至真阴性。甚至仅略微升高的信号,如血清Pr149或C133111所例举,被显著降低至紧密接近分析仪的空白值的信号水平。最重要的是,我们观察到Skp-SlyD-SlyD对抗HIV阴性血清的信号的平滑效果,导致信号的整体减低和变异系数的改善。
实施例
4
Ec
Skp-EcSlpA-EcSlpA
多肽融合蛋白的抗干扰活性
EcSkp-EcSlpA-EcSlpA的抗干扰活性在自动化Elecsys® 2010分析仪(Roche Diagnostics GmbH)中进行评价。Elecsys®是Roche集团的注册商标。测量以双抗原夹心形式实施。
Elecsys®
2010中的信号检测基于电化学发光(对于详细解释,参见实施例3)。
重组EcSkp-EcSlpA-EcSlpA多肽以双抗原夹心(DAGS)免疫测定形式进行评价。为此,EP 2 127 678中公开的PmSlyD-mgG2和EcSlpA-mgG2分别用作生物素和钌缀合物,以特异性检测人血清中的抗HSV-2抗体。成熟糖蛋白G2
(mgG2)是单纯疱疹病毒2(HSV-2)的免疫显性抗原,并且其可溶性变体 - 如EP 2 127 678中公开 - 是用于检测HSV-2感染的宝贵工具。PmSlyD-mgG2-生物素和EcSlpA-mgG2-钌以各300
ng/ml的浓度用于R1(试剂缓冲液1)和R2(试剂缓冲液2)中。
抗HSV-2阴性血清、抗HSV-2阳性血清和抗HSV-2假阳性血清(即干扰血清)用上述DAGS免疫测定设置进行评价。在EcSlpA-EcSlpA (GDA,P),可溶性异质的GDA-交联的EcSlpA聚合物(其在抗HSV-2免疫测定中用作抗干扰物质)不存在和存在的情况下进行评价。EcSlpA-EcSlpA
(GDA,P)充当抗干扰基准的作用:它构成常规抗干扰添加剂,所述抗干扰添加剂已通过EcSlpA-EcSlpA多肽的化学交联生成且充分适合于改善基于EcSlpA融合抗原的免疫测定的特异性。将所考察的抗干扰添加剂以大过量(各10
µg/ml)添加至R1(试剂缓冲液1,含有生物素缀合物)和R2(试剂缓冲液2,含有钌缀合物)两者。然后将70 µl R1(试剂缓冲液1,生物素缀合物和抗干扰EcSlpA聚合物)、70 µl R2(试剂缓冲液2,钌缀合物和抗干扰EcSlpA聚合物)、20 µl样品(人血清)和40 µl珠粒悬浮液混合并孵育,以得到大致200 µl的反应体积。
即使两种不同的分子伴侣,诸如PmSlyD (即来自多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)的SlyD)和EcSlpA
(即来自大肠杆菌的SlpA),用在双抗原夹心免疫测定的两侧,显著升高的信号在已明确排除
HSV-2感染的人血清的实验对象组中也相当频繁。该发现的原因在于,融合伴侣PmSlyD和EcSlpA,尽管来自不同的生物,却是属于分子伴侣的FKBP家族且共有高度保守的FKBP结构域的相关分子。免疫交叉反应的发生可能正是经由该共有基序,引发高信号,且因此在抗HSV-2测定中假装阳性结果。将化学聚合抗干扰物质EcSlpA-EcSlpA(GDA,P)添加至测定混合物将升高的信号降低至正常阴性值。表4 (图10)显示,甚至非常强的干扰,即高假阳性[诸如对于样品012],也可以通过添加抗干扰聚合物EcSlpA-EcSlpA(GDA,P)有效地消除。如表4 (图10)所示,由于DAGS免疫测定中的融合伴侣导致的干扰是频繁的,并且它们可以通过添加至少一种融合伴侣的交联的聚合物变体而有效地减轻。
当将EcSkp-EcSlpA-EcSlpA添加至测定时,我们发现假阳性信号同样降低至HSV-2阴性血清的信号水平。事实上,EcSkp-EcSlpA-EcSlpA在其抗干扰能力的方面变得至少与化学聚合的EcSlpA-EcSlpA
(GDA,P)一样有效。显然,Skp-EcSlpA-EcSlpA的表位密度足够高,足以有效地结合且猝灭据推测属于免疫球蛋白的IgM类型的干扰因子。这些干扰血清的特征在于它们不对添加单体抗干扰添加剂响应(参见表4/图10,样品010和013)。真阳性信号既不受融合多肽EcSkp-EcSlpA-EcSlpA影响,也不受化学聚合的EcSlpA-EcSlpA (GDA,P)影响。重组产生的模块诸如EcSkp-EcSlpA-EcSlpA与交联的EcSlpA聚合物诸如EcSlpA-EcSlpA
(GDA,P)的等效性(关于抗干扰)是我们实验的令人震惊的结果。在表4(图10)中,显示两个进一步对照:已经将EcSkp和EcSlpA(即EcSkp-EcSlpA-EcSlpA融合多肽的组分)作为单一分子伴侣添加至免疫测定,以便评价它们的抗干扰能力。结果是相当清晰的:单独的EcSkp完全不影响干扰血清的假阳性信号。然而,单独的EcSlpA似乎发挥有益效果,至少在四种情况中的两种中。至于干扰样品011和012,添加大过量的单体EcSlpA分别将信号从8204个计数降低至969个计数和从42168个计数降低至14801个计数。可以得出结论,添加单体EcSlpA在一些情况下可能帮助增加测定特异性。然而,与EcSkp-EcSlpA-EcSlpA的比较乍一看揭示,该融合多肽在其抗干扰潜能方面高度优异。添加EcSkp-EcSlpA-EcSlpA明确将假阳性值降低至真阴性,如表4中对于干扰血清010-013所示。显著的是,重组衍生的EcSkp-EcSlpA-EcSlpA融合蛋白在其抗干扰活性方面甚至优于标准抗干扰添加剂EcSlpA-EcSlpA
(GDA,P)(参见表4,样品010、011和013 )。与其易于处理和产生一起考虑,EcSkp-EcSlpA-EcSlpA的抗干扰特征是优秀的,并且使该分子成为免疫测定中具有高度吸引力的添加剂。
实施例
5
Skp-SlyD-SlyD
的
CD
检测的热诱导的解折叠
用具有恒温池架的Jasco-720分光偏振仪记录近-UV
CD光谱,并转换为平均残基椭圆率。缓冲液为50 mM磷酸钾pH 7.5,250 mM KCl,0.5 mM EDTA。路径长度为0.2 cm,且蛋白浓度为8.2 mg/ml (147 µM单体,对应于49 µM三聚体)。范围为250 - 330 nm,带宽为1.0 nm,扫描速度为20 nm/分钟,分辨率为0.5 nm,且应答为1秒。为提高信噪比,测量光谱九次并取平均值。
圆二色光谱学(CD)是评价蛋白的二级结构和三级结构的所选方法。芳香区(250-330
nm)中的椭圆率报告了蛋白内的三级接触(即规则折叠的蛋白的球状结构),并且被认为是天然样折叠(构象)的指纹区。
监测Skp-SlyD-SlyD的近UV CD光谱,以解决以下问题:所述融合蛋白在作为纯化过程中的关键步骤的基质偶联再折叠程序之后是否采用有序构象。答案是相当清晰的:Skp-SlyD-SlyD的近UV CD信号明确报道了所述融合多肽的有序三级结构。Skp-SlyD-SlyD的芳香族残基被明显嵌入亲脂性蛋白核心中,并且因此经历不对称环境,其强烈指向融合构建体内Skp和SlyD两者的天然样构象(图9)。
为了解决Skp-SlyD-SlyD的热诱导的解折叠是否可逆的问题,在近UV区的280 nm的检测波长处监测熔解曲线。温度范围为20-65℃,带宽为1.0 nm,温度斜率为1℃/min,且响应为4 s(参见图8)。
热诱导的解折叠在280 nm(这是Skp-SlyD-SlyD的最大信号幅度的波长)进行监测。加热时,稳定Skp-SlyD-SlyD分子的天然构象的非共价接触变得松散并最终瓦解。这种热诱导的解折叠反映在CD信号的降低,如图8中所示。在60℃,Skp-SlyD-SlyD被完全解折叠。引人注目的是,当蛋白溶液冷却至20℃时,CD信号再次回来。尽管存在轻微滞后,但解折叠曲线和再折叠曲线实际上重叠,强烈表明Skp-SlyD-SlyD的可逆再折叠行为(参见图8)。令人震惊的是,复合三聚融合蛋白诸如Skp-SlyD-SlyD的热诱导的解折叠是 - 至少部分地 - 可逆过程。将预期Skp-SlyD-SlyD,在热诱导的解折叠和解离为单体亚基后,将在升高的温度诸如60℃非常迅速且定量地聚集。然而,我们发现,当蛋白溶液冷却至20℃时,Skp-SlyD-SlyD能够重新采用其天然样构象。事实上,在热诱导的解折叠之前和之后监测的近UV CD光谱实际上重叠(参见图9)。总之,Skp-SlyD-SlyD具有稳健的折叠特性,这对于这种复杂性的分子是突出的,并且这对于充当抗干扰或通常稳定免疫测定的组分的分子是高度期望的。
我们对于Skp-SlpA-SlpA发现非常相似的结果:就像Skp-SlyD-SlyD,Skp-SlpA-SlpA在近UV区(250-330 nm,在277
nm处信号最大值)表现出显著的CD信号,指向基质偶联再折叠过程后的良好有序的构象。借助于热转变(在277
nm处监测),我们观察到,Skp-SlpA-SlpA在高达55℃的温度保留其天然样构象。此外,天然分子的CD信号在热解折叠/再折叠循环(20℃/65℃/20℃)后大部分得到恢复,如图11中所示。期望抗干扰添加剂发挥它们的功能,甚至在远非最佳的温度条件下。Skp-SlpA-SlpA的高度热稳定性连同其热诱导的解折叠的部分可逆性凸显了该分子的稳健性。
总之,Skp-SlyD-SlyD和Skp-SlpA-SlpA具有稳健的折叠特性,这对于具有这种程度复杂性的分子是突出的,并且这对于充当抗干扰或通常稳定免疫测定的组分的模块是高度期望的。
Claims (11)
1.包含几个分子的折叠辅助多肽的融合多肽,其包含一个多聚化结构域和至少一个分子的SlyD或SlpA,其中没有进一步的目标多肽序列融合至所述融合多肽。
2.根据权利要求1的融合多肽,其中所述多聚化结构域是Skp。
3.根据权利要求1或2的融合多肽,其中一个分子的Skp融合至两个相邻分子的SlyD或SlpA。
4.融合多肽,其包含SEQ ID NO. 1 (Skp-串联-SlyD)。
5.融合多肽,其包含SEQ ID NO. 9 (Skp-串联-SlpA)。
6.根据权利要求1-5的融合多肽在免疫测定中用于降低干扰或用于尽可能减少假阳性结果的用途。
7.根据权利要求1-5的融合多肽用于增加测定试剂的蛋白成分的溶解度的用途。
8.用于通过免疫测定检测分离样品中的分析物的试剂盒,其包含根据权利要求1-5的融合多肽。
9.用于检测分离样品中的分析物的方法,其中根据权利要求1-5的融合多肽用作用于降低干扰或尽可能减少假阳性结果的试剂。
10.用于检测分离样品中的分析物的方法,所述方法包括
a) 通过混合体液样品与特异性结合伴侣形成免疫反应混合物,所述特异性结合伴侣可以被所述样品中存在的所述分析物特异性结合
b) 在将所述特异性结合伴侣添加至所述样品之前、同时或之后,将根据权利要求1-5中任一项的融合多肽添加至所述免疫反应混合物
c) 保持所述免疫反应混合物一段时期,所述时期足以允许所述体液样品中存在的所述分析物与所述特异性结合伴侣免疫反应,以形成免疫反应产物;和
d) 检测任何所述免疫反应产物的存在和/或浓度。
11.根据权利要求9或10的方法,其中分离样品中存在的所述分析物是抗体。
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