CN104561091A - 一种光学分析检测cho细胞增殖的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种光学分析检测CHO细胞增殖的方法及应用，步骤如下：(1)将pEGFP-N2转化大肠杆菌DH5α，摇菌，提取无内毒素质粒；(2)将CHO细胞接种于孔板中，待细胞生长密度达70％时，采用脂质体转染法将步骤(1)的质粒瞬时转染到CHO细胞中；(3)采用遗传霉素G418对转染细胞进行筛选，至少经过30代以上的抗性筛选即可获得稳定表达GFP的细胞株；(4)扩增培养稳定表达GFP的细胞株，消化细胞并采用台盼蓝染色对细胞计数及采用酶标仪检测荧光强度，基于细胞内GFP荧光强度和细胞数目呈线性关系，判断CHO细胞增殖情况。本发明方法具有易操作性、检测结果准确性、良好重复性、敏感度高和无毒等优势。

Description

一种光学分析检测CHO细胞增殖的方法及应用

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，尤其涉及一种非侵入式光学分析检测中国仓鼠卵巢(CHO)细胞增殖的方法，适用于促CHO细胞生长的培养基及各种因子的快速筛选。

背景技术

哺乳动物细胞表达体系是药用蛋白首选的表达系统：1986年，第一个治疗型蛋白—人组织型纤溶酶原激活剂由哺乳动物细胞表达生产；据统计，2006年至2010年获得美国FDA批准的58个生物药物中，其中有32个是使用哺乳动物细胞系表达(Walsh G.Biopharmaceutical benchmarks.Nat Biotechnol2010；28:917–924)。而在众多哺乳动物表达系统中有近70％的治疗用蛋白用CHO细胞表达(Jayapal KP,Wlaschin KF,Hu WS,Yap MG.Recombinant proteintherapeutics from CHO cells—20years and counting.ChemEngProg2007；103:40–47)。

哺乳动物细胞培养采用合成培养基，并加入适量的血清。血清是一类去除纤维蛋白后的复杂混合物，含有血浆蛋白、生长因子、激素、毒素清除剂及脂肪、多肽、维生素、核酸和微量元素等。在常规细胞培养中，血清对细胞的增殖及分化不可或缺(Grillberger L,Kreil TR,NasrS.Emerging trends inplasma-free manufacturing of recombinant protein therapeutics expressed inmammalian cells.Biotechnology Journal 2009；4(2):186-201)。但添加血清存在一些无法彻底解决的弊端：血清成分复杂，不可避免地存在支原体和外源病原体等污染(Zoon K.Points to consider in the characterization of cell lines used toproduce biologicals.Center for Biological Evaluation and Research,Food andDrug Administration,Rockville,MD,1993:7-8.)；血清中含有细胞贴壁因子，不适用于工业化高密度CHO细胞大规模生产糖蛋白；血清含有少量蛋白，表达目的蛋白过程中无法避免引入了杂蛋白，大大增加了蛋白质下游工程分离纯化过程难度(Van VJ,Mellor D,Brands R.The humane collection of fetal bovineserum and possibilities for serum-free cell and tissue culture.Toxicology in vitro2004；18(1):1-12.)。

因此细胞培养方面的学者也在2005年出版的细胞培养规范中提议生物药品需使用无血清培养基生产(Coecke S,Balls M,Bowe G.Guidance on good cellculture practice,a report of the second ECVAM task force on good cell culturepractice.Alternatives to laboratory animals:ATLA2005；33(3):261.)。2008年欧洲替代方法研究中心科学咨询委员会强烈建议在细胞培养领域使用无血清培养基。因此，无血清培养基、特别是无外源蛋白成分的无血清培养基，已逐渐成为哺乳动物细胞体外培养及其生物制品行业中主流与趋势，寻找廉价的血清类似物生长因子已迫在眉睫。

已报道的筛选血清类似物的细胞增殖检测方法主要分为四类：DNA合成检测(BrdU标记法)、代谢活性检测(四唑盐或者Alamar Blue)、细胞增殖相关抗原检测(细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB和磷酸化组蛋白H3)和ATP浓度检测(Ceresa L,Ball P.Using ATP bioluminescence for microbiologicalmeasurements in pharmaceutical manufacturing.Pall Life Sci2004.)。这些方法均存在一些弊端：如BrdU标记法需要变性DNA后才能与抗体结合，但这就破坏了DNA双链结构，影响了其他染料的结合染色，导致染色弥散，准确性降低等问题；四唑盐(MTT、XTT、MTS)这一类检测方法属于终点检测，化合物存在毒性，灵敏度不足以及不能实时在线监测细胞的动态生长等；细胞增殖相关抗原检测法中抗原有极大的局限性，只能在细胞周期S期、G2期和M期表达，而在G0期和G1期(非增殖期)不表达，需要通过组织切片检测，不能实现高通量筛选；ATP浓度检测需要采用荧光素酶(luciferase)及其底物荧光素(luciferin)的ATP检测以生物发光为基础，对细胞增殖进行检测，但是该方法需要外源荧光素标记，操作费时等。

基于上述方法存在诸多不足，需要构建一种能解决上述弊端的筛选方式，能高通量筛选出适合CHO细胞生长的血清类似物并能保持甚至提高外源蛋白的表达量，对实验室的科学研究及规模化应用都有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用GFP光学分析法检测细胞增殖的方法，该方法是将pEGFP-N2整合到CHO细胞基因组中，由于质粒含有高效的启动子SV40和CMV，使GFP基因在细胞增殖过程中稳定表达，以GFP作为报告基因通过荧光强度变化来评估培养基及各种生长因子对CHO细胞生长的影响。本发明以稳定表达GFP的细胞株内荧光强度来快速、灵敏地检测CHO细胞增殖情况，检测的结果与传统细胞增殖检测方法—MTT法的实验结果十分吻合，同时还具有操作便捷、无毒害、重复性好、灵敏度高和检测范围广等优势，为CHO细胞培养基及生长因子的筛选提供了一种非侵入式的筛选方法，具有良好的应用前景。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种光学分析检测CHO细胞增殖的方法，步骤如下：

(1)pEGFP-N2转染质粒的制备

将pEGFP-N2转化到大肠杆菌DH5α中，摇菌，提取无内毒素的质粒；

(2)脂质体转染

将CHO细胞接种于孔板中，待细胞生长密度达70％时，采用脂质体转染法将步骤(1)的质粒瞬时转染到CHO细胞中；

(3)稳定细胞株的筛选

采用遗传霉素G418对转染的细胞进行筛选培养，至少经过30代以上的抗性筛选即可获得稳定表达GFP的细胞株；

(4)扩增培养稳定表达GFP的细胞株，消化细胞并对其计数及检测荧光强度，基于细胞内GFP荧光强度和细胞数目呈线性关系，可判断CHO细胞增殖情况。

步骤(1)所述转染质粒是通过去内毒素的质粒提取试剂盒提取。

步骤(2)脂质体转染采用lipofectimene3000试剂盒。

所述遗传霉素G418的筛选浓度为400～1000ug/ml。

上述方法应用于促生长培养基和生长因子的筛选。

更具体的方法如下：

1.pEGFP-N2转化，提取。制备方法如下：

a.取一管大肠菌DH5α感受态细胞，置于冰上融化30min，取1μl质粒加入感受态细胞中，用手指轻弹混匀，置于冰上30min后于42℃水浴90sec，然后迅速置于冰上2min；

b.取0.8ml SOC培养基于无菌EP管中，37℃、180rpm摇床恢复培养1h；

c.离心后重悬沉淀菌液，取10ul涂布于含抗性的LB平板培养基37℃过夜培养。

d.挑取长势好的克隆，接种于含抗性的LB液体培养基中，37℃，180rpm摇床培养过夜，提取质粒测序；

e.测序结果正确后摇菌，采用OMGA质粒提取试剂盒提取去内毒素的质粒DNA，通过超微量紫外/可见光光度计检测质粒浓度及其纯度。

2.脂质体转染

a.接种1×10⁵个CHO-K1细胞于24孔板培养，待细胞密度生长至70％时，对细胞进行瞬转实验操作；

b.取适量体积lipofectimene3000试剂与opti-MEM Medium均匀混合后得到A；取1ug pEGFP-N2于opti-MEM Medium混合，然后加入P3000试剂后得到B；A和B按照等体积混合形成混合液，在室温条件下孵育5min后，将其加入到24孔板中培养；

c.培养数天后，荧光显微镜下观察细胞转染效率。

3.稳定细胞株的筛选

a.遗传霉素G418的筛选浓度：设置400-1000ug/ml的浓度分别加入CHO-K1中培养数十天，观察CHO-K1细胞生长情况，确定最佳稳筛浓度；

b.将转染后的细胞消化传代于6孔板中培养，加入最佳筛选浓度遗传霉素G418试剂来筛选；

c.经过30次传代进行逐次筛选即可获得稳定表达GFP的细胞株，其中GFP阳性克隆率为95％以上。

4.抗性细胞克隆团PCR鉴定：

a.采用Takara基因组提取试剂盒提取阴性细胞和抗性细胞全基因组；

b.设计PCR引物如下：

pEGFP-N2-F1：5’-CTGGTCGAGCTGGACGGCGACG-3’

pEGFP-N2-R1：5’-CACGAACTCCAGCAGGACCATG-3’

c.PCR扩增程序：

d.PCR产物鉴定：制备1％琼脂糖凝胶，1×TAE电泳缓冲液，设置电泳电压和时间分别为100V和20min，电泳检测PCR反应产物。

5.基于细胞内GFP荧光强度监测CHO细胞增殖情况：采用多功能酶标仪随时检测细胞内GFP的表达，采用PBS对细胞进行稀释，通过多功能微孔酶标仪读取GFP的荧光强度进行荧光检测，设定荧光激发的波长和发射的波长分别为485nm和535nm；同时将通过步骤1获得稳定表达的CHO细胞株，通过细胞扩增培养，收集细胞，用台盼蓝染色法对细胞计数。将细胞数目与细胞表达GFP荧光强度的线性关系进行拟合，表征CHO细胞的增殖情况。

本发明将GFP基因整合到CHO细胞基因组中：先将含有CMV启动子的pEGFP-N2转化到大肠菌DH5α中扩增，然后通过去内毒素的质粒提取试剂盒提取转染质粒，最后采用脂质体将目的质粒转染于CHO细胞株中，通过遗传霉素G418筛选获得稳定表达GFP的细胞株，并根据细胞数目和荧光强度绘制出线性关系曲线，用于高通量筛选促CHO细胞生长的培养基和各种生长因子。与传统细胞增殖检测方法相比，细胞荧光强度快速检测法与传统方法结果基本一致，但具有易操作、检测结果具有良好重复性、敏感度高以及避免化学试剂对研究者的毒性等优势。此外，CHO细胞无血清培养基由于其昂贵的价格限制了其蛋白及抗体药物大规模生产中的应用，因此迫切需要一种适用于促CHO细胞生长及其提高目标蛋白表达量的培养基和生长因子的高通量筛选模型。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

(1)基于光学GFP的分析法和传统MTT法检测结果趋势一致，证实我们光学GFP分析法检测的准确性。

(2)光学GFP分析法具有操作便捷、良好的重现性、高灵敏性、微型化和无毒等特点。

(3)在无血清培养基及各种生长因子筛选中可对细胞进行在线和非侵入式的监测，同时采用计算比生长速率μ的方式来评估生长因子的作用效果，排除化学试剂对细胞带来的干扰，可适用于高通量的筛选。

附图说明

图1为稳定表达GFP的CHO细胞株的构建流程示意图。

图2为实施例1提取质粒的电泳图，其中M为DNA marker，1为去内毒素质粒DNA。

图3为实施例2稳定细胞株筛选的荧光显微镜下观察图，a为荧光显微镜明场图；b为荧光显微镜下暗场图。

图4为实施例3抗性细胞克隆团PCR鉴定的电泳图，其中a：泳道M:DNAmarker，泳道1：未转染CHO-K1细胞基因组；泳道2：稳定表达GFP的CHO-K1细胞基因组；b：泳道M:DNA marker，泳道1：去离子水为模板；泳道2：CHO-K1细胞基因组为模板；泳道3：稳定表达GFP的CHO-K1细胞基因组为模板。

图5为细胞数目与细胞表达GFP荧光强度的线性拟合关系图，其中以细胞数目(1×10⁴)为X轴，荧光强度为Y轴，通过标准曲线Y＝5.06X+1.5174(R²＝0.9969)，呈现良好的线性拟合关系。

图6为比较光学GFP分析法与MTT法在不同培养基中CHO细胞增殖活性的曲线图，其中纵坐标为标准常数，表示把起始点的吸光值或荧光强度作分母，其他各时间点的吸光值或荧光强度作分子，折算成数值而绘制得来的曲线。

图7为光学GFP分析法检测不同培养基对CHO细胞增殖活性的曲线图。

图8为光学GFP分析法检测不同培养基对CHO细胞的增殖活性的荧光图，其中a：10％FBS培养基；b:SVG培养基；c：DMEM/F12培养基。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

pEGFP-N2的制备

(1)取一支大肠菌DH5α感受态细胞，置于冰上融化30min，然后取pEGFP-N2质粒1μl加入到感受态细胞中，手指轻弹混匀。冰浴30min后42℃水浴90sec，重复冰浴2min进行转化操作。转化完成后，取0.8ml SOC培养基悬浮菌体，37℃，180rpm摇床恢复培养1h。

(2)取恢复培养后的菌液，离心后重悬沉淀，取10ul涂布于含抗性的LB平板上，37℃培养过夜。挑取长势好的克隆，接种于含抗性的LB液体培养基中，37℃，180rpm摇床培养过夜。

(3)提取质粒测序，测序结果正确后摇菌，采用OMGA质粒提取试剂盒提取去内毒素的质粒DNA，通过超微量紫外/可见光光度计检测质粒浓度及其纯度。实验结果如图2和表1所示。

表1去内毒素质粒提取信息

结果：如图2所示，提取的质粒其成份单一，未出现杂带，经测序验证后其同源性高达99％。此外，如表1所示，质粒的浓度大于1000ug/ml，而A260/A280以及A260/A230的值大于1.8，表示质粒成份单一。

结论:pEGFP-N2可以用于后续转染。

实施例2

脂质体lipofectimene3000转染及其筛选

(1)复苏CHO细胞接种到含6ml生长培养基的T-flask培养瓶中(10％FBS+1％Penicillin-Streptomycin Solution+89％DMEM/F12，以下简称10％FBS培养基组)，于37℃、5％CO₂恒温细胞培养箱条件下培养，至细胞密度为90％时传代。数代培养后，接种1×10⁵个细胞于24孔板中，37℃、5％CO₂恒温培养，直至细胞生长密度为70％。

(2)转染操作参照lipofectimene3000试剂盒流程。将lipofectimene3000试剂和opti-MEM培养基均匀混合，得到溶液A；将1ug pEGFP-N2、opti-MEM培养基和P3000试剂均匀混合，得到溶液B。溶液A和B等体积混合于1.5ml离心管中，孵育5min后加入24孔板中培养。转染48h，对细胞进行稀释传代培养。

(3)采用700ug/ml的G418对转染的细胞进行筛选培养。用克隆环挑选单克隆，将生长状态良好的单克隆扩增培养，用G418对细胞继续培养30代，此时阳性细胞克隆率达95％以上。

结果：如图3所示，在明场和暗场下含有GFP的细胞数目占细胞总数的95％以上。

实施例3

抗性细胞克隆团PCR鉴定

为鉴定目的基因GFP是否完全整合到细胞基因组中，采用Takara基因组提取试剂盒提取细胞全基因组。

(1)以裂解细胞所获得基因组作为模板。未转染CHO-K1细胞的基因组模板为阴性对照。

引物序列如下：

pEGFP-N2-F2：5’-CTGGTCGAGCTGGACGGCGACG-3’

pEGFP-N2-R2：5’-CACGAACTCCAGCAGGACCATG-3’

反应体系如表2：

表2细胞鉴定PCR反应体系

所有实验操作均应在无菌条件下进行，防止交叉污染。

(2)根据以下设定的PCR程序，进行目的片段扩增。

PCR程序设置：

实施例4

光学GFP分析法检测不同培养基培养CHO细胞增殖活性及传统MTT法比较。

所使用培养基为10％FBS培养基和CD opti-CHO培养基(以下简称SF培养基组)，采用96孔板培养细胞。具体操作如下：

(1)传代CHO细胞，至生长密度达到70％时备用。取2ml胰酶消化细胞4min后，加入6ml培养基终止消化。吹打培养皿底部，将细胞转移到15ml无菌的离心管中，台盼蓝染色计数，计算总细胞数目。

(2)取细胞培养液1000rpm离心5min，10％FBS培养基稀释细胞浓度至2.5×10⁴个/ml。取200ul稀释的培养基于96孔板中，2小时后更换培养基，转用10％FBS培养基和SF培养基对细胞进行培养。其中，检测荧光的用荧光培养板对细胞进行培养。而用MTT检测细胞增殖的则用96孔透明板培养，并分别在4h，12h，24h，36h，48h，60h和72h加入20ul MTT(母液浓度5mg/ml)，继续培养4h。

(3)培养完成后，弃掉培养基，用无菌PBS清洗3遍，加入100ul二甲基亚砜，低速振荡10min使其完全溶解。于490nm波长下检测细胞吸光值。同时也对荧光孔板中的细胞进行荧光强度检测，设置激发波长为485nm，发射波长为535nm，从板的上部往下读数检测细胞荧光强度。每个实验组设计至少6个复孔，同时重复20次以上。

结果：如图6所示，通过20次以上的实验论证，发现在10％FBS培养基和SF培养基中，细胞接种24h后开始进入对数生长期，随着时间的延长，细胞吸光值或者荧光值不断增加，可见细胞不断增殖，随后由于培养基中的营养成份耗尽及培养空间的限制，细胞在培养60h后开始进入衰亡期。采用MTT法和光学荧光检测法在不同时间得到的细胞生长曲线趋势基本一致。

结论:光学荧光检测法能够用于检测CHO-K1细胞的生长。

实施例5

光学GFP分析法检测不同培养基及生长因子对CHO细胞的增殖活性。

为了评估不同添加物对CHO细胞生长的影响，进一步确定该方法的操作可行性。我们使用SVG培养基(三种物质组合，即将大豆蛋白胨，维生素C和还原型谷胱甘肽加入到DMEM/F12中即组成SVG培养基)，DMEM/F12以及10％FBS培养基实施例来验证。

(1)10％FBS培养基稀释细胞至2.5×10⁴个/mL，取200ul稀释的培养基于96孔板中，培养2小时。

(2)将培养基更换为SVG培养基、DMEM/F12以及10％FBS培养基行培养，并分别在4h，12h，24h，36h，48h，60h和72h时，对荧光孔板中的细胞进行荧光强度检测。

(3)设置激发波长为485nm，发射波长为535nm，从板的上部往下读数检测细胞荧光强度。每个实验组设计至少6个复孔。

此外在60h时，取培养细胞于荧光显微镜下拍照，进行比较。

结果：如图7、8所示，通过荧光值的检测发现，CHO细胞在10％FBS和SVG培养基下，细胞生长趋势基本一致，细胞生长良好，而在DMEM/F12培养基中细胞几乎不生长。

结论:光学荧光检测法能够用于CHO细胞培养基及生长因子的筛选。

Claims (5)

1.一种光学分析检测CHO细胞增殖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)pEGFP-N2转染质粒的制备

将pEGFP-N2转化大肠杆菌DH5α，摇菌，提取无内毒素的质粒；

(2)脂质体转染

将CHO细胞接种于孔板中，待细胞生长密度达70％时，采用脂质体转染法将步骤(1)的质粒瞬时转染到CHO细胞中；

(3)稳定细胞株的筛选

采用遗传霉素G418对转染的细胞进行筛选，至少经过30代以上的抗性筛选培养即可获得稳定表达GFP的细胞株；

(4)将稳定表达GFP的细胞株扩增培养，消化细胞并采用台盼蓝染色对细胞计数及采用酶标仪检测荧光强度，基于细胞内GFP荧光强度和细胞数目呈线性关系，可判断CHO细胞增殖情况。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述转染质粒是通过去内毒素的质粒提取试剂盒提取。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)脂质体转染采用lipofectimene3000试剂盒。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述遗传霉素G418的筛选浓度为400～1000ug/ml。

5.权利要求1～4所述方法在促生长培养基和生长因子的筛选中应用。