CN104560736B - 一种真菌菌株gx‑4及其在含汞废水处理中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种能够去除或回收废水中汞的真菌菌株GX‑4及其应用，本发明的真菌菌株GX‑4分类学命名为Fusarium oxysporum。本发明的真菌菌株GX‑4作为微生物吸附剂，对于废水中汞离子的去除效果好，并且成本低、易于培养，能够循环利用，具有较好的应用前景。

Description

一种真菌菌株GX-4及其在含汞废水处理中的用途
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种真菌菌株及其用途，尤其涉及一种能够去除废水中汞离子的真菌菌株GX-4及其在含汞废水处理中的用途。
背景技术
工业废水重金属汞的排放主要集中在有色金属、黑色金属冶炼及压延加工业、有色金属矿采选业、化学原料及化学制品制造业行业。根据2004-2011年中国环境统计年鉴数据资料，核算2003年、2010年各省区工业废水汞排放量占全国比重，并结合GIS技术平台及各省区矿产资源分布图进行比较分析，表明湖南省汞排放量及其占全国比重一直居全国首位。2003年南方三省湖南、广西、广东工业废水汞排放量占全国比重超过70％，北方辽宁、甘肃两省所占比重超过20％；2010年北方汞污染范围缩小；南方汞污染范围扩大，以湖南为核心的南方六省(云南、福建、江西及两广)所占比重约为76％。
目前，对于含汞工业废水的治理方法主要有：物理吸附、化学沉淀以及微生物治理。在中国专利CN103121730A与CN103691412A中，前者利用火山石粉剂通过改性后进行含汞废水处理，对低浓度含汞废水具有较好的去汞效果；后者利用氯甲基化苯乙烯树脂、苯酚、三乙烯四胺为原料制成螯合树脂，可以有效去除废水中的汞。在中国专利CN102001734A中，采用以反应物硫化钠、絮凝剂Fe3+、助凝剂聚丙烯酰胺以及水制成重金属沉降剂，对高、低浓度的含汞废水均有较好的去除效果。在中国专利CN103525849A中，利用基因重组后的工程菌作为吸附剂，其去汞效果远远好于未基因重组的大肠杆菌。在中国专利CN102489263A中，利用真菌菌种黑曲霉作为吸附剂，吸附剂基团与Hg离子发生络合作用，可以有效去除废水中的汞。
由于微生物除汞技术成本较低，能够循化利用，不产生二次污染，是一种环境友好型的吸附剂，因此，寻找一种具有高耐汞性能的微生物用于汞离子的去除是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种真菌菌株及其用途，特别是一种能够去除废水中汞离子的真菌菌株GX-4及其在含汞废水处理中的用途。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种真菌GX-4，其分类学命名为Fusarium oxysporum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101，保藏编号为CGMCC No.10106，保藏日期为2014年12月2日。
本发明分离得到的真菌GX-4，经ITS序列鉴定，该真菌属于尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)。
本发明的真菌可以耐受水溶液中浓度为500mg/L以下的汞离子，例如浓度可以是500mg/L以下、450mg/L以下、400mg/L以下、350mg/L以下、300mg/L以下、250mg/L以下、200mg/L以下、150mg/L以下、100mg/L以下、50mg/L以下或10mg/L以下，优选浓度为250mg/L以下，进一步优选浓度为100mg/L以下。
第二方面，本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂包含如第一方面所述的真菌GX-4。
第三方面，本发明还提供了如第二方面所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：
a)培养皿培养：将如第一方面所述真菌GX-4的菌种在无菌条件下接种于固体培养基上，于20-30℃，优选28℃下培养4-6天，优选5天；所述固体培养基由以下组分组成：酵母提取物1-3g/L，优选1.5g/L；醋酸钠1.5-4g/L，优选2.5g/L；琼脂13-18g/L，优选15g/L；氯霉素0.25mg/L；
b)一级种子培养：将步骤a)培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，于20-30℃，优选28℃下培养3-7天，优选5天，制得一级种子；所述液体培养基由以下组分组成：蛋白胨8-12g/L，优选10g/L；葡萄糖15-25g/L，优选20g/L；氯霉素0.25mg/L；
c)二级种子培养：按液体培养基的体积比为5-15％，优选8-12％的接种量，将所述一级种子接种到5L发酵罐中，曝气，培养5-7天，优选5.5-6.5天，制得二级种子；
d)混合发酵培养：按液体培养基的体积比为10-20％，优选12-18％的接种量，将二级种子接种到发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得菌剂。
本发明的培养皿培养中，培养温度可以为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃；培养时间可以为4天、4.5天、5天、5.5天、6天；所用的固体培养基中酵母提取物可以为1g/L、1.2g/L、1.5g/L、1.7g/L、1.9g/L、2g/L、2.1g/L、2.3g/L、2.5g/L、2.8g/L或3g/L，醋酸钠可以为1.5g/L、1.7g/L、1.9g/L、2g/L、2.3g/L、2.5g/L、2.8g/L、3g/L、3.2g/L、3.5g/L、3.8g/L或4g/L，琼脂可以为13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L或18g/L。
本发明的一级种子培养中，培养温度可以为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃；培养时间可以为3天、3.5天、4天、4.5天、5天、5.5天、6天、6.5天或7天；所用的液体培养基中蛋白胨可以为8g/L、8.2g/L、8.5g/L、8.7g/L、8.9g/L、9g/L、9.3g/L、9.5g/L、9.7g/L、10g/L、10.2g/L、10.5g/L、10.7g/L、11g/L、11.2g/L、11.5g/L、11.7g/L或12g/L，葡萄糖可以为15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L或25g/L。
本发明的二级种子培养中，接种量按液体培养基的体积比可以为5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％；发酵罐容积可以为1L、1.5L、2L、2.5L、3L、3.5L、4L、4.5L或5L；培养时间可以为5天、5.5天、6天、6.5天或7天。
本发明的混合发酵培养中，接种量按液体培养基的体积比可以为10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。
第四方面，本发明还提供了一种汞离子处理剂，所述汞离子处理剂包含如第一方面所述的真菌GX-4。
第五方面，本发明还提供了一种处理含汞废水的方法，所述方法包括：
将如第一方面所述的真菌GX-4、如第二方面所述的菌剂或如第四方面所述的汞离子处理剂与含汞废水接触；其中，所述含汞废水中汞离子的浓度在500mg/L以下，优选250mg/L，进一步优选100mg/L。
本发明中处理含汞废水的方法具体包括以下步骤：
a)将含汞废水的pH值调节至4.5-7.6，优选5.5-7.0，进一步优选6.0；
b)向步骤a)的水体中加入如第一方面所述的真菌GX-4、如第二方面所述的菌剂或如第四方面所述的汞离子处理剂，于10-35℃，优选15-30℃下震荡2-8小时，优选3-5小时，震荡速度为150-220rpm，优选160-200rpm，进一步优选180rpm；
c)静置8-16小时，优选10-14小时，进一步优选12小时，取上清测定，下层过滤后保留吸附剂备用；
d)将吸附剂放入解吸剂中解吸，回收汞，同时循环利用吸附剂。
本发明中，对于含汞废水的处理为去除或回收所述含汞废水中的汞离子。
本发明中所述含汞废水来源于机械、化工或电子材料行业排放的工业废水，例如可以来源于电镀、冶炼、铸造、农药、采矿、石油、印染或染料行业排放的工业废水。
在本发明中，“高密度培养”又称高密度发酵，一般指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
a)本发明提供的真菌菌株GX-4可以耐受水溶液中高浓度的汞离子，最高可耐受水溶液中500mg/L浓度的汞离子，并能够去除或回收污水中的汞离子，方便大规模生产，便于实现产业化及应用；
b)本发明筛选该真菌菌株GX-4所用培养基容易得到，而且吸附剂能够循环使用，和传统方法相比，大大降低了水处理成本；
c)本发明处理含汞废水的方法比较环保，不会产生二次污染，是一种环境友好型的处理方法。
附图说明
图1是不同真菌菌株对废水中汞的去除效率。
图2为本发明的菌株GX-4在不同汞离子浓度条件下的生长速率。
图3为本发明的菌株GX-4在不同汞离子浓度条件下对汞的去除效率。
图4为本发明的菌株GX-4在不同投加量条件下对汞的吸附效率。
图5为本发明的菌株GX-4在不同振荡时间条件下对汞的去除效率。
图6为本发明的菌株GX-4在不同pH条件下对汞的去除效率。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1 真菌菌株GX-4的分离
本发明的分离方法具体包含以下步骤：
a)将取自广西省河池市受汞矿污染的含有大量的二价汞金属离子的10g土壤样品装入含有90mL无菌水的三角瓶中；
b)用玻璃珠打散，搅匀，制成土壤悬液；
c)用涂布法将土壤悬液涂布在分离培养基平板上，所述分离培养基的组成为：无水醋酸钠0.2406g/L，酵母抽提物0.15g/L，琼脂15g/L，氯霉素0.1g/L，Hg2+50mg/L，其余为去离子水，且pH＝7.0，120℃高温高压灭菌30min；
d)将所涂布的分离培养基在30℃的条件下培养2～4天，获得单个菌株；
e)将所述单个菌株接入新鲜的所述分离培养基中继续进行分离培养，获得纯化的菌株；
f)对步骤e)中得到的纯化菌株重复步骤e)的操作3～5次，以确保所得到的菌株为完全纯化的单个菌株，获得本发明的真菌菌株GX-4并且于4℃保存。
实施例2 菌剂的制备
本发明中菌剂的制备方法具体包含以下步骤：
a)Petri Dishes培养：将已经纯化的原始菌种GX-4在无菌条件下分别接种于固体培养基上，室温(25℃)条件下培养5天；固体培养基具有以下组成：酵母提取物1.5g/L，醋酸钠2.5g/L，琼脂15g/L，氯霉素0.25mg/L；
b)一级种子培养：将步骤a)培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，室温(25℃)条件下培养6天，制得一级种子悬液；液体培养基具有以下组成：蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，氯霉素0.25mg/L；
c)二级种子培养：按液体培养基的体积比为10％的接种量，将一级种子分别接种到5L发酵罐中，发酵罐内培养液的总体积为3.5L，曝气，培养6天，制得二级种子；
d)混合发酵培养：按液体培养基的体积比为15％的接种量，将二级种子接种到10L的发酵罐中，发酵罐内的培养基总体积为7L，进行高密度发酵培养，获得菌剂。
实施例3 不同真菌菌株对废水中汞的去除效率
配制pH值为6.0的溶液8等份，体积为100mL，分别装入250mL三角瓶中，溶液中含有Hg2+浓度为10mg/L。在以上8份溶液中分别添加2g以下不同的真菌菌体1#(LP-4-1)、2#(LP-8)、3#(LP-12-2)、4#(GX-4)、5#(GX-5)、6#(GX-10)、7#(JX3-4)、8#(JX2-2)，其中4#即为本发明的真菌GX-4，反应温度为25℃，摇床震荡5h，振荡速度180rpm，振荡后静置12h。将含菌体的溶液离心(11000rpm，5min)，之后取上清液，测定上清液中Hg2+的浓度。
从图1中可以看出，8种不同真菌菌种对Hg2+的去除效率各不相同，某些菌种对Hg2+去除效率很小，如2#去除效率为12％；某些菌种对废水中Hg2+去除效率很大，如4#，5#，6#去除效率分别为92％，90％以及86％，去除效率最好的为4#，即本发明中所提到的菌种GX-4，其对废水中的Hg2+去除效率可以达到92％。
实施例4 真菌菌种GX-4对汞离子的耐受力测定
在AY固体培养基中分别添加0、50、100、300、500mg/L的Hg(II)，将GX-4分别接种于上述不同浓度Hg(II)的培养基上，室温条件下培养15天后生长情况如图2所示。
从图2中可以看出，GX-4在各个Hg(II)浓度下的生长速率均基本符合线性生长规律。在Hg(II)浓度为0-100mg/L的范围内，GX-4的生长几乎不受影响；在Hg(II)浓度为300mg/L时，GX-4生长速率有些下降，但在生长至20天时，在AY平板上的菌落直径也达到6.8cm；在Hg(II)浓度为500mg/L时，GX-4生长收到明显的抑制，生长至20天时，菌落直径为5.5cm。但总体看来，GX-4具有较高的汞耐受性，在含汞浓度达到500mg/L时还能持续生长。
实施例5 在不同条件下真菌菌种GX-4对汞离子的吸附
1.不同汞离子浓度条件下该菌对汞的去除效率
配制pH值为5.0的溶液5等份，体积为50mL，分别装入250mL三角瓶中，溶液中含有Hg2+浓度分别为0.5、5、10、20、50mg/L。在以上5份溶液中分别添加2g真菌菌剂GX-4(菌悬液状态)，反应温度为25℃，摇床振荡6h，振荡速度180rpm，震荡后静置12h。将含菌体的溶液离心(11000rpm，5min)，之后取上清液，测定上清液中Hg2+的浓度。
由图3可以看出，在Hg2+浓度分别为0.5、5、10、20、50mg/L存在下，真菌菌种GX-4去除效率分别为95.88％、91.10％、89.70％、94.55％、91.64％，每克菌剂吸附量分别为0.2397g、2.2775g、4.485g、9.455g、22.91g，符合吸附动力学要求。值得一提的是，汞离子浓度为0.5mg/L条件下经吸附后可达到0.02mg/L，也就是在低浓度下可以有效吸附汞，从而达到污水排放标准0.05mg/L的要求。
2.不同投加量条件下该菌对汞的吸附效率
配制pH值为5.0的溶液5等份，体积为50mL，分别装入250mL三角瓶中，溶液中含有Hg2+浓度为20.4mg/L。在以上5份溶液中分别添加真菌菌剂GX-4(菌悬液状态)0.5、1、2、5、10g，反应温度为25℃，摇床震荡5h，振荡速度180rpm，振荡后静置12h。将含菌体的溶液离心(11000rpm，5min)，之后取上清液，测定上清液中Hg2+的浓度。
由图4可以看出，在不同菌剂投加条件下，该菌对汞的吸附效率有所差别，但并不是投加量越大吸附效率越高。在投加量分别为0.5、1、2、5、10g条件下，该菌对汞的去除效率分别为85.54％、94.66％、94.51％、91.23％、90.98％，每克菌体吸附量分别为34.9g、19.31、9.64g、3.722g、1.856g，同样符合吸附动力学要求。在废水处理过程中，为了提高汞的去除效率，需要选择适宜的投加量，在此可以看出投加量为1g的条件下，废水中汞的去除效率最高。
3.不同振荡时间(反应时间)条件下该菌对汞的去除效率
配制pH值为5.0的溶液5等份，体积为50mL，分别装入250mL三角瓶中，溶液中含有Hg2+浓度为20.4mg/L。在以上5份溶液中分别添加2g真菌菌剂GX-4(菌悬液状态)，反应温度为25℃，摇床振荡时间分别为10min、30min、1h、2h、6h，振荡速度180rpm，震荡后静置12h。将含菌体的溶液离心(11000rpm，5min)，之后取上清液，测定上清液中Hg2+的浓度。
图5中表明不同振荡时间对该菌吸附溶液中汞离子的影响。从图中可以看出振荡时间为10min时该菌就表现出对汞很强的吸附效率，可达到93.28％，在振荡时间为30min及1h条件下，吸附效率有所下降，分别为89.12％以及88.77％，分析原因可能是由于该菌在短时间内需要有一定适应过程，因此吸附效率也有一定变化；在振荡时间为2h-6h条件下，吸附效率为94.36％-95％，没有发生太大变化，因此，对于该菌适宜的振荡反应时间为2h最佳。
4.不同pH条件下该菌对汞的去除效率
配制含汞溶液5等份，体积为50mL，分别装入250mL三角瓶中，溶液中含有Hg2+浓度为20.4mg/L，调节溶液pH分别为3、4、5、6、7。在以上5份溶液中分别添加2g真菌菌剂GX-4(菌悬液状态)，反应温度为25℃，摇床振荡时间为6h，振荡速度180rpm，震荡后静置12h。将含菌体的溶液离心(11000rpm，5min)，之后取上清液，测定上清液中Hg2+的浓度。
图6中可以明显看到不同pH条件下，该菌对汞的吸附效率均可达到90％以上，说明该菌具有较广的适应性，但是pH不同，去除效率也有一定差别。在pH为3酸性环境下以及pH为6、7的偏中性环境下吸附效率都没有达到最高，pH为3条件下去除效率为90.25％，pH为6和7条件下去除效率为92.16％以及91.91％；在pH为4和5条件下，去除效率最好，分别为95.44％、94.17％，以pH为4条件下吸附效率95.44％为最佳反应条件。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (25)

1.一种真菌GX-4，其分类学命名为Fusarium oxysporum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.10106，保藏日期为2014年12月2日。
2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包含如权利要求1所述的真菌GX-4。
3.如权利要求2所述菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)培养皿培养：将如权利要求1所述真菌GX-4的菌种在无菌条件下接种于固体培养基上，于20-30℃下培养4-6天；所述固体培养基由以下组分组成：酵母提取物1-3g/L；醋酸钠1.5-4g/L；琼脂13-18g/L；氯霉素0.25mg/L；
b)一级种子培养：将步骤a)培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，于20-30℃下培养3-7天，制得一级种子；所述液体培养基由以下组分组成：蛋白胨8-12g/L；葡萄糖15-25g/L；氯霉素0.25mg/L；
c)二级种子培养：按液体培养基的体积比为5-15％的接种量，将所述一级种子接种到5L发酵罐中，曝气，培养5-7天，制得二级种子；
d)混合发酵培养：按液体培养基的体积比为10-20％的接种量，将二级种子接种到发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得菌剂。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤a)中于28℃下培养5天。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤a)中所述固体培养基由以下组分组成：酵母提取物1.5g/L；醋酸钠2.5g/L；琼脂15g/L；氯霉素0.25mg/L。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤b)中于28℃下培养5天。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤b)中所述液体培养基由以下组分组成：蛋白胨10g/L；葡萄糖20g/L；氯霉素0.25mg/L。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤c)中按液体培养基的体积比为8-12％的接种量。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤c)中培养5.5-6.5天。
10.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤d)中按液体培养基的体积比为12-18％的接种量。
11.一种汞离子处理剂，其特征在于，所述汞离子处理剂包含如权利要求1所述的真菌GX-4。
12.一种处理含汞废水的方法，其特征在于，所述方法包括：
将如权利要求1所述的真菌GX-4、如权利要求2所述的菌剂或如权利要求11所述的汞离子处理剂与含汞废水接触；其中，所述含汞废水中汞离子的浓度在500mg/L以下。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述含汞废水中汞离子的浓度在250mg/L以下。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述含汞废水中汞离子的浓度在100mg/L以下。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)将含汞废水的pH值调节至4.5-7.6；
b)向步骤a)的水体中加入如权利要求1所述的真菌GX-4、如权利要求2所述的菌剂或如权利要求11所述的汞离子处理剂，于10-35℃下震荡2-8小时，震荡速度为150-220rpm；
c)静置8-16小时，取上清测定，下层过滤后保留吸附剂备用；
d)将吸附剂放入解吸剂中解吸，回收汞，同时循环利用吸附剂。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，步骤a)中将含汞废水的pH值调节至5.5-7.0。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，步骤a)中将含汞废水的pH值调节至6.0。
18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，步骤b)中于15-30℃下震荡3-5小时。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，步骤b)中所述震荡速度为160-200rpm。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，步骤b)中所述震荡速度为180rpm。
21.如权利要求15所述的方法，其特征在于，步骤c)中静置10-14小时。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，步骤c)中静置12小时。
23.如权利要求12或15所述的方法，其特征在于，所述处理为去除或回收所述含汞废水中的汞离子。
24.如权利要求12或15所述的方法，其特征在于，所述含汞废水来源于机械、化工或电子材料行业排放的工业废水。
25.如权利要求12或15所述的方法，其特征在于，所述含汞废水来源于电镀、冶炼、铸造、农药、采矿、染料、石油或印染行业排放的工业废水。
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