CN104560390A

CN104560390A - 一种单酶催化植物油制备天然香料的方法

Info

Publication number: CN104560390A
Application number: CN201310497257.8A
Authority: CN
Inventors: 朱竹君; 陈海敏; 严小军; 骆其君; 杨锐; 陈娟娟
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2013-10-21
Filing date: 2013-10-21
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2033-10-21
Also published as: CN104560390B

Abstract

一种单酶催化植物油制备天然香料的方法，其特征在于步骤：a、植物油水解，得到浓度为50～500mg/mL的植物油水解产物；b、取上述2.5～25uL植物油水解产物加入到0.25～2.5mL浓度为20～30mg/L的双功能酶蛋白溶液中，混匀后在18～22℃下震荡反应0.5～2.5h；c、在反应液中加入0.25～2.5mL乙醚，3～5℃避光震摇萃取50～70min，收集上层有机相；下层相中再加入乙醚重复抽提1～3次，后合并上层有机相，并加入1～5g无水硫酸镁充分干燥；d、将得到的有机溶剂相进行低温10～20℃旋转蒸发浓缩获得天然香料。采用植物油作为原料，来源丰富；采用酶法一步制备天然C5、C6、C7、C8、C9-烯醛类香料，制备工艺简单、易操作，同时反应条件温和、生产效率高，无有害物质产生。

Description

一种单酶催化植物油制备天然香料的方法

技术领域

本发明生物香料制备技术领域，具体是一种通过单酶一步催化植物油的水解物制备短链烯醛类天然香料的方法。

背景技术

天然植物油料在我国作为一种来源丰富的可再生的生物资源，有着重要的开发使用前景，但目前仅经过简单处理就直接出口国外市场，进一步开发利用的力度远远不够，附加值与利润率较低，深加工技术十分落后，环境污染和资源浪费十分严重，亟待进一步研究与开发。对这部分油料进行加工，使之能够生产高附加值的产品，变废为宝。在现代生活中，除了从天然物中提取香料外，还开发了其他途径进行香料的制成和提取，如有机合成的方法、酶催化法等。由于人们对绿色化学品的要求日渐提高，使得化学合成法在食品风味料生产中采用减少，而利用生物催化合成风味物质成为一条新兴路线。如Whitehead等人利用大豆脂肪氧合酶结合植物氢过氧化物裂解酶形成了一条生产天然清香味化合物的工艺，利用该法可得到1-己醇、顺-3-己烯-1-醇等。Noordermeer等以水解红花油、亚麻籽油为原料，利用脂肪氧合酶和氢过氧化物裂解酶生产六碳和九碳醛类物质；Cass等人设计一种中空纤维反应器进行番茄风味物质的生产。

由于酶法催化的环保性和安全性，现已越来越多被开发使用。但是，目前都是使用双酶联用或者粗酶提取物方法进行，同时带来了酶反应体系不好控制、产物得率有所降低等不良现象。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种单酶催化植物油制备天然香料的方法，具有工艺简单易操作、成本低、生产高效快速的特点。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种单酶催化植物油制备天然香料的方法，其特征在于包括以下步骤：

a、先将植物油进行水解，得到浓度为50～500mg/mL的植物油水解产物；

b、取上述2.5～25uL植物油水解产物加入到0.25～2.5mL浓度为20～30mg/L的双功能酶蛋白溶液中，混匀后在18～22℃下震荡反应0.5～2.5h；

c、在上述反应液中加入0.25～2.5mL乙醚，4～10℃避光震摇萃取50～70min，收集上层有机相；并在下层相中再加入乙醚重复抽提1～3次，后合并上层有机相，并加入1～5g无水硫酸镁充分干燥；

d、将得到的有机溶剂相进行10～20℃低温下旋转蒸发浓缩获得天然香料。

作为改进，所述步骤a)的植物油水解的具体过程为：取100～500mg植物油，加2～5mL含5～7%（wt）KOH的甲醇水溶液，充氮气1～2min后55～65℃水浴1.5～2.5h；冷却，加1:0.9～1.1（v/v）的HCl水溶液调节pH至小于1；再加2～5mL1:3～5（v/v）的氯仿/正己烷混合液抽提，3～5℃，9000～11000rpm/min离心4～6min，取上层有机相，余下混合液再重复抽提1～3次，合并有机相，氮气吹干后用1mL色谱甲醇定容。

上述甲醇水溶液的体积比为3～5：1。

作为优选，所述步骤b）中的双功能酶蛋白溶液为一种具有氢过氧化物裂解功能的脂氧合酶PhLOX。脂氧合酶PhLOX的cDNA，它的核苷酸序列如SEQIDNO.1所述。它的氨基酸序列如SEQIDNO.2所述。

作为改进，所述步骤c）的乙醚萃取的具体过程为：在的酶反应液中加1:0.9～1.1（v/v）的乙醚震荡混匀，3～5℃，9000～11000rpm/min离心4～6min，取上层有机相，余下混合液再重复萃取1～3次，合并有机相，加1～5g无水硫酸镁充分干燥。

再改进，所述步骤d)获得的天然香料为C5、C6、C7、C8、C9-烯醛类化合物。

最后，所述植物油为葵花籽、玉米油、芝麻油或者大豆油。

与现有技术相比，本发明的优点在于：采用植物油作为原料，原料来源丰富、成本低；采用酶法一步制备天然C5、C6、C7、C8、C9-烯醛类香料，具有制备工艺简单、易操作，同时反应条件温和、生产效率高且快速，无有害物质产生的特点，本发明为香料工业开辟一条高效、快速生产烯醛类天然风味香料的新途径，并为食品添加剂工业和日化工业提供新的物质基础。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1：双活性脂氧合酶蛋白PhLOX溶液的制备

采用TakaraRNAisoPluskit（Takara，日本），以trizol法提取坛紫菜叶状体的总RNA。采用TakaraprimescriptRTreagentkit（Takara，日本），对提取的坛紫菜叶状体总RNA进行反转录得到坛紫菜叶状体总cDNA。以此cDNA为模板，用一对带NdeΙ/Hind ΙΙΙ酶切位点的特异性引物扩增PhLOX基因的完整ORF，引物序列如下：

正向引物：5'GGAATTCCATATGATGGGGAATGCG3'

反向引物：5'CCCAAGCTTCTAGATGTCGATGGACAG3'。

克隆的目的片段首先连接到pMD-18T（Takara，日本）上形成LOX-18T的重组克隆载体，通过转化E.coliDH5α进行测序，以检测目的片段的编码正确性。选择pET-28a（Takara，日本）为表达载体，在每40μL体系中，取LOX-18T和pET-28a空载体各1μg并各自用2U的NdeΙ/HindΙΙΙ（BioLabs，英国）进行双酶切，37℃孵育2h以上。取5μL酶切产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，待质粒酶切完全后进行割胶回收和定量。在每20μL体系中，将回收的目的片段和表达载体按135ng/50ng的比例进行连接，采用1U的T4连接酶（Fermentas，美国）在4℃下连接过夜，以构建重组质粒LOX-28a。取所有连接液，与100μL感受态E.coliBL21（Takara，日本）快速混匀，冰中预冷30min，后42℃水浴热激90s，热激后立即插在冰中，以构建重组体系LOX-28a-BL21。冰浴5min后加入800μL、4℃预冷的LB液体培养基，37℃下200r/min摇菌2h。后取100μL菌液均匀涂布在含50μg/mL卡那霉素（Kana⁺）的LB固体平板上。平板倒扣放置在37℃下避光培养12h～16h，用10μL无菌移液枪头将肉眼可见的乳白色菌落挑取并溶解于20μL、含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中。取1μL该菌液作为模板，用上述带NdeΙ/HindΙΙΙ酶切位点的特异性引物进行PCR检测，检测程序同表1，PCR体系同表2。取5μL该PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其对应菌液的真阳性，后将剩余19μL菌液转移至5mL的LB+Kana⁺（50μg/mL）液体培养基中扩大培养，37℃、200r/min、12h。取1mL菌液送测序以确定重组载体的编码正确性，得到的真阳性克隆体LOX-28a-BL21。

表1PhLOX的PCR检测程序

将克隆体LOX-28a-BL21于300mL的LB+Kana⁺（50μg/mL）液体培养基中扩大培养至OD600=0.6，37℃、250r/min，后加0.1mMIPTG诱导表达。诱导条件为20℃，100rpm，16h。诱导完成后，以5000rpm，4℃，15min离心收集菌体。去上清培养液，再用10mL细胞裂解液bufferA-ΙΙ（50mMTris-HCl，pH8.0，200mMNaCl，10%（v/v）glycerol，0.1%tween20）充分重悬菌体。以6500rpm，20s-破碎/2min-冰浴的程序进行菌体破碎匀浆（BertintechnologiesPrecellys24Dual，法国），循环4次。12000rpm，4℃，10min离心匀浆液，并收集上清。

采用6×His-Tagged Protein Purification Kit（CWBIO，中国）对上清液进行目的蛋白的纯化。依次以含20mL的10mM、50mM、150mM、500mM咪唑的洗脱液进行梯度洗脱，收集150mM的梯度洗脱液，即为含PhLOX蛋白的溶液。将此洗脱液通过10000（MW）截留分子量的MilliPower超滤管去咪唑，4000rpm，4℃，离心40min，再用10mLBffuerA-ΙΙ冲洗超滤膜以回收目的蛋白。

分别在2mL目的蛋白溶液中加入100μM的游离不饱和脂肪酸底物，游离不饱和脂肪酸底物分别为亚麻酸（ALA）和花生四烯酸（ARA），混匀后在20℃下孵育15min，后用GC-MS检测分析。实验结果显示目的蛋白PhLOX液催化亚麻酸产生了2-己烯醛、3-己烯醛、2-庚烯醛等挥发性化合物，催化花生四烯酸产生了2-壬烯醛、3-壬烯醛、1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮、2-辛烯-1-醇、3,5-辛烯-2-酮和2,6-2-烯-壬醛等挥发性物质，说明它是具有氢过氧化物裂解酶活性的一类脂氧合酶。最后经过检测证实，脂氧合酶PhLOX的cDNA，它的核苷酸序列如SEQIDNO.1所述。它的氨基酸序列如SEQIDNO.2所述。

实施例2

将100mg玉米油加入2mL的6%KOH-甲醇水（4/1，v/v）溶液中，充氮气1min后60℃水浴2h。冷却后用1:1（v/v）HCl调节pH至小于1。再用2mL1:4（v/v）氯仿:正己烷进行抽提。4℃，10000rpm/min离心5min，离心后取上层有机相，余下混合液再重复抽提2次，合并有机相，进行氮气吹干，加1mL色谱甲醇进行溶解。取4μL玉米油水解产物（95.5mg/mL）加入0.5mL25mg/L浓度的LOX蛋白纯化溶液中，混合均匀后在20℃下震荡反应1h。产物提取和检测方法为：在反应液中加0.5mL乙醚（色谱纯），4℃避光振摇1h，4℃，10000rpm/min离心5min，分离上层有机相。并在下层相中再加入0.5mL乙醚重复抽提2次后收集上层有机相。合并3次收集液，加入1g无水硫酸镁进行干燥。16℃下旋转蒸发进行产物挥发性成分的浓缩收集。利用固相微萃取柱吸附产物，通过GC-MS分析产物种类，所得到的天然香料包括2-己烯醛、正庚醛、2-庚烯醛、2-辛烯醛和2,4-壬二烯醛，其中以2-辛烯醛为主要产物。

实施例3

将500mg葵花籽油加入4mL的6%KOH-甲醇水（4/1，v/v）溶液中，充氮气1min后60℃水浴2h。冷却后用1:1（v/v）HCl调节pH至小于1。再用4mL1:4（v/v）氯仿:正己烷进行抽提。4℃，10000rpm/min离心5min，离心后取上层有机相，余下混合液再重复抽提2次，合并有机相，进行氮气吹干，加1mL甲醇进行溶解。取15μL葵花籽油水解产物（476mg/mL）加入2mL25mg/L浓度的LOX蛋白纯化溶液中，混合均匀后在20℃下反应进行2h。产物提取和检测方法为：在反应液中加2mL乙醚（色谱纯），4℃避光振摇1h，4℃，10000rpm/min离心5min，分离上层有机相。并在下层相中再加入2mL乙醚重复抽提2次后收集上层有机相。合并3次收集液，加入5g无水硫酸镁进行干燥。16℃下旋转蒸发进行产物挥发性成分的浓缩收集。利用固相微萃取柱吸附产物，通过GC-MS分析产物种类，所得到的天然香料包括2,4-戊二烯醛、2-己烯醛、3-己烯醛、正庚醛、2-庚烯醛、2-辛烯醛和2,4-壬二烯醛，其中以2,4-戊二烯醛为主要产物。

Claims

1.一种单酶催化植物油制备天然香料的方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤a)的植物油水解的具体过程为：取100～500mg植物油，加2～5mL含5～7%（wt）KOH的甲醇水溶液，充氮气1～2min后55～65℃水浴1.5～2.5h；冷却，加1:0.9～1.1（v/v）的HCl水溶液调节pH至小于1；再加2～5mL1:3～5（v/v）的氯仿/正己烷混合液抽提，3～5℃，9000～11000rpm/min离心4～6min，取上层有机相，余下混合液再重复抽提1～3次，合并有机相，氮气吹干后用1mL色谱甲醇定容。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述甲醇水溶液的体积比为3～5：1。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤b）中的双功能酶蛋白溶液为一种具有氢过氧化物裂解功能的脂氧合酶PhLOX。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤c）的乙醚萃取的具体过程为：在的酶反应液中加1:0.9～1.1（v/v）的乙醚震荡混匀，3～5℃，9000～11000rpm/min离心4～6min，取上层有机相，余下混合液再重复萃取1～3次，合并有机相，加1～5g无水硫酸镁充分干燥。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤d)获得的天然香料为C5、C6、C7、C8、C9-烯醛类化合物。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述植物油为葵花籽、玉米油、芝麻油或者大豆油。