CN104541168A

CN104541168A - 基于免疫测定法的溶液中结合动力学的测定

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Publication number: CN104541168A
Application number: CN201380041606.3A
Authority: CN
Inventors: U·达尔; G·乔丹; R·史塔克
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2012-08-08
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2033-08-02
Also published as: CN104541168B; KR20150039769A; CA2876455A1; EP2883051B1; HK1209487A1; US11892448B2; US20200173989A1; US20150168396A1; RU2015105038A; US20240102999A1; MX2015001202A; BR112015002083A2; WO2014023655A1; JP6336980B2; RU2648521C2; JP2015525886A; EP2883051A1

Abstract

本文报道了用于测定结合物与其配体的结合亲和力的方法，所述方法包含如下步骤：在样品中包含至少两个不同结合物：配体比率的结合物，配体和结合物-配体-复合物的样品中，基于免疫测定法结果测定游离结合物分数，并且如果测定的游离结合物分数不是对于所有使用的结合物：配体比率是可比的，则降低样品中结合物：配体比率，并通过相同的免疫测定法重新分析样品，并根据上述步骤中的游离结合物分数计算结合物与其配体的结合亲和力。

Description

基于免疫测定法的溶液中结合动力学的测定

本文报道了基于免疫测定法的缓冲液或血清/血浆样品中的溶液中结合动力学的测定。

背景技术

全身起作用的药物的药理作用不仅是药物内在活性的函数，而且也是其在人体中吸收，分布，代谢和排泄的函数。这些特征组合构成术语“药代动力学”。药代动力学通常指在有生命的生物体内对与药物和/或其代谢物的吸收、分布、代谢和排泄的动态过程相关的时间进程(即，动力学)的研究，并与生物制药学，药理学和治疗学领域密切相关。

因为身体延迟药物分子的跨膜运输，将其稀释至分布的多个区间，将其转换为代谢物，并最终排泄药物分子，所以通常很难预测药物在体内的药理作用。但是，研究人员通常使用药代动力学研究作为一种方法来预测药物在体内作用位点的效力。

传统上，参与临床前吸收，分布，代谢和排泄研究的研究人员使用药代动力学/数学模型并结合来自血液(或血清或血浆)和/或尿液的实际药物浓度数据，以及来自多种组织的浓度数据，以表征在有生命的生物体内药物的行为和方式。

在手边具有药代动力学信息可以看出：(1)药物是否吸收不良，产生亚治疗的循环水平，或(2)是否药物经历前全身代谢(Pre-systemicmetabolism)为非活性代谢物。这些信息也可以提供用于随后的决策的指导，如(1)是否通过改变盐形式或制剂，以改善药物的吸收，(2)是否调查制备前药的可能性，或(3)是否考虑不同的给药途径。

除了上述之外，药代动力学/数学模型一般也被认为是有用的，尤其是：(1)预测使用任何剂量方案的血浆，组织和尿的药物水平；(2)计算对于个体患者的最佳剂量方案；(3)估计药物和/或代谢物可能的积累；(4)关联药物浓度与药理和毒理活性(即药效学)；(5)评估制剂之间可利用度的速率和程度的差异(即生物等效性)；(6)描述生理或疾病的变化如何影响药物的吸收，分布和/或消除；(7)解释药物-药物和食物-药物的相互作用。

药代动力学的吸收，分布，代谢和排泄数据也成为有前景的新候选药物的药理学表征过程的组成部分。

因此，药物开发过程中重要的组成部分是药物的药代动力学(PK)和毒代动力学(TK)的表征和对药代动力学和药效学(PD)效果之间关系(PK/PD)的理解的建立。PK/TK评估的前提是可靠的生物分析方法的可利用性。小分子药物通常使用基于液相色谱-质谱(LC-MS)的方法定量，而相比之下，对治疗性蛋白的生物分析金标准技术是配体结合测定法(LBA)。除了高灵敏度和高通量的能力，LBA的主要优点是，能够分析总药物浓度，或者仅具体地分析具有配体结合能力的药物分子(“游离药物”)。

为了给出合理的数据解释，对用于药物定量的生物分析测定法的能力和局限性的清晰理解是必不可少的。确定游离药物浓度的先决条件是利用LBA，其通过使用例如，靶标捕获测定法能够在复合物基质中分析具有配体结合能力的药物分子。然而，仅使用选择的适当的测定法模式不一定足以准确测定游离药物浓度。药物和靶标以受质量作用定律支配的可逆的非共价方式相互作用。此外，LBA均等地基于药物/分析物和测定试剂之间可逆的非共价相互作用。因此，测定结果很容易由结合伙伴的平衡中的任何干扰混淆。此类测定干扰已在目前的文献提出，但没有详细讨论，(见例如Lee,J.W.,等人,AAPS.J.13(2011)99-110,Kuang,B.,等人,Bioanal.2(2010)1125-1140)。

用于治疗性蛋白生物分析的标准技术是配体结合测定法(LBA)。LBA的主要优点是能够区分总药物浓度和具有靶标结合能力的药物浓度。然而，仅仅是选择的适当的测定法模式不一定足以准确测定游离药物浓度。药物，靶标和测定试剂以受质量作用定律支配的可逆的非共价方式相互作用。因此，测定结果很容易由结合伙伴的平衡中的任何干扰混淆。然而，清楚地了解测定法的可能性和局限性，对于给出合理的数据解释是必要的(见例如Staack,G.,等人,Bioanalysis 4(2012)381-395)。

在WO2008/005674中报道了分析缔合阶段互作用的方法。在US6057160中报道了考马斯亮蓝/蛋白复合物的制备方法和用途。Azimzahdeh,A.和Van Regenmortel,M.H.V报道了在平衡混合物中通过ELISA滴定游离的抗体测量病毒单克隆抗体的亲和力(J.Immunol.Meth.141(1991)199-208)。Lee,J.W.,等人(AAPS J.13(2011)99-110)报告了定量“总”和“游离”治疗性抗体和其靶标的生物分析方法。Staack,R.F.,等人报道了用于生物分析测定法开发的数学模拟(Bioanalysis 4(2012)381-395)。在WO2011/094445中报道了用于靶向广谱流感中和的改造的多肽活性剂。

发明内容

一直存在测定样品中的游离药物/结合物的需要，所述样品含有游离药物/结合物(binder)，靶标-药物/配体-药物复合物和游离靶标/配体的混合物。

已经发现对缓冲液或血清/血浆样品中结合物和其配体的亲和力和结合动力学(K_D，为结合速率和解离速率的速率常数)的测定可以用非常有限的/少量的测量/样品来实现，即一个或两个(并且提供适当的校准)。该方法是基于以下发现，即游离结合物或游离配体的测定是可能的如果在曲线的线性/恒定的平台范围内进行测定(在低的结合物/高的配体浓度下游离结合物分数没有变化，或者在高的结合物/低的配体浓度下游离配体分数没有变化)。

已经发现，测定单一的(一个)值(即，例如游离结合物的量的一个值)足以测定亲和力。如果可选地进一步测定第二值，该方法还包括测定的结果的内在质量控制。因此，使用如本文中所报道的方法不必获取和分析困难的数据点作图。甚至不必进行所测定的数据点的最佳拟合。

如果亲和力是已知的，通过测定一个值来测定结合动力学是可能的。

已经发现，应当使用一个伙伴(partner)过量(结合物比配体过量(高的结合物：配体比率)或配体比结合物过量(高的配体：结合物比率))的样品进行测量。

在一个实施方案中过量的一个伙伴是10倍。在一个实施方案中过量的一个伙伴是至少40倍。在一个实施方案中过量的一个伙伴是至少100倍。

已发现，如本文报道的方法可用于包含血清或血浆的样品。

在如本文所报道的方法中，配体或结合物的浓度保持恒定，而各个其他伙伴(即结合物或配体)的浓度变化。

在如本文报道的方法的一个实施方案中，结合物的浓度保持恒定，而配体的浓度变化。

已经发现，在低的结合物：配体比率(即低于1)下，可以观察到游离结合物的平台，其是配体浓度和K_D特异的，因而，在低的结合物：配体比率下获得游离结合物分数的恒定值。同样地，在高的结合物：配体比率(即高于1)下，可以观察到游离配体的平台，其是结合物浓度和K_D特异的，因此，在高的结合物：配体比率下获得游离配体分数的恒定值。

如本文所报道的一个方面是用于测定结合物与其配体的结合亲和力(K_D值)的方法，所述方法包括以下步骤：

-在游离结合物平台测定含有结合物，配体和非共价结合物-配体-复合物的样品中游离(即未络合的)结合物的分数，所述游离结合物特异性地结合配体，以及

-基于上述步骤中测定的游离(未络合的)结合物的分数计算结合物与其配体的结合亲和力(K_D值)。

如本文中所报道的一个方面是用于测定结合物与其配体的结合亲和力(K_D值)的方法，所述方法包括以下步骤：

-在游离配体平台测定含有结合物、配体和非共价结合物-配体-复合物的样品中游离(即未络合的)配体的分数，所述游离配体特异性地结合结合物，以及

-基于上述步骤中测定的游离(未络合的)配体的分数计算配体与其结合物的结合亲和力(K_D值)。

-在游离结合物平台或游离配体平台测定含有结合物，配体和非共价结合物-配体-复合物的样品中结合物-配体-复合物的分数，

-基于测定的结合物-配体-复合物计算游离(未络合的)结合物或配体的分数，和

-基于上述步骤中计算的游离(未络合的)结合物或配体的分数计算配体与其结合物的结合亲和力(K_D值)。

-在样品中含有至少两个不同的结合物:配体比率的结合物，配体和非共价结合物-配体-复合物的样品中，测定游离(非络合的)结合物的分数，所述游离结合物特异性地结合配体，并且如果测定的游离(非络合的)结合物分数不是对所有使用的结合物：配体比率是可比的，则降低样品中的结合物：配体比率(即配体量恒定，减少结合物的量)并重新分析样品，

或

在样品中含有至少两个不同的结合物:配体比率的特异性地结合配体的结合物，配体和非共价结合物-配体复合物的样品中，测定游离(即非络合的)配体的分数，并且如果测定的游离(非络合的)配体分数不是对所有使用的结合物：配体比率是可比的，则增加样品中的结合物：配体比率(即结合物量恒定，减少配体的量)并重新分析样品，

-基于上述步骤中测定的游离(非络合的)结合物的分数计算或者基于上述步骤中测定的游离(未络合的)配体的分数计算结合物与其配体的结合亲和力(K_D值)。

在一个实施方案中，该方法不是Scatchard分析。

在一个实施方案中，该方法不要求数据点的线性化。

在一个实施方案中，该方法不需要计算EC₅₀或IC₅₀值。

在一个实施方案中，使用两个或三个不同的结合物：配体的比率。

-在样品中含有第一结合物:配体比率的结合物，配体和结合物-配体-复合物的样品中，测定游离(非络合的)结合物的分数，

以此结合物：配体比率等于或小于对于至少两个不同的结合物：配体比率所测定的游离(非络合的)结合物的分数是可比较的结合物：配体比率，

-在样品中含有至少第二结合物:配体比率的结合物，配体和结合物-配体-复合物的样品中，测定游离(非络合的)结合物的分数，

以此通过增加或减少样品中配体的量，并通过维持样品中结合物的量使第二结合物：配体比率不同于第一结合物：配体比率，

以此对于样品中增加或降低结合物量的样品中增加或降低配体量的结合物：配体比率，游离(非络合的)结合物的分数是可比较的，

-在样品中含有第一结合物:配体比率的结合物，配体和结合物-配体-复合物的样品中，测定游离(非络合的)配体的分数，

以此结合物：配体比率等于或大于对于至少两个不同的结合物：配体比率所测定的游离(非络合的)配体的分数是可比较的结合物：配体比率，

-在样品中含有至少第二结合物:配体比率的结合物，配体和结合物-配体-复合物的样品中，测定游离(非络合的)配体的分数，

以此通过增加或减少样品中结合物的量，并通过维持样品中配体的量使第二结合物：配体比率不同于第一结合物：配体比率，

以此对于样品中增加或降低配体量的样品中增加或降低结合物量的结合物：配体比率，游离(非络合的)配体的分数是可比较的，

-基于上述步骤中测定的游离(未络合的)配体的分数计算结合物与其配体的结合亲和力(K_D值)。

以此对于样品中增加或降低配体量的样品中增加或降低结合物量的结合物：配体比率，游离(非络合的)结合物的分数是可比较的，

-在样品中含有第一结合物:配体比率的结合物，配体和结合物-配体-复合物的样品中，测定结合物-配体-复合物的分数，

以此结合物：配体比率等于或大于对于至少两个不同的结合物：配体比率所测定的结合物-配体-复合物的分数是可比较的结合物：配体比率，

-在样品中含有至少第二结合物:配体比率的结合物，配体和结合物-配体-复合物的样品中，测定结合物-配体-复合物的分数，

以此对于样品中增加或降低配体的量的样品中增加或降低结合物量的结合物：配体比率，结合物-配体-复合物的分数是可比较的，

-基于上述步骤中测定的结合物-配体-复合物的分数计算结合物与其配体的结合亲和力(K_D值)。

-确定具有不同的结合物：配体比率的至少两个样品中游离结合物分数，

以此在至少两个样品中结合物的量保持恒定(是相同的)并且配体的量在各样品中不同，附带条件是样品含有较之结合物过量的配体，

或

确定具有不同的结合物：配体比率的至少两个样品中游离配体分数，

以此在至少两个样品中配体的量保持恒定(是相同的)并且结合物的量在各样品中不同，附带条件是样品含有较之配体过量的结合物，

-基于上述步骤中测定的游离(非络合的)结合物分数计算，或基于上述步骤中测定的游离(未络合的)配体分数计算各样品中结合物与其配体的结合亲和力(K_D值)，

以此如果至少三个K_D值是可比较的，则结合亲和力已经测定，

以此如果至少两个K_D值是不可比较的，使用如下样品重复该方法，

与之前的测定法中使用的样品相比，在样品中

ⅰ)结合物的量恒定，而配体的量减少，或者

ⅱ)配体的量恒定，而结合物的量减少。

在如本文所报道的所有方面的一个实施方案中，结合物/配体选自抗原/抗体，细胞/标记物，药物/靶标，受体/受体配体，酶/酶底物，和络合剂/金属离子。

在如本文所报道的所有方面的一个实施方案中，结合物选自小分子药物，生物活性多肽和抗体。

在如本文所报道的所有方面的一个实施方案中，抗体选自全长抗体，抗体片段和抗体缀合物。

在如本文所报道的所有方面的一个实施方案中，抗体选自单特异性抗体，双特异性抗体，三特异性抗体，四特异性抗体，和六特异性抗体。

在如本文所报道的所有方面的一个实施方案中，抗体选自二价抗体，三价抗体，四价抗体，和六价抗体。

在如本文所报道的所有方面的一个实施方案中，样品包含血清或血浆。

在如本文所报道的所有方面的一个实施方案中，通过免疫测定法进行测定。在一个实施方案中通过相同的免疫测定法进行重新分析。在一个实施方案中所述免疫测定法是异质测定法。

在如本文所报道的所有方面的一个实施方案中，药物/结合物是抗体，且靶标/配体是由抗体特异性地结合的抗原。

在如本文所报道的所有方面的一个实施方案中，结合物或配体固定在固相上。

在如本文所报道的所有方面的一个实施方案中，使用下面的等式计算K_D值：

K_D＝(游离药物/结合物分数)＊(靶标/配体浓度[nM])/(1-游离药物/结合物分数)。

在如本文所报道的一个方面是游离结合物平台处测定的单个数据点(使用适当的校准测定)用于测定溶液中的亲和力(K_D)的用途。

在如本文所报道的一个方面是如本文报道的方法用于测定K_D，来测定结合动力学/速率常数(k_on和k_off)的用途，其通过在结合物和配体的缔合或样品稀释诱导的解离阶段中测定游离结合物或配体浓度实现。

如本文中所报道的一个方面是如本文报道的方法用于测定溶液中结合动力学/速率常数(k_on和k_off)的用途。

如本文中所报道的一个方面是如本文报道的方法用于测定溶液中k_on值的用途。在这种情况下，K_D值是已知的。

如本文中所报道的一个方面是如本文报道的方法用于测定溶液中k_off值的用途。

附图说明

图1游离药物/结合物分数对可变的药物/结合物和靶标/配体浓度的依赖性，假定为通常的亲和力(K_D＝固定(0.1nM(1x10^-10M))，靶标/配体＝可变，药物/结合物＝可变)。

图2ELISA试验步骤示意图说明(1)。

图3ELISA试验步骤示意图说明(2)。

图4测定法的校准曲线。

图5示例的游离药物/结合物浓度曲线表明游离药物/结合物分数对可变的总药物/结合物浓度的依赖性。

图6游离药物/结合物分数对时间和达到平衡后的缓冲稀释后的依赖性。

图7药物/结合物浓度，靶标/配体浓度和亲和力/K_D之间的的相互依赖性关系。

图8游离药物/结合物分数取决于在恒定靶标/配体浓度时的药物/结合物浓度，其中抗-VEGF抗体作为药物/结合物和VEGF作为靶标/配体测定。

图9K_D是不依赖游离药物/结合物平台中药物/结合物浓度的常数。

图10K_D是不依赖游离药物/结合物平台中靶标/配体浓度的常数。

图11基于免疫测定法的结合动力学测定的示意图说明。

发明详述

已经发现缓冲液或血清/血浆样品中结合物与其配体的亲和力和结合动力学(K_D，结合和解离率的速率常数)的测定可通过小数目的样品进行，该测定基于游离结合物或游离配体的测定，因而该测定应在曲线的线性/恒定平台范围内进行，即在低的结合物/配体浓度下，游离结合物分数没有变化，或在高的结合物/配体浓度下，游离配体分数没有变化)。

已经发现，在低的结合物：配体比率下可以观察到游离结合物平台，其是配体浓度和K_D特异的，因而，在低的结合物：配体比率下得到游离结合物分数的恒定值。同样地，在高的结合物：配体比率下可以观察到游离配体的平台，其是结合物浓度和K_D特异的，因此，在高的结合物：配体比率下得到游离配体分数的恒定值。

术语“游离结合物平台”表示样品中在恒定的配体浓度下结合物的浓度范围，所述样品包含不同的结合物浓度，恒定的配体浓度和相应的非共价结合物-配体复合物，其中游离结合物分数保持不变(见，例如图5)。

术语“游离配体平台”表示样品中在恒定的结合物浓度下配体的浓度范围，所述样品包含不同的配体浓度，恒定的结合物浓度和相应的非共价结合物-配体复合物，其中游离配体分数保持不变。

术语“可比较的”表示两个测定值的相对差(％Diff)小于100％。在一个实施方案中所述差小于50％。在一个实施方案中所述差小于30％。差(％Diff)的计算使用以下公式：

％Diff＝[(最高值)-(最低值)]/(值的算术平均值)。

例如，在第一测定中测定了10％的游离结合物，并且在第二测定中测定了13％的游离结合物。根据上述公式，其所产生的差是26％(13-10)/((13+10)/2)＝26％)。

术语“不可比的”表示两个测定值的相对差(％Diff)是100％以上。在一个实施方案中差是50％以上。在一个实施方案中差是30％以上。差(％Diff)的计算使用以下公式：

％Diff＝[(最高值)-(最低值)]/(值的算术平均值)。

以下用药物作为结合物的例子和用靶标作为配体的例子举例说明了本发明。药物特异性地与靶标相互作用。

如图7所示，药物浓度，靶标浓度和亲和力(K_D)之间存在相互依赖性。

在低的药物：靶标比率下可以观察到游离药物平台，其是靶标浓度和K_D特异性的。图8显示实验测定的游离药物分数依赖于靶标浓度恒定时的药物浓度。可以看出在低的药物：靶标比率下得到游离药物分数的恒定值。

同样地，在高的药物：靶标比率下可以观察到类似的平台。此平台也可用于测定K_D值。因此，涉及低的药物：靶标比率(靶标过量)的所有方面和实施方案也可以用高的药物：靶标比率(药物过量)进行。

同样的，如果使用过量的药物可以通过测定游离靶标浓度而变化该方法。因此，针对药物的所有方面和实施方案，也可以在针靶标时进行。

已经发现，在游离药物平台内游离药物分数并且相应地K_D值是恒定，其不依赖于药物浓度(参见图9)。

已经发现，在游离药物平台内K_D值是恒定的，其不依赖于靶标浓度(见图10)。

为了测定缓冲液或血清/血浆样品中药物-靶标亲和力和结合动力学(K_D，结合和解离速率的速率常数)，以不同的预期游离药物/分析物浓度产生样品(对于K_D评估，必须达到平衡)。游离药物/分析物分数必须处于曲线的线性/恒定平台范围内(低的药物/分析物浓度，游离药物分数没有变化)。图1给出第一游离药物/分析物分数估计的相应浓度。分析真正的游离药物/分析物分数。通过使用测定的游离药物分数计算亲和力(K_D)和速率常数(kon，koff)。

因此，适合测定游离药物分数的任何方法可用于如本文报道的方法中。

备选地，可以通过使用用于测定所形成的复合物的测定法设置间接测定游离药物分数。

例如，为了测定缓冲液或血清/血浆样品中的游离药物/分析物浓度，可以使用两个串行夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)。

图2和3示出了基于ELISA的测定程序的不同步骤。

更详细地，生物素化的捕获蛋白(靶标-Bi)，药物/分析物，mAb<药物/分析物>-Dig和抗-地高辛-POD依次加入到链霉亲和素(SA)包被的微滴定板(MTP)，在MTP摇床孵育各试剂1小时。为了加速测定，可选择地，可以使用mAb<药物/分析物>-POD来代替mAb<药物/分析物>-Dig和抗-地高辛-POD的组合。

为了溶液中的游离药物/分析物浓度的准确成像，将药物/分析物孵育约5分钟。(在信号产生和平衡的最小干扰之间折衷)。

每个步骤后洗涤MTP三次，除去残留液体。最后，通过加入将被转化为有色反应产物的TMB溶液(一种POD底物)，使形成的被固定的免疫复合物可视化。应当用光度监测显色(在680nm–450nm的参考波长下的吸光)，当最高校准物达到OD为0.65时，通过加入1M H ₂SO₄停止显色。最后，通过光度测定颜色强度(在450nm–690nm的参考波长下的吸光)，且颜色强度与血清/血浆/缓冲液样品中的分析物浓度成比例。使用相应的具有非线性4参数Wiemer-Rodbard曲线拟合函数的标准曲线，通过吸光度值的回算进行药物/分析物的定量。

重新计算孵育样品的游离药物浓度后，可绘制类似于图5中所示的曲线。在平台上应该获得至少两个可比较的游离药物的值(测定法的直接质量控制，例如靶标的低聚化)。

使用以下公式计算K_D值：

K_D＝(游离药物分数)*(靶标浓度[nM])/(1-游离药物分数)

示例性的计算(也见实施例3)：

靶标浓度＝1nM的＝常数

药物浓度：17ng/mL得到游离药物分数为9.2％

药物浓度：8.5ng/mL得到游离药物分数为7.6％

因此，K_D＝0.1nM和0.08nM

使用如本文中所报道的方法，需要低的药物量，能够分析/表征高亲和力的药物。

如本文中所报道的一个方面是如本文中所报道的方法用于测定二价药物，如抗体的K_D值中的用途。

在一个实施方案中，通过从处于平衡状态的样品开始的稀释诱导的药物靶标复合物的解离测定K_D值。

用于确定二价药物K_D值的所有在溶液中的方法的固有问题是存在完全游离药物(无价占用)，部分游离药物(1价占用)和结合药物(两个价均占用)之间的平衡，因为在溶液中的方法是基于游离药物的测定。

通常用于测定二价药物K_D值的样品包含已知量的药物和靶标。通过与样品中存在的游离药物量相关的游离药物校准曲线进行游离药物测定法的读出。对于二价药物，游离药物是完全游离药物和部分游离药物的混合物，以此其单个分数根据统计学分布而分布。可使用完全游离药物和部分游离药物的统计分布来确定实际游离药物浓度，从而得到确定的具有结合能力的药物的总量。

该方法可以包括以下步骤：

1)固定靶标，例如将捕获蛋白(靶标-Bi)包被在链霉亲和素包被的固相(如微滴定板)

2)与样品，QC和校准物孵育

3)检测带有标记的抗-药物抗体的捕获的药物，如：mAb<药物/分析物>-Dig

4)用标记的二抗(例如用抗-地高辛-POD)检测一抗

此外，第3步和第4步可由用mAb<药物/分析物>-POD孵育替换。

5)读出

6)数据分析

计算每个标准品和每个样品稀释度的平均值。

通过使用Wiemer-Rodbard函数(例如，通过使用XL拟合)的非线性4参数拟合产生标准校准曲线：

\begin{matrix} OD = A + \frac{B}{1 + C * X^{D}} & X = \sqrt[D]{\frac{A + B - OD}{C * (OD - A)}} \end{matrix}

A和B负责信号偏差(接近校准曲线的起始和结束)。C和D负责曲线形状。

在0.033ng/mL(定量的下限)至8.0ng/mL(测定浓度)之间的浓度范围内实现测试样品稀释度的可重复的和可信的计算。稀释样品以适合该范围。

典型的校准曲线(用靶标浓度加权计算)和相应的测定数据示于图4中。

如本文中所报道的一个方面是如本文所报道的方法用于测定结合物结合动力学中的用途。

该方法包括三个步骤：

1)产生样品，

2)定量游离药物或游离靶标，和

3)计算结合动力学。

原则上两种方法是可能的：

a)缔合和平衡方法，和

b)平衡和解离方法，其通过在起始于平衡条件的样品中稀释诱导药物靶标复合物的解离。

对于给定的K_D只有一个k_on和k_off可在两个给定的时间点得到游离药物分数(参见图6)。

为了测定相互作用的速率常数，两种方法是可能的。为了计算速率常数，这两种方法均使用K_D值作为需要被确定的常数。一个可能的方法是，混合二个结合伙伴，并在缔合阶段期间测量例如游离药物分数(“缔合-平衡方法”)。另一种测定速率常数的可能性是通过稀释扰乱平衡的混合物，并在到达平衡之前测量例如解离阶段期间的游离药物分数(“平衡-解离方法”)。对于每一种方法只需要未平衡的样品的一个数据点。通过求解系统的差分方程(如反应第二阶)进行速率常数的计算。只有一对k_on(缔合的速率常数)和k_off(解离的速率常数)可能代表具有已知K_D值的系统。这两种方法的应用可用于所确定的动力学参数的相互确认。

为了计算速率常数，可以至少在一个不平衡的时间点进行估计的游离药物分数(见图6)对以下差分方程的计算解的拟合。亲和力(K_D)是具有锚计算的强制值。通过k_on或k_off变化进行拟合优化。

差分方程：

d/dt(药物)＝-k_on*药物*靶标+k_off*复合物

d/dt(靶标)＝-k_on*药物*靶标+k_off*复合物

d/dt(复合物)＝k_on*药物*靶标-k_off*复合物

为了测定结合动力学，可以使用如本文报道的用于测定游离药物的免疫测定法。

图11显示了测定法程序的不同步骤。

该测定法包括以下步骤：

1)制备样品

低的药物浓度和高的靶标浓度，或

高的药物浓度和低的靶标浓度

2)孵育和形成复合物

3)定量游离药物或定量游离靶标

见实施例2

4)计算游离药物分数或游离靶标浓度

例如

5)计算K_D值

因此，如本文所报道的方法具有以下特征，如

-对于测定结合亲和力(K_D值)

i)一个伙伴以(大)过量存在(或药物或靶标)，

ii)两个或三个样品的分析/测定足以确定KD值，和

iii)最突出的内置质量控制，用于检查样品是否在平台区内，

-对于测定结合动力学(k_on和k_off值)

i)使用免疫测定法测定结合动力学(不需要实时分析)，

ii)两个样品的分析/测定足以确定k_on和k_off值，和

iii)最突出的使用稀释方法用于测定结合动力学(通过稀释已经达到平衡的样品)，

-对于测定二价药物

i)最显着的使用统计学方法测定样品中完全游离和部分游离的药物。提供以下实施例和附图以帮助本发明的理解，本发明真正的范围列于所附的权利要求中。应理解可以对示出的程序的修改而不脱离本发明的主旨。

BLQ	低于定量限值
		BPA 1	牛血浆白蛋白1
CoA	分析的证明
		Conc.	浓度
CV	变异系数
		Dig	地高辛
ELISA	酶联免疫吸附测定法
		H₂SO₄	硫酸
IgG	免疫球蛋白G
		mAb	单克隆抗体
MTP	微滴定板
		OD	光密度
PBS	磷酸盐缓冲液钠盐
		POD	聚合辣根过氧化物酶
QC	质量控制
		RPM	每分钟转数
RT	室温(+15℃至+25℃)
		SA	链霉亲和素
SD	标准偏差
		TMB	3,3′,5,5′-四甲基联苯胺

实施例

材料

设备

96孔MTP用ELISA-读数仪(监控-λ：680/450nm，测量-λ：450/690nm)

微滴定板(MTP)-洗涤器

微滴定板(MTP)-振动器

标准和多排移液器

反应管

通用实验室设备

消耗品

链霉亲和素包被的微滴定板

即用的TMB底物溶液

10×PBS

在去离子水中1:10稀释至1×PBS。

白蛋白，牛血浆白蛋白1(BPA1)

吐温20

样品

最少10名健康未经处理的人个体的血清/血浆汇集(离心血清样品，以避免将凝块或混浊血清移至MTP孔)。

缓冲液

测定缓冲液：1×PBS中的0.5％BPA1

例如在1000mL 1×PBS中稀释5g BPA1

洗涤缓冲液：1×PBS/0.05％吐温20

例如在2000mL 1×PBS中稀释10mL吐温20

稀释液汇集血清/血浆：

在测定缓冲液中稀释的10％空白人血清汇集

例如混合1mL血清汇集与9mL测定缓冲液

试剂

抗-地高辛-POD(聚)，Fab片段(<Dig>-POD)

第二检测试剂

50U冻干等分，用1mL去离子水重建至50U/ml。

实施例1

K_D值测定的一般测定法原理

为了测定缓冲液或血清/血浆样品中游离药物/分析物的浓度，建立了两个串行夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)。

图2和3示出了测定程序的不同步骤。

生物素化的捕获蛋白(靶标-Bi)，药物/分析物，mAb<药物/分析物>-Dig和抗-地高辛-POD依次加入到链霉亲和素(SA)包被的微滴定板(MTP)，在MTP摇床孵育各试剂1小时。为了加速测定，可选择地，可以使用mAb<药物/分析物>-POD来代替mAb<药物/分析物>-Dig和抗-地高辛-POD的组合。

为了溶液中的游离药物/分析物浓度的准确成像，将药物/分析物孵育约5分钟(在信号产生和平衡的最小干扰之间折衷)。

每个步骤后洗涤MTP三次，除去残留液体。最后，通过加入将被转化为有色反应产物的TMB溶液(一种POD底物)，使形成的被固定的免疫复合物可视化。应当用光度监测显色(在680nm–450nm的参考波长下的吸光)，当最高校准物达到OD为0.65时，通过加入1M H ₂SO₄停止显色。最后，通过光度测定颜色强度(在450nm–690nm的参考波长下的吸光)，且颜色强度与血清/血浆/缓冲液样品中的分析物浓度成比例。使用具有非线性4参数Wiemer-Rodbard曲线拟合函数的相应的标准曲线，通过吸光度值的回算进行药物/分析物的定量。

实施例2

样品分析

在测定缓冲液中分析样品，质量控制样品(QC)和阳性对照标准物。

在+15℃至+25℃(RT)下进行所有测试程序的步骤。

给出的体积计算为用于制备单个MTP。如果分析一个以上的MTP，用MTP个数乘以如下所示的体积。最小移液体积为2μL。

为了确保精确的测量，所有的测试样品，阳性对照样品稀释液(标准曲线)和质量控制样品，应当一式两份进行分析。

制备校准标准品和测试样品：

制备标准药物/靶标(mAb<靶标>)的系列滴定物作为标准曲线，所述标准曲线包含7个不同校准物浓度和一个空白值(在100％汇集的缓冲液/血清/血浆中系列稀释1：2.5)。

如图1估计的制备几种测试样品(与靶标孵育药物/分析物)。强制地用于亲和力测定的样品以尽可能最低的药物/分析物浓度达到平衡。为了估计速率常数，强制地以准确的时间尺度，并且不在平衡时测量。

该测定法包括以下步骤：

1)在包被链霉亲和素的微滴定板上包被捕获蛋白(靶标-Bi)；孵育1小时而后洗涤3次

在测定缓冲液中制备终浓度为例如500ng/mL的12mL捕获试剂工作溶液靶标-Bi。

将100μL工作溶液移液到每个MTP孔。将MTP用粘性盖箔覆盖并在MTP摇床(450rpm)上孵育1小时。用每孔300μL的洗涤缓冲液洗涤MTP三次，除去剩余的洗涤缓冲液。而后，加入标准品和样品。

2)在平板上加载样品，QC和校准品；孵育约5分钟(尽可能短)，随后进行3次洗涤

将100μL标准品和100μL测试样品稀释液一式二份移液到指定的MTP孔。将MTP用粘性盖箔覆盖并在MTP-摇床(450rpm)孵育1小时。用每孔300μL的洗涤缓冲液洗涤MTP三次，除去剩余的洗涤缓冲液。而后，加入第一检测抗体。

3)用mAb<药物/分析物>-Dig检测；孵育1小时后洗涤3次

对于各MTP，制备测定缓冲液中的12mL第一检测试剂工作溶液，所述第一检测试剂工作溶液含有例如终浓度500ng/mL的mAb<药物/分析物>-Dig。

将100μL工作溶液移液到各MTP孔。将MTP用粘性盖箔覆盖并在MTP-摇床(450rpm)孵育1小时。用每孔300μL的洗涤缓冲液洗涤MTP三次，除去剩余的洗涤缓冲液。而后，加入第二抗体。

4)用抗-地高辛-POD检测；孵育1小时后洗涤3次

对于各MTP，制备测定缓冲液中的12mL第二检测试剂工作溶液，所述第二检测试剂工作溶液含有终浓度2.5mU/mL的<Dig>-POD。

将100μL该溶液移液到各MTP孔。将MTP用粘性盖箔覆盖并在MTP-摇床(450rpm)孵育1小时。用每孔300μL的洗涤缓冲液洗涤MTP三次，除去剩余的洗涤缓冲液。而后，加入底物试剂。

步骤3和步骤4可替换为用mAb<药物/分析物>-POD孵育。

5)用TMB溶液进行读出，并用H₂SO₄溶液中止。监测吸光，直到OD680/450达到0.65。直到OD450/690达到1.8-2.2时完成吸光测量。

将100μL TMB即用溶液移液到各MTP孔。MTP可与底物溶液在450rpm下振荡孵育。监测吸光数次以获得0.65的OD450/690最高标准溶液(c＝8.0ng/ml)。用50μL 1M H₂SO₄溶液中止反应，并测量吸光数次以达到1.8-2.2的OD450/690最高标准溶液(c＝8.0ng/ml)。

检测波长：680nm(参考波长：450nm)

测量波长：450nm(参考波长：690nm)

6)数据分析

计算各标准品和各样品稀释液的平均值。

通过使用Wiemer-Rodbard函数的非线性4参数拟合(例如，通过使用XL拟合)生成标准校准曲线：

\begin{matrix} OD = A + \frac{B}{1 + C * X^{D}} & X = \sqrt[D]{\frac{A + B - OD}{C * (OD - A)}} \end{matrix}

在0.033ng/mL(定量的下限)至8.0ng/mL(测定浓度)之间的浓度范围内实现测试样品稀释液的可重复的和可信的计算。稀释样品以符合该范围。

典型的校准曲线(用靶标浓度加权计算)和相应的测定数据示于图4和下表中。

表

实施例3

基于免疫测定法的溶液中K_D值的测定-使用双特异性抗-EGFR/IGFR抗体作为药物以及EGFR作为靶标的单价结合实施例

如上所述进行游离药物的免疫测定法和测定，以及对K_D值的计算。

在不同的日子用不同的药物和靶标浓度进行K_D测定(用15小时的孵育时间以确保平衡)。结果示于下表中。

表

可以看出，对K_D值的测定是可重复的且不依赖药物浓度和靶标浓度。

实施例4

基于免疫测定法的溶液中K_D值的测定-使用双特异性抗-EGFR/IGFR抗体作为药物以及IGFR作为靶标的单价结合实施例

表

实施例5

基于免疫测定法的结合动力学的测定–使用双特异性抗-EGFR/IGFR抗体作为药物以及EGFR作为靶标的缔合和平衡方法

使用浓度17ng/mL的双特异性抗体。使用浓度1nM的EGFR(靶标)。所测定的K_D值是0.09nM。

30分钟的孵育时间(缔合阶段)之后，测定的游离药物分数为0.31(图6中的第一时间点)。180分钟的孵育时间(平衡)之后测定的游离药物分数为0.09。

基于这些实验结果，计算的结合动力学参数k_off为0.000073(1/s)，计算的结合动力学参数k_on为7300000(1/s*nM)。

实施例6

基于免疫测定法的结合动力学的测定–使用双特异性抗-EGFR/IGFR抗体作为药物以及IGFR作为靶标的平衡和解离方法

使用浓度680ng/mL的双特异性抗体。使用浓度200nM的IGFR(靶标)。所测定的K_D值是9.4*10^-9M。

在平衡时测定的游离药物分数为0.07。在缓冲液稀释15分钟之后(解离阶段)测定的游离药物分数为0.67。

基于这些实验结果，计算结合动力学参数k_off为0.0014854(1/s)，计算结合动力学参数k_on为158020(1/s*nM)。

Claims

1.用于测定药物与其靶标的结合亲和力的方法，所述方法包括以下步骤：

-在游离药物平台测定含有药物，靶标和非共价药物-靶标复合物的样品中游离药物或游离靶标的分数，和

-基于上述步骤中测定的游离药物的分数计算或基于上述步骤中测定的游离靶标的分数计算药物对其靶标的结合亲和力。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其包括以下步骤:

-在样品中含有至少两个不同的药物:靶标比率的药物，靶标和药物-靶标复合物的样品中，基于免疫测定法的结果测定游离药物的分数，并且如果测定的游离药物分数不是对所有使用的药物：靶标比率是可比的，则降低样品中药物：靶标比率并通过相同的免疫测定法重新分析样品，

或

在样品中含有至少两个不同的药物:靶标比率的药物，靶标和药物-靶标复合物的样品中，基于免疫测定法的结果测定游离靶标的分数，并且如果测定的游离靶标分数不是对所有使用的药物：靶标比率是可比的，则增加样品中的药物：靶标比率并通过相同的免疫测定法重新分析样品，

-基于上述步骤中测定的游离药物分数计算或者基于上述步骤中测定的游离靶标分数计算药物与其靶标的结合亲和力。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于使用一个或二个或三个不同的药物:靶标比率。

4.用于测定药物与其靶标的结合亲和力的方法，所述方法包括以下步骤：

-在样品中含有第一药物:靶标比率的药物，靶标和药物-靶标复合物的样品中，基于免疫测定法结果测定游离药物的分数，

以此药物：靶标比率等于或小于对于至少两个不同的药物：靶标比率所测定的游离药物的分数是可比较的药物：靶标比率，

-在样品中含有至少第二药物:靶标比率的药物，靶标和药物-靶标复合物的样品中，基于免疫测定法结果测定游离药物的分数，

以此通过增加或减少样品中靶标的量，并通过维持样品中药物的量使第二药物：靶标比率不同于第一药物：靶标比率，

以此样品中增加或降低药物量的样品中增加或降低靶标量的药物：靶标比率和初始药物：靶标比率所确定的游离药物分数是可比较的，

-基于上述步骤中测定的游离药物分数计算药物与其靶标的结合亲和力。

5.用于测定药物与其靶标的结合亲和力的方法，所述方法包括以下步骤：

-在样品中含有第一药物:靶标比率的药物，靶标和药物-靶标复合物的样品中，基于免疫测定法结果测定游离靶标的分数，

以此药物：靶标比率等于或大于对于至少两个不同的药物：靶标比率所测定的游离靶标分数是可比较的药物：靶标比率，

-在样品中含有至少第二药物:靶标比率的药物，靶标和药物-靶标复合物的样品中，基于免疫测定法结果测定游离靶标分数，

以此通过增加或减少样品中药物的量，并通过维持样品中靶标的量使第二药物：靶标比率不同于第一药物：靶标比率，

以此样品中增加或降低靶标量的样品中增加或降低药物量的药物：靶标比率和初始药物：靶标比率的游离靶标分数是可比较的，

-基于上述步骤中测定的游离靶标分数计算药物与其靶标的结合亲和力。

6.用于测定药物与其靶标的结合亲和力的方法，所述方法包括以下步骤：

-测定具有不同的药物：靶标比率的至少三个样品中游离药物分数，

以此在至少三个样品中药物的量保持恒定并且靶标的量在各样品中不同，附带条件是样品含有较之药物过量的靶标，

或

测定具有不同的药物：靶标比率的至少三个样品中游离靶标分数，

以此在至少三个样品中靶标的量保持恒定并且药物的量在各样品中不同，附带条件是该样品含有较之靶标过量的药物，

-基于上述步骤中测定的游离药物分数计算，或基于上述步骤中测定的游离靶标分数计算各样品的药物与其靶标的结合亲和力，

以此如果至少三个K_D值是不可比的，使用如下样品重复该方法，

与之前的测定中使用的样品相比，在所述样品中

i)药物的量恒定，而靶标的量减少，或者

ii)靶标的量恒定，而药物的量减少，或者。

7.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于样品包含血清或血浆。

8.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于药物是抗体，并且靶标是特异性地被抗体结合的抗原。

9.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于靶标固定在固相上。

10.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于使用以下公式计算K_D值:

K_D＝(游离药物分数)*(靶标浓度[nM])/(1-游离药物分数)。