CN104535562A - 一种基于颜色的还原性糖快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于颜色的还原性糖快速检测方法；该方法包括：还原性糖与氧化性显色试剂在微孔板中发生颜色反应，其颜色变化与还原性糖的浓度有关。提取反应液颜色在颜色空间的色彩值，根据色彩值与还原性糖的对应关系，快速准确地确定还原性糖的浓度。其装置包括一个密闭的箱体，箱体上方装有摄像头，箱体后侧面装有平面灯，箱体正面安装有工业平面电脑，可控制样品的自动检测，箱体底部装有恒温加热器和微孔板载物台，载物台配有轴向固定轨道，可完成样品的自动进出。该方法和装置，可在30min内完成上百个样品的检测，误差控制在5％以内，实现了还原性糖的高通量、高精度快速检测。

Description

一种基于颜色的还原性糖快速检测方法

技术领域

本发明涉及一种物质检测的方法，特别涉及一种还原性糖的快速检测的方法和设备。

背景技术

还原性糖是指分子中含有游离醛基或酮基的单糖和含有游离醛基的二和多糖糖，包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、木糖、低聚木糖、麦芽糖、甘露糖、甘露醇、阿拉伯糖。还原性糖的检测是生化研究最重要的基础操作，因此开发新型检测方法一直是该领域的热门课题。

迄今为止，应用最早、最广泛的检测方法是铜试剂法。早在1848年Fehling就做出了碱性铜液，即硫酸铜碱性酒石酸钠溶液，称为Fehling试剂。还原糖在碱性环境中将二价铜离子还原成砖红色的Cu₂O沉淀，进而根据还原价态确定还原糖的数量。到1878年，Soxhlet发现糖和还原的通量并不是常数，而是依反应时铜过量的多少而不同，因此基于铜试剂的方法，需要预先制定出一个经验数据表。此外，该方法为了使还原糖的还原力达到最大，反应必须在沸水中进行，这增加了实验的不安全性；同时，Cu₂O沉淀需要通过称量确定，误差较大。以上原因导致该方法耗费时间，准确度低。

为了解决以上问题，Forsyth于1948年提出了利用苯酚和盐酸作 为展开剂的纸层析法，随后的20年里，层析法检测还原性糖成为了一个热点，相继出现了各种不同的展开剂，包括：三氯乙酸-丁醇、银氨溶液、苯酚-盐酸-丁醇等。但该方法操作步骤繁杂，糖在溶剂中容易扩散，造成边缘模糊，且许多物质容易混合在一起而无法分开，导致该法只能用于定性分析而无法准确定量。

出现于1972年水杨酸是第二种广泛应用并延续至今的化学方法。与铜试剂法相比，该方法具有简便、快速、灵敏度高等特点；同时，应用范围广，可用于多种氧化还原类型的酶促反应。其基本原理为3,5-二硝基水杨酸(DNS)在碱性溶液中与还原性糖供热后被还原成棕色氨基化合物，在一定范围内还原性糖的量与反应液的紫外吸光值成正比。然而这种方法在实际操作中具有明显的缺点，表现在(1)需用加热进行显色，步骤冗杂(2)反应时间较长(3)检测范围小，在较高或较低的浓度时准确度低(4)无法进行大通量操作。

最近的30年里，为了提高还原性糖的检测精度、简化操作工序、探索高通量的操作方案，相继产生了多种方法，其中较成功的就是氧化还原电极法，包括铂电极、硫选择电极、铜选择电极等。其基本原理为利用氧化铜与还原性糖反应导致的溶液氧化还原电势变化来确定还原性糖的浓度。但该方法需要昂贵的电极和复杂装配过程，无法在实验室普及。之后，带有自动进样器的高效液相色谱(HPLC)的出现，实现了兼顾还原性糖的精确度和高通量操作的目标。在HPLC中，还原性糖溶液在不同的时间被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物与固定相的相互作用不同，不同的物质依次离开色 谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，经过分析比对这些信号的强弱即可判断待测物所含有物质的浓度。HPLC具有分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，应用范围广等诸多优点。但是分析成本过高，日常维护费用过贵，同时HPLC对待测液的预处理要求严格，待测样品一般需要提前稀释，大大增加了人为误差，降低了工作效率。此外，还有旋光度法、生物传感器法等，均由于成本或操作等问题，不能应用于普通发酵的大通量检测。

值得注意的是，生化反应中常常伴有颜色变化，这些颜色带有重要的理化信息。遗憾的是，目前为止生化领域对于颜色信息一直缺少有力的研究方法。虽然生化研究一贯将反应信息转化为颜色信息，但由于缺少直接分析颜色的方法，该领域人员往往只能利用光透过有色溶液的光密度值(optical density)信息替代颜色分析，从而产生了很多的误差和操作的不便捷。本发明中将计算机分析技术引入生化反应研究，以还原性糖与氧化性指示剂反应中的颜色变化作为研究对象，尝试建立新型的高通量还原性糖检测方法。

发明内容

本发明的目的是针对还原性糖缺乏低成本、高通量、高精度检测方法的现状，提供一套基于颜色分析的快速检测方法和设备，通过还原性糖与氧化性指示剂所引起的颜色反应，对反应产物的颜色特征进行解析，确立颜色信息与还原性糖之间的对应关系，通过样品图像，即可准确测定还原性糖的浓度。

本发明的技术方案，通过下述步骤实现：

本发明的装置基本构造如附图1：

其装置包括一个密闭的箱体(1)，箱体上方装有摄像头(2)，箱体后侧面装有平面灯(3)，箱体正面安装有工业平面电脑(4)，箱体底部装有恒温加热器(5)和微孔板载物台(6)，移动导轨(7)，密闭箱体(1)的底部被分为两个区域：加热区(8)和检测区(摄像头(2)正下方)。加热区的组件为恒温加热器(5)，其可以提供0-100℃的恒定反应温度，具体的数值可在工业平面电脑(4)上进行设定。

操作步骤包括：

(1)利用移液枪将适量体积的待测还原性糖溶液与氧化性显色剂装载于微孔板中；

(2)将微孔板置于微孔板载物台(6)，由载物台传送轨道(7)传送至恒温加热器(5)，60-100℃加热1-30min；

(3)加热后的微孔板由载物台传送轨道(7)传送至摄像头(2)下方，由摄像头(2)进行图像拍摄，记录各孔道颜色；

(4)工业平面电脑(4)装有自动分析的软件，自动对记录的样品颜色进行解析，并根据色彩值与还原性糖的对应关系，快速准确地确定还原性糖的浓度，并生成报告。

本发明所述的还原性糖是指分子中含有游离醛基或酮基的单糖、含有游离醛基的二糖和多糖，包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、木糖、低聚木糖、麦芽糖、甘露糖、甘露醇、阿拉伯糖、纤维二糖；所述的氧化性指示剂是指自身具有氧化性、被还原后发生颜色变化的指示剂，包括氧化铜、银氨溶液、3,5-二硝基水杨酸、斐林试剂；颜色 的色彩值包括颜色值、色调、亮度、饱和度。

本发明的有益效果：①高效率。该方法可在30min内完成1000个样品的检测，速度是高效液相色谱的200倍。②高量程。该方法的检测量程为0-20g/L，是标准3,5-二硝基水杨酸法的20倍。③操作简单。该方法不需要水浴加热等复杂操作步骤，保证了工作效率，便于自动化仪器的搭建。④成本低。该方法检测100个样品的是标准DNS法消耗的酒石酸钠、3，5-二硝基水杨酸的8.5％。

附图说明

图1，快速检测装置正面图

图2，快速检测装置侧视图（侧面俯视图）

图3，快速检测装置工作区域指示图

图面说明如下：

1箱体，2摄像头，3平面灯，4工业平面电脑，5恒温加热器，6微孔板载物台，7载物台传送轨道，8加热区，9图像采集区。 

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

用移液枪吸取170μL已知浓度的葡萄糖0.5g/L,2.5g/L,7.5g/L,12g/L,16g/L样品于96微孔板中后，各孔道加入170μL 10g/L 3,5-二硝基水杨酸溶液，100℃反应4分钟后，以反应溶液的颜色在RGB颜色空间中的R值对各样品浓度进行预测，各样品分别检测100次，使用时间为6min，平均值分别为0.48g/L,2.52g/L,7.35g/L,11.68g/L, 16.12g/L，最大误差分别为3.31％，3.36％，4.25％，3.38％，4.41％。

实施例2

用移液枪吸取170μL已知浓度的木糖0.5g/L,2.5g/L,7.5g/L,10g/L,18g/L样品于96微孔板中后，各孔道加入170μL 10g/L 3,5-二硝基水杨酸溶液，90℃反应5分钟后，以反应溶液的颜色在RGB颜色空间中的R值对各样品浓度进行预测，各样品分别检测100次，使用时间为9min，平均值分别为0.51g/L,2.53g/L,7.53g/L,10.08g/L,18.21g/L，最大误差分别为4.47％，4.36％，3.86％，4.69％，4.96％。

实施例3

用移液枪吸取170μL已知浓度的果糖0.5g/L,2.5g/L,7.5g/L,10g/L,18g/L样品于96微孔板中后，各孔道加入170μL 10g/L 3,5-二硝基水杨酸溶液，90℃反应5分钟后，以反应溶液的颜色在RGB颜色空间中的R值对各样品浓度进行预测，各样品分别检测100次，使用时间为6min，平均值分别为0.46g/L,2.48g/L,7.41g/L,9.85g/L,18.06g/L，最大误差分别为3.37％，4.29％，4.37％，2.38％，4.41％。

实施例4

用移液枪吸取170μL已知浓度的半乳糖0.5g/L,2.5g/L,7.5g/L,10g/L,15g/L样品于96微孔板中后，各孔道加入180μL 10g/L 3,5-二硝基水杨酸溶液，80℃反应15分钟后，以反应溶液的颜色在RGB颜色空间中的R值对各样品浓度进行预测，各样品分别检测100次，使用时间为18min，平均值分别为0.52g/L,2.47g/L,7.53g/L,9.80g/L, 16.04g/L，最大误差分别为3.12％，3.69％，4.93％，3.64％，4.73％。

实施例5

用移液枪吸取190μL已知浓度的乳糖0.5g/L,3.0g/L,7.5g/L,10g/L,18g/L样品于96微孔板中后，各孔道加入190μL 10g/L 3,5-二硝基水杨酸溶液，80℃反应20分钟后，以反应溶液的颜色在RGB颜色空间中的R值对各样品浓度进行预测，各样品分别检测100次，使用时间为34min，平均值分别为0.49g/L,2.88g/L,7.55g/L,10.23g/L,17.65g/L，最大误差分别为3.06％，3.73％，4.76％，3.95％，4.21％。

实施例6

用移液枪吸取190μL已知浓度的麦芽糖0.5g/L,3.0g/L,7.5g/L,10g/L,17g/L样品于96微孔板中后，各孔道加入190μL 10g/L DNS溶液，80℃反应13分钟后，以反应溶液的颜色在RGB颜色空间中的R值对各样品浓度进行预测，各样品分别检测100次，使用时间为20min，平均值分别为0.53g/L,3.06g/L,7.62g/L,9.86g/L,17.35g/L，最大误差分别为4.64％，4.35％，3.27％，3.76％，3.55％。

实施例7

用移液枪吸取190μL已知浓度的纤维二糖0.5g/L,3.0g/L,7.5g/L,10g/L,17g/L样品于96微孔板中后，各孔道加入190μL 10g/L3,5-二硝基水杨酸溶液，80℃反应13分钟后，以反应溶液的颜色在RGB颜色空间中的R值对各样品浓度进行预测，各样品分别检测100次，使用时间为14min，平均值分别为0.48g/L,3.07g/L,7.59g/L,9.76 g/L,17.23g/L，最大误差分别为3.44％，4.23％，3.72％，4.65％，4.35％。

实施例8

用移液枪吸取190μL已知浓度的阿拉伯糖0.5g/L,3.0g/L,7.5g/L,10g/L,17g/L样品于96微孔板中后，各孔道加入190μL 10g/L3,5-二硝基水杨酸溶液，80℃反应13分钟后，以反应溶液的颜色在RGB颜色空间中的R值对各样品浓度进行预测，各样品分别检测100次，使用时间为14min，平均值分别为0.48g/L,2.98g/L,7.46g/L,10.03g/L,17.16g/L，最大误差分别为4.51％，4.14％，4.65％，3.72％，4.65％。

实施例9

用移液枪吸取190μL已知浓度的甘露糖0.5g/L,3.0g/L,7.5g/L,10g/L,17g/L样品于96微孔板中后，各孔道加入190μL 10g/L 3,5-二硝基水杨酸溶液，80℃反应13分钟后，以反应溶液的颜色在RGB颜色空间中的R值对各样品浓度进行预测，各样品分别检测100次，使用时间为14min，平均值分别为0.46g/L,3.05g/L,7.59g/L,10.14g/L,17.13g/L，最大误差分别为4.63％，4.48％，4.78％，4.65％，3.89％。

实施例10

用移液枪吸取190μL已知浓度的甘露醇0.5g/L,3.0g/L,7.5g/L,10g/L,17g/L样品于96微孔板中后，各孔道加入190μL 10g/L 3,5- 二硝基水杨酸溶液，80℃反应13分钟后，以反应溶液的颜色在RGB颜色空间中的R值对各样品浓度进行预测，各样品分别检测100次，使用时间为14min，平均值分别为0.53g/L,2.96g/L,7.49g/L,9.96g/L,17.06g/L，最大误差分别为3.68％，4.23％，4.67％，3.98％，4.98％。

Claims (3)

1.一种基于颜色的还原性糖快速检测方法，其特征在于，

(1)将还原性糖的溶液与氧化性指示剂装载至微孔板中,将微孔板置于快速检测装置微孔板载物台(6)上；

(2)载物台传送轨道(7)将微孔板载物台(6)上的微孔板传送至恒温加热器(5)，60-100℃加热1-30min后，由载物台传送轨道(7)传送至摄像头(2)下方，由摄像头(2)进行图像拍摄，记录各孔道颜色；

(3)工业平面电脑(4)利用所记录的颜色的色彩值，确定各孔道还原性糖的浓度，并生成检测报告。

2.用于权利要求1所述一种基于颜色的还原性糖快速检测方法的装置，其特征在于，所述的装置包括一个密闭的箱体(1)，箱体上方装有摄像头(2)，箱体后侧面装有平面灯(3)，箱体正面安装有工业平面电脑(4)，箱体底部装有恒温加热器(5)，微孔板载物台(6)。

3.根据权利要求1所述的一种基于颜色的还原性糖快速检测方法，其特征在于，所述的还原性糖是指分子中含有游离醛基或酮基的单糖、含有游离醛基的二糖和多糖，包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、木糖、低聚木糖、麦芽糖、甘露糖、甘露醇、阿拉伯糖、纤维二糖；氧化性指示剂是指自身具有氧化性、被还原后发生颜色变化的指示剂，包括氧化铜、银氨溶液、3,5-二硝基水杨酸、斐林试剂；颜色的色彩值包括颜色值、色调、亮度、饱和度。