CN104531896A - 一种同时检测bp、mbv、hpv的三色荧光定量pcr联合检测方法及其试剂盒 - Google Patents

一种同时检测bp、mbv、hpv的三色荧光定量pcr联合检测方法及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时检测BP、MBV、HPV的三色荧光定量PCR联合检测方法及其试剂盒。本发明检测试剂盒含有特异性引物和探针，通过反应体系和条件的优化，一次试验可同时高灵敏、高特异地检测出BP、MBV和HPV，具有很好的特异性、敏感性和重复性；可特异性地检测BP、MBV和HPV，与中肠腺坏死杆状病毒、HPV、WSSV、IHHNV等病毒的不发生交叉反应；检测限达103拷贝/μl；重复性较好；本发明的检测方法是BP、MBV和HPV病毒快速初筛及初步确认定型的良好方法。

Description

一种同时检测BP、MBV、HPV的三色荧光定量PCR联合检测方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及一种同时检测对虾杆状病毒（Baculovirus Penaei virus, BP）、斑节对虾杆状病毒（Monodon Baculovirus, MBV）、肝胰腺细小病毒（Hepatopancreatic Parvovirus, HPV）的方法，具体涉及一种同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的三色荧光定量PCR联合检测方法及试剂盒。
背景技术
对虾杆状病毒病是一种对虾的肝胰腺或中肠上皮细胞核内由于感染多角体杆状病毒而引起的多种对虾的急性传染病，对桃红对虾、褐对虾（P.aztecus）、万氏对虾（P.vannami）和缘沟对虾（P.marginatus）等主要商业虾类有较大危害，可引起对虾幼体几乎100%死亡。对虾杆状病毒属杆状病毒科A亚群，具囊膜，大小为74×270nm，核衣壳约50nm，含双股DNA。该病毒能感染多种对虾的肝胰腺和中肠上皮细胞，并只在细胞核内复制，产生多个金字塔状的核内包涵体。这种包涵体从锥顶到底面高0.5-20μm，大多数是8-10μm，由晶格排列的多角体蛋白亚单位构成。病毒颗粒在包涵体内。目前检测对虾杆状病毒的方法主要是依据SN/T 1151.5-2003的标准进行PCR-电泳法检测。
斑节对虾杆状病毒最初由Lightner和Redman从来自台湾的种虾中发现，但实际上自1976年在台湾、菲律宾和南太平洋的塔希提岛（Tahiti）等国家和地区已相继出现此病。已知的如中国、泰国、新加坡、印度尼西亚、马来西亚都有广泛的分布。严重感染幼体能引起大量死亡，更因继发感染其它病毒、细菌或附生物而导致幼体大批量死亡。斑节对虾杆状病毒属于杆状病毒科，杆状病毒属A亚群。病毒为杆状，有囊膜，含双链DNA，核衣壳大小为42×246nm，连囊膜大小约为75×324nm。不同种类的虾观察到的病毒颗粒大小略有差异。病毒在细胞核内复制，能产生大量直径0.5-8μm的圆形或椭圆形多角体，病毒则多被包果其中。目前检测斑节对虾杆状病毒的方法主要是肝胰脏直接染色压片法检测，或依据SC-T 7202.2-2007、SNT 1151.3-2002的标准进行PCR-电泳法检测。
肝胰腺细小病毒主要感染对虾之后尾幼虫（postlarvae）及稚虾，一般病虾外观无明显特异症状，幼体虾被感染后行动不活泼、食欲减退、生长缓慢、很少蜕皮，体表常有许多共栖性生物或杂物附着;养殖期的幼虾或成虾，虾体瘦弱、体色较深，有些罹病虾体甲壳表面有大量黑色斑点，有时甲壳变软、腹部肌肉变白，抗逆性能力差，常并发二次性细菌感染，以弧菌（Vibrio spp.）最常见，有时罹病虾体除继发性细菌感染外被感染的草虾（P. monodon）常可检出草虾杆状病毒（Monodon baculovirus, MBV=Pm SNPV）及白斑综合症候群病毒（white spot syndrome virus, WSSV）。（Umesha RK et al, 2003, R），造成甚大的死亡，其死亡率达50～90％，并随着虾体增长，病情减轻;种虾多呈隐性感染而带病毒。虾肝胰腺细小病毒感染之靶的器官为肝胰腺管远盲端上皮Ｅ细胞及前中肠后段上皮细胞，并在细胞核内进行复制，且破坏组织细胞。肝胰腺细小病毒为单股DNA病毒 (Single-Strand DNA)，在细胞核内增殖并形成圆形或卵圆形包涵体 (inclusion body)，经Feulgen氏染色呈阳性反应，病毒颗粒大小随感染虾种而有差异;如感染草虾肝胰腺病毒颗粒为22-24nm（Lightner & Redman, 1985）、感染巴拿马对虾（banana shrimp, Penaeus=Fenneropenaeus merguiensis），肝胰腺病毒颗粒为21-22nm（Roubal et al. 1989）、感染斑节虾（kuruma shrimp, P.=Marsupenaeus japonicus）、肝胰腺病毒颗粒为17-20nm（Spann et al, 1997），平均病毒颗粒为22-24μm。目前检测肝胰腺细小病毒的方法主要为SC/T 7203.1-2007中的PCR-电泳法。
基于taqman探针的荧光定量PCR技术，通过荧光标记的探针，实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，该方法操作方便快捷。相比组织病理学的检测或者PCR-电泳法检测的方法，灵敏度高、特异性高，可以更有效地检测出携带病毒的对虾。探针法不仅可以在2小时内完成检测，且闭管操作，可以有效地防范PCR产物的污染。
探针法是通过荧光信号进行检测的，通过加入不同的染料，在不同波长的激发光下，可以产生不同波长的荧光。通过对探针标记FAM、VIC、JOE、NED、HEX等不同的染料，可以检测同一次荧光定量PCR扩增试验中同时扩增的多个目的基因。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的三色荧光定量PCR联合检测方法。
本发明的另一目的在于提供一种同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的三色荧光定量PCR联合检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的三色荧光定量PCR联合检测试剂盒，包括如下成分：多色荧光定量PCR MIX、病毒核酸提取液、热启动Taq酶阳性质控品、阴性质控品，所述多色荧光定量PCR MIX中含有同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的的特异性引物及探针，序列分别为：
对虾杆状病毒的
上游引物：BP-F：5’- AACCTGACCTCCTCCAAACTTTTA -3’（SEQ ID NO：1）；
下游引物：BP-R：5’- CCCAAAATTCTAGAGCCTCCAA -3’（SEQ ID NO：2）；
荧光探针：BP-P：5’- TCAGGCTGGACCAGATGTCCCAAAA -3’（SEQ ID NO：3）；
斑节对虾杆状病毒的
上游引物：MBV-F：5’- TTGCTCCAAAAAGAGTTCTTCCA -3’（SEQ ID NO：4）；
下游引物：MBV-R：5’- AAGGGTGTATGCTAGCCTATGGTAGT -3’（SEQ ID NO：5）；
荧光探针：MBV-P：5’- CATTTCCTTTATATTCCAATCGCGTCTGCG -3’（SEQ ID NO：6）；
肝胰腺细小病毒的
上游引物：HPV-F：5’-CTGGAGTAAAAGTAGCAAGAGGGTTT-3’（SEQ ID NO：7）；
下游引物：HPV-R：5’-AGTCTTGCCATAGTTGCTTGTTGT-3’（SEQ ID NO：8）；
荧光探针：HPV-P：5’-TCCGAGGCTACGAGAAGATCCTGCAAC-3’（SEQ ID NO：9）。
进一步的，上述多色荧光定量PCR MIX中含有5mM MgCl2，50mM Tris，100mM KCl， 400mM dNTP，0.1mg/mL GP32蛋白，400nM BP-F、400nM BP-R、400nM MBV-F、400nM MBV-R、400nM BMNV-F、400nM BMNV-R、400nM HPV-F、HPV-R，240nM BP-P、240nM MBV-P、240nM BMNV-P、240nM HPV-P。
进一步的，上述病毒核酸提取液含有50mM Tris-HCl，0.7M NaCl，10mM EDTA，1%的 CTAB和1mM的DTT。
一种同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的三色荧光定量PCR联合检测方法，包括以下步骤： 
1）病毒DNA的提取；
2）多色荧光定量PCR扩增：将多色荧光定量PCR MIX 20μl与热启动Taq酶1μl混合，瞬时离心后，加入提取好待检测的DNA 4μl；同样按照上述体系设置阳性和阴性对照，加入阳性质控品或阴性质控品4μl；放入定量PCR仪器的反应槽内，设置各检测的名称和荧光基团种类，设定反应程序为：94℃ 2分钟后；94℃ 15秒，55℃ 30秒，40个循环；若使用带毛细管的仪器LightCycler，则反应程序为：为93℃ 2分钟后；93℃ 5秒 58℃ 45秒，共40个循环；
3）结果分析：根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和Ct值判定结果；
阴性质控品应无扩增曲线，阳性质控品的3种荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线；若待测样品中对虾杆状病毒的荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为对虾杆状病毒阳性，若斑节对虾病毒的荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为斑节对虾病毒阳性，若肝胰腺细小病毒的荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为肝胰腺细小病毒阳性。
进一步的，上述病毒DNA提取的具体操作为：将预处理的对虾肝胰腺标本或各期幼体标本先加入10 μL 20mg/ml蛋白酶K，56℃水浴10分钟后，再加入50μL病毒核酸提取液后，上清液即为待检测DNA样本。
本发明的有益效果是：
本发明方法能够同时检测出待测标本中对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒这三种感染对虾肝胰腺的DNA病毒，应用极为方便。优化的引物探针以及多色荧光定量PCR MIX，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了其他检测方法特异性不高容易漏诊和误诊的问题，基于上述优点，该试剂盒适合在各级水产品检验检疫机构大规模筛查的推广应用，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为多色荧光PCR体系中对虾杆状病毒检测的敏感性实验，从左到右依次为1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102拷贝/μl的标准品的扩增结果。
图2 为多色荧光PCR体系中斑节对虾杆状病毒检测的敏感性实验，从左到右依次为1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102拷贝/μl的标准品的扩增结果。
图3为多色荧光PCR体系中肝胰腺细小病毒检测的敏感性实验，从左到右依次为1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102拷贝/μl的标准品的扩增结果。
图4为多色荧光PCR体系中对虾杆状病毒检测的特异性实验，对虾杆状病毒为阳性，斑节对虾杆状病毒、中肠腺坏死杆状病毒、肝胰腺细小病毒、对虾白斑病毒（WSSV）、传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）、及阴性质控品均为阴性。
图5为多色荧光PCR体系中对斑节虾杆状病毒检测的特异性实验，斑节对虾杆状病毒为阳性，对虾杆状病毒、中肠腺坏死杆状病毒、肝胰腺细小病毒、对虾白斑病毒（WSSV）、传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）、及阴性质控品均为阴性。
图6为多色荧光PCR体系中中肠腺坏死杆状病毒检测的特异性实验，中肠腺坏死杆状病毒为阳性，对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒、对虾白斑病毒（WSSV）、传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）、及阴性质控品均为阴性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1：同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的三色荧光定量PCR联合检测试剂盒
（1）特异性引物及探针
本发明根据对虾杆状病毒（Baculovirus Penaei，BP）、斑节对虾杆状病毒（Monodon Baculovirus，MBV）、肝胰腺细小病毒（Hepatopancereatic parvovirus，HPV）的核酸序列，分别设计用于检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的引物和探针；本发明通过对所设计的引物和探针做大量的实验筛选，筛选出一组同时对对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒具有高灵敏性和高特异性的引物和探针序列， 其序列如下：
对虾杆状病毒的
上游引物：BP-F：5’- AACCTGACCTCCTCCAAACTTTTA -3’（SEQ ID NO：1）；
下游引物：BP-R：5’- CCCAAAATTCTAGAGCCTCCAA -3’（SEQ ID NO：2）；
荧光探针：BP-P：5’- Fam-TCAGGCTGGACCAGATGTCCCAAAA –BHQ1-3’（SEQ ID NO：3）；
斑节对虾杆状病毒的
上游引物：MBV-F：5’- TTGCTCCAAAAAGAGTTCTTCCA -3’（SEQ ID NO：4）；
下游引物：MBV-R：5’- AAGGGTGTATGCTAGCCTATGGTAGT -3’（SEQ ID NO：5）；
荧光探针：MBV-P：5’- JOE-CATTTCCTTTATATTCCAATCGCGTCTGCG –BHQ1-3’（SEQ ID NO：6）；
肝胰腺细小病毒的
上游引物：HPV-F：5’-CTGGAGTAAAAGTAGCAAGAGGGTTT-3’（SEQ ID NO：7）；
下游引物：HPV-R：5’-AGTCTTGCCATAGTTGCTTGTTGT-3’（SEQ ID NO：8）；
荧光探针：HPV-P：5’-CY5-TCCGAGGCTACGAGAAGATCCTGCAAC-BHQ2-3’（SEQ ID NO：9）。
（2）同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的三色荧光定量PCR联合检测试剂盒，包括如下成分：
1）多色荧光定量PCR MIX：含有5mM MgCl2， 50mM Tris， 100mM KCl， 400mM dNTP， 0.1mg/mL GP32蛋白，400nM BP-F、400nM BP-R、400nM MBV-F、400nM MBV-R、400nM BMNV-F、400nM BMNV-R、400nM HPV-F、HPV-R，240nM BP-P、240nM MBV-P、240nM BMNV-P、240nM HPV-P。
2）病毒核酸提取液；包含终浓度50mM Tris-HCl，终浓度0.7M NaCl，终浓度10mM EDTA，终浓度1%的 CTAB，终浓度1mM的DTT。待检测的对虾肝胰腺样品需先加入10 μL 20mg/ml蛋白酶K，56℃水浴10分钟后，加入50μL上述核酸提取液使用。
3）热启动Taq酶（1U/μl）；
4）阳性质控品：人工合成含有上述3对引物扩增目的片段的如下序列：AGGACAAACCTGACCTCCTCCAAACTTTTAGGCTTTTCTGGTCAGGCTGGACCAGATGTCCCAAAATATAACAGTGCAGTAACCCTACCATTGGAGGCTCTAGAATTTTGGGTGGGAGATATCTTGCTCCAAAAAGAGTTCTTCCATTTTTTCATTTCCTTTATATTCCAATCGCGTCTGCGATACTTCATCATTGTATAAAATATGCATTTTATACTACCATAGGCTAGCATACACCCTTTTACGAAAACTGGAGTAAAAGTAGCAAGAGGGTTTTATTCCGAGGCTACGAGAAGATCCTGCAACACGACAACAAGCAACTATGGCAAGACTT（SEQ ID NO：10）转入载体后，挑取阳性克隆菌落并提取制质粒作为阳性质控品；
5）阴性质控品。
实施例2：同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的三色荧光定量PCR联合检测方法
（1）提取待测样品中的病毒DNA
1）标本采集和预处理
本方法及试剂盒适用标本类型为对虾肝胰腺组织或各期幼体。取50-100mg对虾肝胰腺组织或各期幼体，立即处理或放在95%酒精中（可在常温下保存30d，样品处理前必须让酒精完全挥发）；
2）病毒DNA的提取
取上述预处理的对虾肝胰腺标本或各期幼体标本，先加入10 μL 20mg/ml蛋白酶K，56℃水浴10分钟后，加入50μL上述核酸提取液后，上清液即为待检测DNA样本。
（2）多色荧光定量PCR扩增
每个测试反应体系配制如下，多色荧光定量PCR MIX 20μl、热启动Taq酶1μl，瞬时离心后，加入提取好待检测的DNA 4μl；同样按照上述体系设置阳性和阴性对照，加入阳性质控品或阴性质控品4μl进行扩增。
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，设置各检测的名称和荧光基团种类（设置对虾杆状病毒的报告基团选择FAM；斑节对虾杆状病毒的报告基团选择JOE；肝胰腺细小病毒的报告基团选择CY5；所有通道的淬灭基团选择NONE)。
设定循环条件： 94℃→2分钟后；94℃ 15秒→55℃ 30秒，40个循环；LightCycler等使用毛细管的仪器循环条件为93℃→2分钟后；93℃ 5秒→58℃ 45秒，共40个循环。
（3）结果分析和判定
反应结束后，根据信噪情况设定和调整基线和阈值， 阴性质控品应无扩增曲线，阳性质控品的FAM、JOE和CY5荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线，若待测样品中FAM荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为对虾杆状病毒阳性，JOE荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为斑节对虾阳性，CY5荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为肝胰腺细小病毒阳性。
下面对本发明检测试剂盒及其检测方法作进一步的效果检测。
一、灵敏度实验
将上述人工合成的阳性质控品，依次稀释为1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102拷贝/μl，进行灵敏度实验。
图1为多色荧光PCR体系中对虾杆状病毒检测的敏感性实验，从左到右依次为1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102拷贝/μl的标准品的扩增结果。
图2 为多色荧光PCR体系中斑节对虾杆状病毒检测的敏感性实验，从左到右依次为1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102拷贝/μl的标准品的扩增结果。
图3 为多色荧光PCR体系中肝胰腺细小病毒检测的敏感性实验，从左到右依次为1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102拷贝/μl的标准品的扩增结果。
结果证实本试剂盒检测灵敏度为：
对虾杆状病毒灵敏度达到1.0×103拷贝/μl；
斑节对虾杆状病毒灵敏度达到1.0×103拷贝/μl；
肝胰腺细小病毒灵敏度达到1.0×103拷贝/μl。
由此，该多色荧光定量PCR的方法敏感度优于普通PCR方法。
二、特异性实验
根据上述的多色荧光定量PCR检测方法，用从广东省多个出入境单位获得的对虾杆状病毒BP、斑节对虾杆状病毒MBV、中肠腺坏死杆状病毒、肝胰腺细小病毒HPV、对虾白斑病毒WSSV、传染性皮下和造血器官坏死病毒IHHNV以及阴性对照进行验证实验并对产物进行测序验证，结果证实，本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阴性或假阳性，吻合度为100%，实验结果见图4、图5、图6。
图4为多色荧光PCR体系中对虾杆状病毒检测的特异性实验，对虾杆状病毒为阳性，斑节对虾杆状病毒、中肠腺坏死杆状病毒、肝胰腺细小病毒、对虾白斑病毒（WSSV）、传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）、及阴性质控品均为阴性。
图5为多色荧光PCR体系中对斑节虾杆状病毒检测的特异性实验，斑节对虾杆状病毒为阳性，对虾杆状病毒、中肠腺坏死杆状病毒、肝胰腺细小病毒、对虾白斑病毒（WSSV）、传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）、及阴性质控品均为阴性。
图6为多色荧光PCR体系中肝胰腺细小病毒检测的特异性实验，肝胰腺细小病毒为阳性，对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、中肠腺坏死杆状病毒、对虾白斑病毒（WSSV）、传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）、及阴性质控品均为阴性。
三、重复性试验
将8次独立重复提取含阳性质控品质粒分别进行双色荧光定量PCR扩增，均出现一至的曲线，表明本发明的双色荧光定量PCR检测方法具有良好的重复性和稳定性。
为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内。
为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内。
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<120>  一种同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的三色荧
       光定量PCR联合检测方法及其试剂盒
 
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<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  2
cccaaaattc tagagcctcc aa                                                22
 
 
<210>  3
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  3
tcaggctgga ccagatgtcc caaaa                                             25
 
 
<210>  4
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  4
ttgctccaaa aagagttctt cca                                               23
 
 
<210>  5
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  5
aagggtgtat gctagcctat ggtagt                                            26
 
 
<210>  6
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  6
catttccttt atattccaat cgcgtctgcg                                        30
 
 
<210>  7
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  7
ctggagtaaa agtagcaaga gggttt                                            26
 
 
<210>  8
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  8
agtcttgcca tagttgcttg ttgt                                              24
 
 
<210>  9
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工引物
 
<400>  9
tccgaggcta cgagaagatc ctgcaac                                           27
 
 
<210>  10
<211>  334
<212>  DNA
<213>  人工合成序列
 
<400>  10
aggacaaacc tgacctcctc caaactttta ggcttttctg gtcaggctgg accagatgtc       60
 
ccaaaatata acagtgcagt aaccctacca ttggaggctc tagaattttg ggtgggagat      120
 
atcttgctcc aaaaagagtt cttccatttt ttcatttcct ttatattcca atcgcgtctg      180
 
cgatacttca tcattgtata aaatatgcat tttatactac cataggctag catacaccct      240
 
tttacgaaaa ctggagtaaa agtagcaaga gggttttatt ccgaggctac gagaagatcc      300
 
tgcaacacga caacaagcaa ctatggcaag actt                                  334

Claims (5)

1.一种同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的三色荧光定量PCR联合检测试剂盒，包括如下成分：多色荧光定量PCR MIX、病毒核酸提取液、热启动Taq酶阳性质控品、阴性质控品，其特征在于：所述多色荧光定量PCR MIX中含有同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的的特异性引物及探针，序列分别为：
对虾杆状病毒的
上游引物：BP-F：5’- AACCTGACCTCCTCCAAACTTTTA -3’（SEQ ID NO：1）；
下游引物：BP-R：5’- CCCAAAATTCTAGAGCCTCCAA -3’（SEQ ID NO：2）；
荧光探针：BP-P：5’- TCAGGCTGGACCAGATGTCCCAAAA -3’（SEQ ID NO：3）；
斑节对虾杆状病毒的
上游引物：MBV-F：5’- TTGCTCCAAAAAGAGTTCTTCCA -3’（SEQ ID NO：4）；
下游引物：MBV-R：5’- AAGGGTGTATGCTAGCCTATGGTAGT -3’（SEQ ID NO：5）；
荧光探针：MBV-P：5’- CATTTCCTTTATATTCCAATCGCGTCTGCG -3’（SEQ ID NO：6）；
肝胰腺细小病毒的
上游引物：HPV-F：5’-CTGGAGTAAAAGTAGCAAGAGGGTTT-3’（SEQ ID NO：7）；
下游引物：HPV-R：5’-AGTCTTGCCATAGTTGCTTGTTGT-3’（SEQ ID NO：8）；
荧光探针：HPV-P：5’-TCCGAGGCTACGAGAAGATCCTGCAAC-3’（SEQ ID NO：9）。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述多色荧光定量PCR MIX中含有5mM MgCl2，50mM Tris，100mM KCl， 400mM dNTP，0.1mg/mL GP32蛋白，400nM BP-F、400nM BP-R、400nM MBV-F、400nM MBV-R、400nM BMNV-F、400nM BMNV-R、400nM HPV-F、HPV-R，240nM BP-P、240nM MBV-P、240nM BMNV-P、240nM HPV-P。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述病毒核酸提取液含有50mM Tris-HCl，0.7M NaCl，10mM EDTA，1%的 CTAB和1mM的DTT。
4.一种同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的三色荧光定量PCR联合检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）病毒DNA的提取；
2）多色荧光定量PCR扩增：将多色荧光定量PCR MIX 20μl与热启动Taq酶1μl混合，瞬时离心后，加入提取好待检测的DNA 4μl；同样按照上述体系设置阳性和阴性对照，加入阳性质控品或阴性质控品4μl；放入定量PCR仪器的反应槽内，设置各检测的名称和荧光基团种类，设定反应程序为：94℃ 2分钟后；94℃ 15秒，55℃ 30秒，40个循环；若使用带毛细管的仪器LightCycler，则反应程序为：为93℃ 2分钟后；93℃ 5秒 58℃ 45秒，共40个循环；
3）结果分析：根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和Ct值判定结果；
阴性质控品应无扩增曲线，阳性质控品的3种荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线；若待测样品中对虾杆状病毒的荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为对虾杆状病毒阳性，若斑节对虾病毒的荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为斑节对虾病毒阳性，若肝胰腺细小病毒的荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为肝胰腺细小病毒阳性。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述病毒DNA提取的具体操作为：将预处理的对虾肝胰腺标本或各期幼体标本先加入10 μL 20mg/ml蛋白酶K，56℃水浴10分钟后，再加入50μL病毒核酸提取液后，上清液即为待检测DNA样本。
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