CN104531794B - 一种n‑boc‑d‑2‑氨基丁酸酯的制备方法 - Google Patents

一种n‑boc‑d‑2‑氨基丁酸酯的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种N‑BOC‑D‑2‑氨基丁酸酯的制备方法,所述的方法为:以嗜烟碱节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)WYG001经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体冷冻干燥后的干菌体为催化剂,以N‑BOC‑DL‑2‑氨基丁酸酯为底物,以0.1M、pH7.0磷酸缓冲液为反应介质,在20~40℃下进行转化反应,反应结束后,将反应液分离纯化,获得N‑BOC‑D‑2‑氨基丁酸酯;本发明方法中酶的区域选择性强,反应转化率高,下游分离简单,能耗低,环境污染小,适合工业化生产。

Description

一种N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法
(一)技术领域
本发明涉及一种手性中间体N-BOC-2-氨基丁酸酯的制备方法,特别涉及在嗜烟碱节杆菌WYG001(CCTCC M 2014054)的微生物催化作用下,以外消旋N-BOC-2-氨基丁酸酯为反应底物,立体选择性水解反应制备光学纯N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的方法。
(二)背景技术
N-BOC-D-2-氨基丁酸酯(R)是一种重要的生化试剂,用于多肽或模拟肽合成和氨基酸保护单体。N-BOC-D-2-氨基丁酸酯可以通过化学水解获得D-2-氨基丁酸。D-2-氨基丁酸是一种重要的非天然的手性α-氨基酸,它是一种重要的化工原料和手性中间体,广泛应用于药物的合成(白国义,陈立功,邢鹏等.精细化工,2004,21(12):943-9452;CN1510025A,公开日2004-07-07)。
目前,文献报道合成D-2-氨基丁酸的方法众多。例如,以D构型的蛋氨酸为原料经脱硫等步骤合成D-2-氨基丁酸(Compagnone R.S.et al.Journal of OrganicChemistry.1986,51:1713-1719);丁酮酸的氨化水解反应法(Archer,Ian Victor Jameset al.WO:20080153137,2008-06-26),化学拆分法(Soloshonok V.A.et al.Joural ofAmerican Chemical Society.2009,131:7208-7209)等。
奚强等(奚强,丁友友,林丫丫,李俊.2-氨基丁酸的酶拆分[J].武汉工程大学学报.2009,31(3):26-29.)先将外消旋的2-氨基丁酸乙酰化得到N-乙酰-2-氨基丁酸,然后用从猪肾中提取得到的氨基酰化酶选择性的水解掉(S)-构型的N-乙酰-2-氨基丁酸,从而获得(S)-2-氨基丁酸,并将未被水解的(R)-N-乙酰-2-氨基丁酸用适当的方法进行消旋化处理得到外消旋的2-氨基丁酸,从而实现其动态动力学拆分,其最终收率达到71.9%,
本发明所报道的制备N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的方法是通过生物催化N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯选择性水解,实现消旋体中的N-BOC-L-2-氨基丁酸酯被催化水解开环成酸,而D构型保持不变,进而根据物理性质的不同,将N-BOC-2-氨基丁酸酯的两种构型分开,最后得到光学纯的N-BOC-D-2-氨基丁酸酯。此制备方法具有立体选择性高、反应条件温和、收率高、产物易分离纯化及生产成本高等优点,易于工业化生产。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法,该方法以外消旋N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯为反应底物,以嗜烟碱节杆菌WYG001(CCTCC NO:M 2014054)经发酵培养获得的湿菌体或干菌体为催化剂,催化立体选择性水解N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯从而制备N-BOC-D-2-氨基丁酸酯,该方法具有立体选择性高、反应条件温和、收率高、产物易分离纯化及生产成本高等优点,易于工业化生产。
本发明采用的技术方案是:
本发明提供一种N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法,所述的方法为:以嗜烟碱节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)WYG001经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体冷冻干燥后的干菌体为催化剂,以N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯为底物,以0.1M、pH7.0磷酸缓冲液为反应介质,在20~40℃、200rpm条件下进行转化反应(优选反应1~30h),反应结束后,将反应液分离纯化,获得N-BOC-D-2-氨基丁酸酯;所述嗜烟碱节杆菌WYG001,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号CCTCC NO:M 2014054,保藏日期2014年2月28日,地址为中国,武汉,武汉大学,邮编430072。
本发明所述催化剂的制备方法为:(1)斜面培养:将嗜烟碱节杆菌WYG001接种至斜面培养基,30℃培养24h,获得菌体斜面;每升斜面培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)组成:牛肉膏5g,蛋白胨10g,NaCl 5g,琼脂20g,pH 7.0-7.2,加水至1000mL;121℃灭菌20min。
(2)种子培养:从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基,在30℃、200r/min培养24h,获得种子液;种子培养基组成:蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,NaCl 10g/L,溶剂为水,pH 7.0;
(3)发酵培养:在无菌条件下,以体积浓度6-8%的接种量将种子液接种于产酶培养基中,30℃、200r/min培养24h,获得发酵液,培养结束后将发酵液12000rpm离心10min,弃上清液,得到嗜烟碱节杆菌WYG001湿菌体;产酶培养基组成为:乳糖5-15g/L,酵母膏10-14g/L,NaCl 10g/L,MgSO40.22g/L、KH2PO40.136g/L,溶剂为水,pH 7.0;
(4)取步骤(3)湿菌体以1.2g/ml的量加入pH 7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中,搅拌均匀,-80℃条件下冷冻干燥,得到干菌体。
进一步,所述湿菌体的用量以缓冲液体积计为1~200g/L,优选10~200g/L。
进一步,所述干菌体的用量以缓冲液体积计为1~100g/L,优选10~50g/L。
进一步,所述底物初始浓度为1~50g/L,优选10~30g/L。
进一步,所述反应在20~40℃反应1~30h。
本发明所述N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯为N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯、N-BOC-DL-2-氨基丁酸乙酯或N-BOC-DL-2-氨基丁酸丙酯。
本发明所述反应液分离纯化的方法为:反应结束后,将反应液离心,取上清液,加入等体积的乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂,得到N-BOC-D-2-氨基丁酸酯。
本发明反应流程见下式所示:
R=甲基,乙基,丙基。
本发明所述医药中间体N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法的有益效果主要体现在:酶的选择性强,反应转化率高,下游分离简单,能耗低,环境污染小,适合工业化生产。
(四)附图说明
图1外消旋体N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯对照品气相色谱图,峰a为N-Boc-D-2-氨基丁酸甲酯,保留时间10.913min,峰面积463.1,峰高134,峰宽0.0533,对称因子1.293,峰b为N-Boc-L-2-氨基丁酸甲酯,保留时间11.075min,峰面积473.3,峰高143.3,峰宽0.0525,对称因子1.285;
图2 N-BOC-L-2-氨基丁酸甲酯标准品的气相色谱图,峰b为N-Boc-L-2-氨基丁酸甲酯,保留时间10.921min,峰面积991.7,峰宽0.0719,对称因子1.929;
图3微生物催化产物N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的气相色谱图,峰a为N-Boc-D-2-氨基丁酸甲酯,保留时间10.915min,峰面积151.4,峰高44.9,峰宽0.0533,对称因子1.039。
图4为菌株WYG001的菌落形态图。
图5为菌株WYG001在100倍下的光学显微照片。
图6为菌株WYG001的16S rDNA电泳图,A为菌株WYG001的电泳图,左侧泳道为菌株WYG001,右侧泳道为标准分子量,B为A的放大图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1
1、微生物的筛选
本发明涉及到的微生物通过以下程序筛选分离得到:称取湿土样1~2g(从全国不同环境条件下土壤中取得)混悬于10mL 0.5%无菌生理盐水中,振荡混匀;接1~2mL混悬液于30mL液体富集培养基中,在30℃、200r/min下培养2~3d后,无菌操作转接1mL浑浊的菌液到新鲜的液体富集培养基,连续富集3次。富集培养基中,以N-BOC-DL-高丝氨酸内酯为唯一碳源,配方如下:NaNO34.0g/L,KH2PO42.0g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,KCl 1.0g/L,ZnSO40.05g/L,溶剂为水,pH 7.0。第一轮富集的N-BOC-DL-高丝氨酸内酯的浓度1g/L,第二轮的浓度为3g/L,第三轮的浓度为5g/L,pH 7.0。将第三轮富集后菌液经梯度稀释,涂布分离平板培养基,多次分离,获取单菌落。分离平板培养基组成为:富集培养基加入琼脂终浓度20g/L,底物N-BOC-DL-高丝氨酸内酯终浓度为5g/L,pH 7.0。
挑取分离得到的单菌落接种于斜面培养基,30℃培养1-2天,获得斜面菌体。从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至50mL的种子培养基,在30℃、200r/min培养24h,获得种子液。在无菌条件下,取3mL种子液接种于50mL的产酶培养基中,30℃、200r/min培养24h,获得发酵液。每升斜面培养基组成牛肉膏5g,蛋白胨10g,NaCl 5g,琼脂20g,pH 7.0-7.2,加水至1000mL;种子培养基配方为:蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,NaCl 10g/L,溶剂为水,pH 7.0;产酶培养基组成为:乳糖10g/L,酵母膏12g/L,NaCl 10g/L,MgSO40.22g/L、KH2PO40.136g/L,溶剂为水,pH 7.0。取15mL发酵液于50mL离心管中12000rpm离心10min,弃上清液,加入5mL0.1mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液,振荡混匀,再加入终浓度8g/L底物N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯,在30℃、200r/min下,转化反应24h。取出离心管,取1mL的反应液,加入2mL乙酸乙酯,充分振荡,6000rpm离心5min。取上层有机相1mL,用少量无水硫酸钠干燥除水,以高效液相色谱检测N-BOC-L-2-氨基丁酸酯的对映体过量值(e.e.)大于90%,反应转化率C为(45%-60%),筛选得到所述微生物菌株,记为菌株WYG001。
2、微生物菌株的鉴定
生理生化特征:菌株WYG001为革兰氏阴性菌,专性好氧,生长对pH变化较敏感,最适pH为7.0,菌落形态见图4和图5所示。利用无机氮源的能力较差,生长和产酶受到Cu2+、Fe2 +、Al3+、Zn2+等的抑制,受到Mg2+、K+、Na+等的促进。
经测序鉴定,菌株WYG001的16S rDNA序列如下(SEQ ID NO.1),电泳图见图6所示:
TGCTTACACATGCAAGTCGAACGATGATCCCAGCTTGCTGGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCTTGACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACTCCTCATCGCATGGTGGGGGGTGGAAAGCTTTTGTGGTTTTGGATGGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTAGGGAAGAAGCGTAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGCTGTGAAAGACCGGGGCTCAACTCCGGTTCTGCAGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGCAGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGTGGGGGACATTCCACGTTTTCCGCGCCGTAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATGAACCGGAAAGACCTGGAAACAGGTGCCCCGCTTGCGGTCGGTTTACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTATGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGGACTCATAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGTTGCGATACTGTGAGGTGGAGCTAATCCCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCACGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGGGGGAGCCGTCGAAGGTGGGACCGGCGATGGGACTAAGTC
根据生理生化特性和分子生物学鉴定,该菌株被鉴定为嗜烟碱节杆菌菌(Arthrobacter nicotinovorans),命名为嗜烟碱节杆菌菌(Arthrobacternicotinovorans)WYG001,保藏于中国典型培养物保藏中心(地址中国,武汉,武汉大学,430072),保藏编号CCTCC NO:M 2014054,保藏日期2014年2月28日。
实施例2:
(1)嗜烟碱节杆菌WYG001湿菌体和干菌体的制备
斜面培养:将嗜烟碱节杆菌WYG001接种至斜面培养基,30℃培养24h,获得菌体斜面;斜面培养基组成同实施例1。
种子培养:从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至100mL种子培养基,在30℃、200r/min培养24h,获得种子液;种子培养基组成同实施例1。
发酵培养:在无菌条件下,取10mL种子液接种于150mL的产酶培养基中,30℃、200r/min培养24h,获得发酵液,培养结束后将发酵液12000rpm离心10min,弃上清液,得到嗜烟碱节杆菌WYG001湿菌体。取湿菌体以1.2g/ml的量加入pH 7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中,搅拌均匀,-80℃条件下冷冻干燥得到干菌体,该干菌体比酶活力为6.34U/g。
(2)嗜烟碱节杆菌WYG001湿菌体和干菌体酶活测定方法
酶活单位定义:U为1个酶活力单位,所述的1个酶活力单位是在规定的条件下,每分钟催化水解1μmol N-BOC-2-氨基丁酸酯所需的酯水解酶的量。
用于酶活测定的N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯标准曲线方程:
配制浓度(w/v)分别为0.1%、0.2%、0.4%、0.5%、0.6%、0.8%、1.0%的外消旋N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯水溶液(w/v),利用气相色谱进行检测,得出酯的浓度与峰面积之间的线性关系,以N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯的摩尔浓度为纵坐标,气相色谱检测所得峰面积为横坐标,得到标准曲线方程:y=0.9487x-0.0005,在0.1%-1%(v/v)浓度范围内,相关系数R2=0.995,达到了外标法所需的要求,该曲线可以用于N-BOC-2-氨基丁酸甲酯的分析测定。
酶活计算公式:
A=[(a1-a)/a1]×[C×V/(M×t)]×106 公式(1)
A——样品中酶的活力(U);
a——转化反应结束后转化液中N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯的峰面积;
a1——根据上述标准曲线方程计算出的与初始底物浓度相同的N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯标样的峰面积
C——转化液中,N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯的质量浓度,g/L;
V——转化液体积,L;
M——N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯的摩尔质量,g/mol;
t——转化时间,Min。
干菌体的酶活测定条件为:取0.2g菌粉,加入N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯0.1g和pH7.0、0.1mol/L磷酸缓冲液10mL,30℃、200rpm条件下,搅拌反应6h,反应结束后,将反应液过滤除去酶,取滤液用气相色谱分析测定转化后的BOC-2-氨基丁酸酯的含量,根据公式(1)计算酶活。
湿菌体的酶活测定条件为:取1.0g湿菌体,加入N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯0.1g和pH7.0、0.1mol/L磷酸缓冲液10mL,30℃、200rpm条件下,搅拌反应6h,反应结束后,将反应液过滤除去酶,取滤液用气相色谱分析测定转化后的N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯的含量,根据公式(1)计算酶活。
气相色谱分析条件:采用气相色谱仪Agilent 6890型气相色谱仪;手性气相色谱柱BGB-175(0.25mm×30m);载气N2(14.54kPa),分流比50:1,进样口温度250℃,检测器温度220℃;柱箱升温程序:初始温度为120℃保持2min,4℃/min升温到195℃,保持2min;进样量1.0μL,氢气流量:30mL/min空气流量:300mL/min;尾吹气流量:N225mL/min;氢离子火焰检测器。N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯和N-BOC-L-2-氨基丁酸甲酯分别在10.913min和11.075min出峰。
实施例3:
取实施例2方法获得的湿菌体0.6g,加入N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯0.1g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液10mL,30℃、200rpm条件下,搅拌反应5h,反应结束后,将反应液离心,取上清液,加入等体积的乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂后,得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯48.5mg。采用高效液相色谱(检测条件同实施例2)检测N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的对映体过量值e.e.S为99.9%,转化率C为51.5%,产率97.0%。结构表征如下:
无色油状液体;1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ5.08(s,1H,NH),4.30(s,1H,CH),3.77(s,3H,OCH 3),1.94-1.61(m,2H,CH 2),1.48(s,9H,CH 3×3),0.97(t,3H,J=7.5Hz,CH 3);[α]20 D+37.4(c 2.0,actone);MS(EI)m/z 217(M)+.
对映体过量值(enantiomeric excesses)是衡量酶选择性的重要指标,N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的对映体过量值简称e.e.S,其计算公式为:
公式(2)
其中S表示底物,SR和SS分别为(D)-和(L)-构型的底物的峰面积。
反应转化率的计算公式为:
公式(2)
N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的收率(Yield)的计算公式为:
公式(3)
公式(2)和公式(3)中,SR0和SS0分别为(D)-和(L)-构型的底物的初始峰面积。
实施例4:
取实施例2方法获得的湿菌体1.0g,加入N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯0.1g,0.1M、pH7.0磷酸缓冲液10mL,在30℃、200rpm条件下,搅拌反应3.5h,反应结束后,将反应液离心,取上清液,加入等体积的乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂,得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯48mg。采用实施例3方法检测N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的对映体过量值e.e.S为99.9%,转化率C为51.0%,产率96.0%。
实施例5:
取实施例2方法获得的湿菌体2.0g,加入N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯0.2g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液10mL,在20℃、200rpm条件下,搅拌反应4h,反应结束后,将反应液离心,取上清液,加入等体积的乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂后,得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯95.4mg。采用实施例3方法进行气相检测,计算得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的对映体过量值e.e.S为98.5%,转化率C为52.0%,产率95.4%。
实施例6
取实施例2方法取发酵液离心所得湿菌体2.5g,加入N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯1g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液50mL,在35℃、200rpm条件下,搅拌反应30h后,将反应液离心,取上清液,加入等体积的乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂后,得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯462.5mg。采用实施例3方法进行气相检测,计算得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的对映体过量值e.e.S为94.9%,转化率C为52.3%,产率92.5%。
实施例7
取实施例2方法获得的干菌体20g,加入N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯20g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液2000mL,在30℃、200rpm条件下,搅拌反应6h,反应结束后,将反应液离心,取上清液,加入等体积的乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂后,得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯9.9g。采用实施例3方法气相检测,计算得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的对映体过量值e.e.S为99.9%,转化率C为50.1%,产率99.0%。
实施例8
取实施例2方法获得的干菌体3g,加入含有N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯3g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液100mL,在30℃、200rpm条件下,搅拌反应6h,反应结束后,将反应液离心,取上清液,加入等体积的乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂后,得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯1.491g。采用实施例3方法气相检测,计算得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的对映体过量值e.e.S为99.9%,转化率C为50.1%,产率99.4%。
实施例9
取实施例2方法获得的干菌体5.0g,加入含有N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯3.0g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液100mL,在32℃、200rpm条件下,搅拌反应5h,反应结束后,将反应液离心,取上清液,加入等体积的乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂后,得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯1.488g。采用实施例3气相检测,计算得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的对映体过量值e.e.S为99.9%,转化率C为50.1%,产率99.2%。
实施例10
取实施例2方法获得的干菌体2.0g,加入N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯1g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液100mL,在40℃、200rpm条件下,搅拌反应5.5h,反应结束后,将反应液离心,取上清液,加入等体积的乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂后,得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯482mg。采用实施例3方法气相检测,计算得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的对映体过量值e.e.S为99.9%,转化率C为54.4%,产率96.3%。
实施例11
取实施例2方法获得的干菌体5g,加入N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯2.5g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液50mL,在20℃、200rpm条件下,搅拌反应30h,反应结束后将反应液离心,取上清液,加入等体积的乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂后,得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯1.2g。采用实施例3方法气相检测,计算得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的对映体过量值e.e.S为97.9%,转化率C为51.1%,产率96.0%。
实施例12
取实施例2方法获得的干菌体8.0g,加入N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯2g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液200mL,在30℃、200rpm条件下,搅拌反应7.0h,反应结束后,将反应液离心除去菌体,上清液用乙酸乙酯萃取(50mL×5),取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂后,得到光学纯的N-Boc-D-2-氨基丁酸甲酯2.11g,采用实施例3方法气相检测其光学纯度。检测到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的对映体过量值e.e.S为99.9%,转化率C为50.8%,产率为97.0%。
实施例13
取实施例2方法制得嗜烟碱节杆菌WYG001干菌体0.2g,加入N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯0.5mmol(0.108g),加入0.1M、pH7.0磷酸缓冲液10mL,在32℃、200rpm条件下,搅拌反应7h,反应结束后,将反应液离心,取上清液,加入等体积的乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂后,得到N-BOC-D-2-氨基丁酸酯化合物,采用实施例3方法进行检测,结果见表1。同样条件下,分别用N-BOC-DL-2-氨基丁酸乙酯0.5mmol(0.116g),N-BOC-DL-2-氨基丁酸丙酯0.5mmol(0.123g)替换N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯。
表1转化结果
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明的技术内容作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均落入本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法,其特征在于所述的方法为:以嗜烟碱节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)WYG001经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体冷冻干燥后的干菌体为催化剂,以N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯为底物,以0.1M、pH7.0磷酸缓冲液为反应介质,在20~40℃、200rpm条件下进行转化反应,反应结束后,将反应液分离纯化,获得N-BOC-D-2-氨基丁酸酯;所述嗜烟碱节杆菌WYG001,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号CCTCC NO:M 2014054,保藏日期2014年2月28日,地址为中国,武汉,武汉大学,邮编430072。
2.如权利要求1所述N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法,其特征在于所述催化剂的制备方法为:(1)斜面培养:将嗜烟碱节杆菌WYG001接种至斜面培养基,30℃培养24h,获得菌体斜面;每升斜面培养基组成:牛肉膏5g,蛋白胨10g,NaCl 5g,琼脂20g,pH 7.0-7.2,加水至1000mL;
(2)种子培养:从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基,在30℃、200r/min培养24h,获得种子液;种子培养基组成:蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,NaCl 10g/L,溶剂为水,pH7.0;
(3)发酵培养:在无菌条件下,以体积浓度6-8%的接种量将种子液接种于产酶培养基中,30℃、200r/min培养24h,获得发酵液,培养结束后将发酵液12000rpm离心10min,弃上清液,得到嗜烟碱节杆菌WYG001湿菌体;产酶培养基组成为:乳糖5-15g/L,酵母膏10-14g/L,NaCl 10g/L,MgSO4 0.22g/L、KH2PO4 0.136g/L,溶剂为水,pH 7.0;
(4)取步骤(3)湿菌体以1.2g/ml的量加入pH 7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中,搅拌均匀,-80℃条件下冷冻干燥,得到干菌体。
3.如权利要求1所述N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法,其特征在于所述湿菌体的用量以缓冲液体积计为1~200g/L。
4.如权利要求1所述N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法,其特征在于所述干菌体的用量以缓冲液体积计为1~100g/L。
5.如权利要求1所述N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法,其特征在于所述底物初始浓度为1~50g/L。
6.如权利要求1所述N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法,其特征在于所述N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯为N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯、N-BOC-DL-2-氨基丁酸乙酯或N-BOC-DL-2-氨基丁酸丙酯。
7.如权利要求1所述N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法,其特征在于所述反应液分离纯化的方法为:反应结束后,将反应液离心,取上清液,加入等体积的乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂,得到N-BOC-D-2-氨基丁酸酯。
8.如权利要求2所述N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法,其特征在于产酶培养基组成为:乳糖10g/L,酵母膏12g/L,NaCl 10g/L,MgSO4 0.22g/L、KH2PO4 0.136g/L,溶剂为水,pH7.0。
9.如权利要求1所述N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法,其特征在于所述反应在20~40℃反应1~30h。
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