CN104531794B - 一种n‑boc‑d‑2‑氨基丁酸酯的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种N‑BOC‑D‑2‑氨基丁酸酯的制备方法，所述的方法为：以嗜烟碱节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)WYG001经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体冷冻干燥后的干菌体为催化剂，以N‑BOC‑DL‑2‑氨基丁酸酯为底物，以0.1M、pH7.0磷酸缓冲液为反应介质，在20～40℃下进行转化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得N‑BOC‑D‑2‑氨基丁酸酯；本发明方法中酶的区域选择性强，反应转化率高，下游分离简单，能耗低，环境污染小，适合工业化生产。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种手性中间体N-BOC-2-氨基丁酸酯的制备方法，特别涉及在嗜烟碱节杆菌WYG001(CCTCC M 2014054)的微生物催化作用下，以外消旋N-BOC-2-氨基丁酸酯为反应底物，立体选择性水解反应制备光学纯N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的方法。
(二)背景技术
N-BOC-D-2-氨基丁酸酯(R)是一种重要的生化试剂，用于多肽或模拟肽合成和氨基酸保护单体。N-BOC-D-2-氨基丁酸酯可以通过化学水解获得D-2-氨基丁酸。D-2-氨基丁酸是一种重要的非天然的手性α-氨基酸，它是一种重要的化工原料和手性中间体，广泛应用于药物的合成(白国义，陈立功，邢鹏等.精细化工，2004，21(12)：943-9452；CN1510025A，公开日2004-07-07)。
目前，文献报道合成D-2-氨基丁酸的方法众多。例如，以D构型的蛋氨酸为原料经脱硫等步骤合成D-2-氨基丁酸(Compagnone R.S.et al.Journal of OrganicChemistry.1986,51:1713-1719)；丁酮酸的氨化水解反应法(Archer,Ian Victor Jameset al.WO:20080153137,2008-06-26)，化学拆分法(Soloshonok V.A.et al.Joural ofAmerican Chemical Society.2009,131:7208-7209)等。
奚强等(奚强,丁友友,林丫丫,李俊.2-氨基丁酸的酶拆分[J].武汉工程大学学报.2009,31(3):26-29.)先将外消旋的2-氨基丁酸乙酰化得到N-乙酰-2-氨基丁酸，然后用从猪肾中提取得到的氨基酰化酶选择性的水解掉(S)-构型的N-乙酰-2-氨基丁酸，从而获得(S)-2-氨基丁酸，并将未被水解的(R)-N-乙酰-2-氨基丁酸用适当的方法进行消旋化处理得到外消旋的2-氨基丁酸，从而实现其动态动力学拆分，其最终收率达到71.9％，
本发明所报道的制备N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的方法是通过生物催化N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯选择性水解，实现消旋体中的N-BOC-L-2-氨基丁酸酯被催化水解开环成酸，而D构型保持不变，进而根据物理性质的不同，将N-BOC-2-氨基丁酸酯的两种构型分开，最后得到光学纯的N-BOC-D-2-氨基丁酸酯。此制备方法具有立体选择性高、反应条件温和、收率高、产物易分离纯化及生产成本高等优点，易于工业化生产。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法，该方法以外消旋N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯为反应底物，以嗜烟碱节杆菌WYG001(CCTCC NO：M 2014054)经发酵培养获得的湿菌体或干菌体为催化剂，催化立体选择性水解N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯从而制备N-BOC-D-2-氨基丁酸酯，该方法具有立体选择性高、反应条件温和、收率高、产物易分离纯化及生产成本高等优点，易于工业化生产。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法，所述的方法为：以嗜烟碱节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)WYG001经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体冷冻干燥后的干菌体为催化剂，以N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯为底物，以0.1M、pH7.0磷酸缓冲液为反应介质，在20～40℃、200rpm条件下进行转化反应(优选反应1～30h)，反应结束后，将反应液分离纯化，获得N-BOC-D-2-氨基丁酸酯；所述嗜烟碱节杆菌WYG001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 2014054，保藏日期2014年2月28日，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
本发明所述催化剂的制备方法为：(1)斜面培养：将嗜烟碱节杆菌WYG001接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得菌体斜面；每升斜面培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)组成：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，pH 7.0-7.2，加水至1000mL；121℃灭菌20min。
(2)种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30℃、200r/min培养24h，获得种子液；种子培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH 7.0；
(3)发酵培养：在无菌条件下，以体积浓度6-8％的接种量将种子液接种于产酶培养基中，30℃、200r/min培养24h，获得发酵液，培养结束后将发酵液12000rpm离心10min，弃上清液，得到嗜烟碱节杆菌WYG001湿菌体；产酶培养基组成为：乳糖5-15g/L，酵母膏10-14g/L，NaCl 10g/L，MgSO40.22g/L、KH2PO40.136g/L，溶剂为水，pH 7.0；
(4)取步骤(3)湿菌体以1.2g/ml的量加入pH 7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀，-80℃条件下冷冻干燥，得到干菌体。
进一步，所述湿菌体的用量以缓冲液体积计为1～200g/L，优选10～200g/L。
进一步，所述干菌体的用量以缓冲液体积计为1～100g/L，优选10～50g/L。
进一步，所述底物初始浓度为1～50g/L，优选10～30g/L。
进一步，所述反应在20～40℃反应1～30h。
本发明所述N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯为N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯、N-BOC-DL-2-氨基丁酸乙酯或N-BOC-DL-2-氨基丁酸丙酯。
本发明所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂，得到N-BOC-D-2-氨基丁酸酯。
本发明反应流程见下式所示：
R＝甲基，乙基，丙基。
本发明所述医药中间体N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法的有益效果主要体现在：酶的选择性强，反应转化率高，下游分离简单，能耗低，环境污染小，适合工业化生产。
(四)附图说明
图1外消旋体N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯对照品气相色谱图，峰a为N-Boc-D-2-氨基丁酸甲酯，保留时间10.913min，峰面积463.1，峰高134，峰宽0.0533，对称因子1.293，峰b为N-Boc-L-2-氨基丁酸甲酯，保留时间11.075min，峰面积473.3，峰高143.3，峰宽0.0525，对称因子1.285；
图2 N-BOC-L-2-氨基丁酸甲酯标准品的气相色谱图，峰b为N-Boc-L-2-氨基丁酸甲酯，保留时间10.921min，峰面积991.7，峰宽0.0719，对称因子1.929；
图3微生物催化产物N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的气相色谱图，峰a为N-Boc-D-2-氨基丁酸甲酯，保留时间10.915min，峰面积151.4，峰高44.9，峰宽0.0533，对称因子1.039。
图4为菌株WYG001的菌落形态图。
图5为菌株WYG001在100倍下的光学显微照片。
图6为菌株WYG001的16S rDNA电泳图，A为菌株WYG001的电泳图，左侧泳道为菌株WYG001，右侧泳道为标准分子量，B为A的放大图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
1、微生物的筛选
本发明涉及到的微生物通过以下程序筛选分离得到：称取湿土样1～2g(从全国不同环境条件下土壤中取得)混悬于10mL 0.5％无菌生理盐水中，振荡混匀；接1～2mL混悬液于30mL液体富集培养基中，在30℃、200r/min下培养2～3d后，无菌操作转接1mL浑浊的菌液到新鲜的液体富集培养基，连续富集3次。富集培养基中，以N-BOC-DL-高丝氨酸内酯为唯一碳源，配方如下：NaNO34.0g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 1.0g/L，ZnSO40.05g/L，溶剂为水，pH 7.0。第一轮富集的N-BOC-DL-高丝氨酸内酯的浓度1g/L，第二轮的浓度为3g/L，第三轮的浓度为5g/L，pH 7.0。将第三轮富集后菌液经梯度稀释，涂布分离平板培养基，多次分离，获取单菌落。分离平板培养基组成为：富集培养基加入琼脂终浓度20g/L，底物N-BOC-DL-高丝氨酸内酯终浓度为5g/L，pH 7.0。
挑取分离得到的单菌落接种于斜面培养基，30℃培养1-2天，获得斜面菌体。从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至50mL的种子培养基，在30℃、200r/min培养24h，获得种子液。在无菌条件下，取3mL种子液接种于50mL的产酶培养基中，30℃、200r/min培养24h，获得发酵液。每升斜面培养基组成牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，pH 7.0-7.2，加水至1000mL；种子培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH 7.0；产酶培养基组成为：乳糖10g/L，酵母膏12g/L，NaCl 10g/L，MgSO40.22g/L、KH2PO40.136g/L，溶剂为水，pH 7.0。取15mL发酵液于50mL离心管中12000rpm离心10min，弃上清液，加入5mL0.1mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液，振荡混匀，再加入终浓度8g/L底物N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯，在30℃、200r/min下，转化反应24h。取出离心管，取1mL的反应液，加入2mL乙酸乙酯，充分振荡，6000rpm离心5min。取上层有机相1mL，用少量无水硫酸钠干燥除水，以高效液相色谱检测N-BOC-L-2-氨基丁酸酯的对映体过量值(e.e.)大于90％，反应转化率C为(45％-60％)，筛选得到所述微生物菌株，记为菌株WYG001。
2、微生物菌株的鉴定
生理生化特征：菌株WYG001为革兰氏阴性菌，专性好氧，生长对pH变化较敏感，最适pH为7.0，菌落形态见图4和图5所示。利用无机氮源的能力较差，生长和产酶受到Cu2+、Fe2 +、Al3+、Zn2+等的抑制，受到Mg2+、K+、Na+等的促进。
经测序鉴定，菌株WYG001的16S rDNA序列如下(SEQ ID NO.1)，电泳图见图6所示：
TGCTTACACATGCAAGTCGAACGATGATCCCAGCTTGCTGGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCTTGACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACTCCTCATCGCATGGTGGGGGGTGGAAAGCTTTTGTGGTTTTGGATGGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTAGGGAAGAAGCGTAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGCTGTGAAAGACCGGGGCTCAACTCCGGTTCTGCAGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGCAGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGTGGGGGACATTCCACGTTTTCCGCGCCGTAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATGAACCGGAAAGACCTGGAAACAGGTGCCCCGCTTGCGGTCGGTTTACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTATGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGGACTCATAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGTTGCGATACTGTGAGGTGGAGCTAATCCCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCACGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGGGGGAGCCGTCGAAGGTGGGACCGGCGATGGGACTAAGTC
根据生理生化特性和分子生物学鉴定，该菌株被鉴定为嗜烟碱节杆菌菌(Arthrobacter nicotinovorans)，命名为嗜烟碱节杆菌菌(Arthrobacternicotinovorans)WYG001，保藏于中国典型培养物保藏中心(地址中国，武汉，武汉大学，430072)，保藏编号CCTCC NO：M 2014054，保藏日期2014年2月28日。
实施例2：
(1)嗜烟碱节杆菌WYG001湿菌体和干菌体的制备
斜面培养：将嗜烟碱节杆菌WYG001接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得菌体斜面；斜面培养基组成同实施例1。
种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至100mL种子培养基，在30℃、200r/min培养24h，获得种子液；种子培养基组成同实施例1。
发酵培养：在无菌条件下，取10mL种子液接种于150mL的产酶培养基中，30℃、200r/min培养24h，获得发酵液，培养结束后将发酵液12000rpm离心10min，弃上清液，得到嗜烟碱节杆菌WYG001湿菌体。取湿菌体以1.2g/ml的量加入pH 7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀，-80℃条件下冷冻干燥得到干菌体，该干菌体比酶活力为6.34U/g。
(2)嗜烟碱节杆菌WYG001湿菌体和干菌体酶活测定方法
酶活单位定义：U为1个酶活力单位，所述的1个酶活力单位是在规定的条件下，每分钟催化水解1μmol N-BOC-2-氨基丁酸酯所需的酯水解酶的量。
用于酶活测定的N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯标准曲线方程：
配制浓度(w/v)分别为0.1％、0.2％、0.4％、0.5％、0.6％、0.8％、1.0％的外消旋N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯水溶液(w/v)，利用气相色谱进行检测，得出酯的浓度与峰面积之间的线性关系，以N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯的摩尔浓度为纵坐标，气相色谱检测所得峰面积为横坐标，得到标准曲线方程：y＝0.9487x-0.0005，在0.1％-1％(v/v)浓度范围内，相关系数R2＝0.995，达到了外标法所需的要求，该曲线可以用于N-BOC-2-氨基丁酸甲酯的分析测定。
酶活计算公式：
A＝[(a1-a)/a1]×[C×V/(M×t)]×106 公式(1)
A——样品中酶的活力(U)；
a——转化反应结束后转化液中N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯的峰面积；
a1——根据上述标准曲线方程计算出的与初始底物浓度相同的N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯标样的峰面积
C——转化液中，N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯的质量浓度，g/L；
V——转化液体积，L；
M——N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯的摩尔质量，g/mol；
t——转化时间，Min。
干菌体的酶活测定条件为：取0.2g菌粉，加入N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯0.1g和pH7.0、0.1mol/L磷酸缓冲液10mL，30℃、200rpm条件下，搅拌反应6h，反应结束后，将反应液过滤除去酶，取滤液用气相色谱分析测定转化后的BOC-2-氨基丁酸酯的含量，根据公式(1)计算酶活。
湿菌体的酶活测定条件为：取1.0g湿菌体，加入N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯0.1g和pH7.0、0.1mol/L磷酸缓冲液10mL，30℃、200rpm条件下，搅拌反应6h，反应结束后，将反应液过滤除去酶，取滤液用气相色谱分析测定转化后的N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯的含量，根据公式(1)计算酶活。
气相色谱分析条件：采用气相色谱仪Agilent 6890型气相色谱仪；手性气相色谱柱BGB-175(0.25mm×30m)；载气N2(14.54kPa)，分流比50:1，进样口温度250℃，检测器温度220℃；柱箱升温程序：初始温度为120℃保持2min，4℃/min升温到195℃，保持2min；进样量1.0μL，氢气流量：30mL/min空气流量：300mL/min；尾吹气流量：N225mL/min；氢离子火焰检测器。N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯和N-BOC-L-2-氨基丁酸甲酯分别在10.913min和11.075min出峰。
实施例3：
取实施例2方法获得的湿菌体0.6g，加入N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯0.1g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液10mL，30℃、200rpm条件下，搅拌反应5h，反应结束后，将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂后，得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯48.5mg。采用高效液相色谱(检测条件同实施例2)检测N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的对映体过量值e.e.S为99.9％，转化率C为51.5％，产率97.0％。结构表征如下：
无色油状液体；1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ5.08(s,1H,NH),4.30(s,1H,CH),3.77(s,3H,OCH 3),1.94-1.61(m,2H,CH 2),1.48(s,9H,CH 3×3),0.97(t,3H,J＝7.5Hz,CH 3)；[α]20 D+37.4(c 2.0,actone)；MS(EI)m/z 217(M)+.
对映体过量值(enantiomeric excesses)是衡量酶选择性的重要指标，N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的对映体过量值简称e.e.S，其计算公式为：
公式(2)
其中S表示底物，SR和SS分别为(D)-和(L)-构型的底物的峰面积。
反应转化率的计算公式为：
公式(2)
N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的收率(Yield)的计算公式为：
公式(3)
公式(2)和公式(3)中，SR0和SS0分别为(D)-和(L)-构型的底物的初始峰面积。
实施例4：
取实施例2方法获得的湿菌体1.0g，加入N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯0.1g，0.1M、pH7.0磷酸缓冲液10mL，在30℃、200rpm条件下，搅拌反应3.5h，反应结束后，将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂，得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯48mg。采用实施例3方法检测N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的对映体过量值e.e.S为99.9％，转化率C为51.0％，产率96.0％。
实施例5：
取实施例2方法获得的湿菌体2.0g，加入N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯0.2g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液10mL，在20℃、200rpm条件下，搅拌反应4h，反应结束后，将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂后，得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯95.4mg。采用实施例3方法进行气相检测，计算得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的对映体过量值e.e.S为98.5％，转化率C为52.0％，产率95.4％。
实施例6
取实施例2方法取发酵液离心所得湿菌体2.5g，加入N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯1g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液50mL，在35℃、200rpm条件下，搅拌反应30h后，将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂后，得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯462.5mg。采用实施例3方法进行气相检测，计算得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的对映体过量值e.e.S为94.9％，转化率C为52.3％，产率92.5％。
实施例7
取实施例2方法获得的干菌体20g，加入N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯20g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液2000mL，在30℃、200rpm条件下，搅拌反应6h，反应结束后，将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂后，得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯9.9g。采用实施例3方法气相检测，计算得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的对映体过量值e.e.S为99.9％，转化率C为50.1％，产率99.0％。
实施例8
取实施例2方法获得的干菌体3g，加入含有N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯3g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液100mL，在30℃、200rpm条件下，搅拌反应6h，反应结束后，将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂后，得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯1.491g。采用实施例3方法气相检测，计算得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的对映体过量值e.e.S为99.9％，转化率C为50.1％，产率99.4％。
实施例9
取实施例2方法获得的干菌体5.0g，加入含有N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯3.0g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液100mL，在32℃、200rpm条件下，搅拌反应5h，反应结束后，将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂后，得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯1.488g。采用实施例3气相检测，计算得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的对映体过量值e.e.S为99.9％，转化率C为50.1％，产率99.2％。
实施例10
取实施例2方法获得的干菌体2.0g，加入N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯1g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液100mL，在40℃、200rpm条件下，搅拌反应5.5h，反应结束后，将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂后，得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯482mg。采用实施例3方法气相检测，计算得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的对映体过量值e.e.S为99.9％，转化率C为54.4％，产率96.3％。
实施例11
取实施例2方法获得的干菌体5g，加入N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯2.5g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液50mL，在20℃、200rpm条件下，搅拌反应30h，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂后，得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯1.2g。采用实施例3方法气相检测，计算得到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的对映体过量值e.e.S为97.9％，转化率C为51.1％，产率96.0％。
实施例12
取实施例2方法获得的干菌体8.0g，加入N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯2g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液200mL，在30℃、200rpm条件下，搅拌反应7.0h，反应结束后，将反应液离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取(50mL×5)，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂后，得到光学纯的N-Boc-D-2-氨基丁酸甲酯2.11g，采用实施例3方法气相检测其光学纯度。检测到N-BOC-D-2-氨基丁酸甲酯的对映体过量值e.e.S为99.9％，转化率C为50.8％，产率为97.0％。
实施例13
取实施例2方法制得嗜烟碱节杆菌WYG001干菌体0.2g，加入N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯0.5mmol(0.108g)，加入0.1M、pH7.0磷酸缓冲液10mL，在32℃、200rpm条件下，搅拌反应7h，反应结束后，将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂后，得到N-BOC-D-2-氨基丁酸酯化合物，采用实施例3方法进行检测，结果见表1。同样条件下，分别用N-BOC-DL-2-氨基丁酸乙酯0.5mmol(0.116g)，N-BOC-DL-2-氨基丁酸丙酯0.5mmol(0.123g)替换N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯。
表1转化结果
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术内容作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法，其特征在于所述的方法为：以嗜烟碱节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)WYG001经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体冷冻干燥后的干菌体为催化剂，以N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯为底物，以0.1M、pH7.0磷酸缓冲液为反应介质，在20～40℃、200rpm条件下进行转化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得N-BOC-D-2-氨基丁酸酯；所述嗜烟碱节杆菌WYG001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2014054，保藏日期2014年2月28日，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
2.如权利要求1所述N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法，其特征在于所述催化剂的制备方法为：(1)斜面培养：将嗜烟碱节杆菌WYG001接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得菌体斜面；每升斜面培养基组成：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，pH 7.0-7.2，加水至1000mL；
(2)种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30℃、200r/min培养24h，获得种子液；种子培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH7.0；
(3)发酵培养：在无菌条件下，以体积浓度6-8％的接种量将种子液接种于产酶培养基中，30℃、200r/min培养24h，获得发酵液，培养结束后将发酵液12000rpm离心10min，弃上清液，得到嗜烟碱节杆菌WYG001湿菌体；产酶培养基组成为：乳糖5-15g/L，酵母膏10-14g/L，NaCl 10g/L，MgSO4 0.22g/L、KH2PO4 0.136g/L，溶剂为水，pH 7.0；
(4)取步骤(3)湿菌体以1.2g/ml的量加入pH 7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀，-80℃条件下冷冻干燥，得到干菌体。
3.如权利要求1所述N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法，其特征在于所述湿菌体的用量以缓冲液体积计为1～200g/L。
4.如权利要求1所述N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法，其特征在于所述干菌体的用量以缓冲液体积计为1～100g/L。
5.如权利要求1所述N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法，其特征在于所述底物初始浓度为1～50g/L。
6.如权利要求1所述N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法，其特征在于所述N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯为N-BOC-DL-2-氨基丁酸甲酯、N-BOC-DL-2-氨基丁酸乙酯或N-BOC-DL-2-氨基丁酸丙酯。
7.如权利要求1所述N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法，其特征在于所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂，得到N-BOC-D-2-氨基丁酸酯。
8.如权利要求2所述N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法，其特征在于产酶培养基组成为：乳糖10g/L，酵母膏12g/L，NaCl 10g/L，MgSO4 0.22g/L、KH2PO4 0.136g/L，溶剂为水，pH7.0。
9.如权利要求1所述N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制备方法，其特征在于所述反应在20～40℃反应1～30h。
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