CN104531778A - 一种利用干酪乳杆菌发酵甘蔗糖蜜制备工业乙醇的方法 - Google Patents

一种利用干酪乳杆菌发酵甘蔗糖蜜制备工业乙醇的方法 Download PDF

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Abstract

一种利用干酪乳杆菌发酵甘蔗糖蜜制备工业乙醇的方法，它涉及一种利用干酪乳杆菌发酵甘蔗糖蜜制备工业乙醇的方法。本发明的方法为：甘蔗糖蜜糖锤度稀释至5°BX，加入干酪乳杆菌生长必需氮源，调节pH值至6.0。灌装入发酵罐并密封，灭菌冷却后，接入1×108CFU/mL浓度干酪乳杆菌。发酵罐恒定pH值6.0，磁力搅拌器转数设定100rpm，通入惰性气体保持无氧发酵环境，37℃发酵48h。本发明的方法能够提高发酵速率，提高糖蜜中碳水化合物的利用率，降低糖蜜酒精发酵废液的污染。

Description

一种利用干酪乳杆菌发酵甘蔗糖蜜制备工业乙醇的方法
技术领域
本发明属于工业废弃物回收利用领域，及微生物领域。具体涉及一种利用干酪乳杆菌发酵甘蔗糖蜜制备工业乙醇的方法。
背景技术
甘蔗糖蜜是制糖厂以甘蔗为原料，经过压榨，蔗汁澄清净化，过滤处理后，蒸发浓缩、结晶制糖后分离出来的深棕色、粘稠状副产物，俗称桔水。其产量为原料甘蔗的2.5％～3.0％。其总糖含量约为50％，锤度大于60°Bx。甘蔗糖蜜含有水分、糖分、非糖有机物、蛋白质、维生素及微量元素等多种可利用成分。其中糖分主要是蔗糖、葡萄糖、果糖。由于其糖分所占比例很大，所以有充足的碳源可以供微生物利用，转化成有机酸及醇类等物质。甘蔗糖蜜发酵生产乙醇的优势——首先可以降低生产成本；其次，可以充分利用自然资源，回收利用工业废弃物；再次，可有效提高糖厂的经济效益。因此合理利用制糖厂废弃糖蜜有很重要的意义。
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)属于乳杆菌属(Lactobacillus)，是革兰氏阳性菌，不产芽孢。它是对营养非常挑剔，对发酵条件要求严格，以生产乳酸为主要代谢终产物的细菌。干酪乳杆菌作为益生菌通常被用来生产发酵类食品。然而，近年来的研究发现它具有一个巨大潜力——可以生产有广泛用途的生物燃料及其副产物。通常其糖代谢终产物倾向于转化为乳酸；然而一些乳酸菌具有异型发酵的能力，在乳酸菌碳水化合物代谢相关酶的作用下，可以使丙酮酸向乙醇转化。另外，乳酸菌具有一定的耐酸性，可以在较低pH值条件下生长，并且很多菌株能够耐受乙醇。因此，乳酸菌是具有发酵生产工业乙醇的潜力的。
目前，发酵糖蜜生产工业乙醇的方法是利用酵母菌，但常用酿酒酵母因其只能代谢葡萄糖而不能直接代谢木糖，使糖蜜中糖类利用率较低。而乳酸菌在碳水化合物代谢上具有一定的优势——许多乳酸菌能够发酵从水解木质纤维素生物质中释放出来的葡萄糖和木糖等糖类。糖蜜是植物来源工业废料，含有一定的木质纤维素，木质纤维素中木糖占总糖质量的10％～40％，对其充分利用，可提高乙醇产量，提高糖蜜利用率，降低酒精发酵废液对环境的污染。但是目前没有一种有效的方法能够利用干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)产乙醇，并大幅度提高乙醇产量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用干酪乳杆菌发酵甘蔗糖蜜制备工业乙醇的方法。该方法能够提高发酵速率，提高糖蜜中碳水化合物的利用率，降低糖蜜酒精发酵废液的污染。
本发明的一种利用干酪乳杆菌发酵甘蔗糖蜜制备工业乙醇的方法，它是按照以下步骤进行的：
一、从冷冻保存甘油管中挑取干酪乳杆菌接入MRS液体培养基，37℃培养24h；其中，MRS液体培养基pH＝6.0；
二、步骤一培养后的菌株，按浓度1×108CFU/mL接入灭菌的甘蔗糖蜜溶液，37℃培养24～30h；
三、将甘蔗糖蜜发酵液灌装到发酵罐中，密封所有进出口，灭菌冷却，待用；
四、步骤二培养后的菌株，按浓度1×108CFU/mL接入步骤三的发酵罐中发酵培养，设置自动pH恒定系统，使pH值恒定在5.95～6.05，磁力搅拌器转数设置为50～100rpm，向发酵罐中通入惰性气体，在发酵温度为37℃下发酵时间45～50h，然后利用超临界二氧化碳技术从酒精发酵液中提取乙醇，即完成所述的利用干酪乳杆菌发酵甘蔗糖蜜制备工业乙醇；
其中，所述的甘蔗糖蜜发酵液配方为：1L的糖锤度为4～6°Bx的甘蔗糖蜜溶液加入10.0g蛋白胨、10.0g牛肉膏和5.0g酵母膏，甘蔗糖蜜发酵液pH值为6.0。
本发明包含以下有益效果：
本发明的糖蜜发酵液能够使菌株提前适应糖蜜发酵的环境，以达到发酵的最佳效果。
适应性反应是乳酸菌应激保护作用的常见方式。当细胞生长环境突然发生改变，细胞进行适应时，生长状态和功能会发生相应的改变。所以，在细胞活化增殖期，让细胞提前适应糖蜜环境，有助于在生产中，维持细胞生长的稳定性。在MRS中活化增殖后，直接接入糖蜜中，细胞生长缓慢，约36h进入稳定期，而且细胞浓度低于1010CFU/mL；而经过MRS活化，糖蜜增殖培养后，接入糖蜜中的细胞生长约在28～32h达到稳定期，且细胞浓度高于1011CFU/mL。
本发明的糖蜜发酵液浓度，为最适干酪乳杆菌发酵生成高浓度乙醇的最低糖蜜浓度。干酪乳杆菌在发酵46～52h后，进入衰退期，且菌株将糖蜜发酵液中碳水化合物利用完全。
由于糖蜜浓度对应溶液中碳水化合物的浓度，其对菌株的生长情况及其编码碳源代谢的相关基因的启动有很大影响，因此糖蜜浓度直接影响发酵产物的种类与浓度。过高浓度的糖蜜溶液，会造成高渗透压抑制菌株生长，且浪费原料，提高成本，污染环境；而过低浓度又会造成碳源不足，发酵产出率低等问题；不同浓度的糖蜜溶液发酵生成乙醇的产出 率也是不同的。当糖锤度超过40°Bx的时候，干酪乳杆菌无法生长；在10°Bx及20°Bx的糖蜜溶液中，干酪乳杆菌长势良好，但糖蜜中蔗糖几乎没有利用，剩余溶液中糖浓度过大；5°Bx的糖蜜溶液发酵50h，三种碳源几乎完全被利用，且三种主产物中乙醇浓度最高。
本发明的在无氧条件下，干酪乳杆菌利用糖蜜发酵生成乙醇的产出率最高。
干酪乳杆菌的碳源代谢途径比较丰富，有氧条件下，其代谢产物以乙酸为主；而无氧条件下，其代谢产物更倾向于生成乙醇。
本发明的干酪乳杆菌利用甘蔗糖蜜发酵中，pH值设置为恒定6.0，乙醇产出率能够达到最高。
干酪乳杆菌在pH值为6.0的糖蜜溶液中，生长情况最优，细胞浓度可以达到1012CFU/mL以上。由于干酪乳杆菌在发酵过程中生成甲酸、乙酸、琥珀酸等有机酸副产物，会使pH值逐渐降低，从而影响干酪乳杆菌的细胞生长，因此利用自动加样泵加入碱液NaOH溶液来中和酸类副产物，使发酵液pH值始终维持在6.0，可以避免由于酸度提高抑制菌株生长。
本发明利用干酪乳杆菌发酵甘蔗糖蜜生产工业乙醇的方法，可以使乙醇产出浓度大于1％。
附图说明
图1为采用实施例一的方法干酪乳杆菌利用甘蔗糖蜜合成乙醇的示意图；其中，为蔗糖浓度变化曲线，为葡萄糖浓度变化曲线，为果糖浓度变化曲线，为乳糖浓度变化曲线，为乙醇浓度变化曲线。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种利用干酪乳杆菌发酵甘蔗糖蜜制备工业乙醇的方法，它是按照以下步骤进行的：
一、从冷冻保存甘油管中挑取干酪乳杆菌接入MRS液体培养基，37℃培养24h；其中，MRS液体培养基pH＝6.0；
二、步骤一培养后的菌株，按浓度1×108CFU/mL接入灭菌的甘蔗糖蜜溶液，37℃培养24～30h；
三、将甘蔗糖蜜发酵液灌装到发酵罐中，密封所有进出口，灭菌冷却，待用；
四、步骤二培养后的菌株，按浓度1×108CFU/mL接入步骤三的发酵罐中发酵培养，设置自动pH恒定系统，使pH值恒定在5.95～6.05，磁力搅拌器转数设置为50～100rpm， 向发酵罐中通入惰性气体，在发酵温度为37℃下发酵时间45～50h，然后利用超临界二氧化碳技术从酒精发酵液中提取乙醇，即完成所述的利用干酪乳杆菌发酵甘蔗糖蜜制备工业乙醇；
其中，所述的甘蔗糖蜜发酵液配方为：1L的糖锤度为4～6°Bx的甘蔗糖蜜溶液加入10.0g蛋白胨、10.0g牛肉膏和5.0g酵母膏，甘蔗糖蜜发酵液pH值为6.0。
本实施方式的干酪乳杆菌购买自American type culture collection(ATCC，编号为334)。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：采用NaOH溶液和HCl溶液调节糖蜜发酵液pH值至6.0。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：使pH值恒定所用碱液为NaOH溶液，酸液为HCl溶液。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：糖锤度为4～6°Bx的甘蔗糖蜜溶液是由冷藏贮存的应季糖蜜稀释至糖锤度为4～6°Bx而成的。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：1L的MRS液体培养基配方为：10.0g的蛋白胨、10.0g的牛肉膏、5.0g的酵母膏、20.0g的葡萄糖、5.0g的乙酸钠、2.0g的柠檬酸二胺、2.0g的磷酸氢二钾、0.2g的七水硫酸镁、0.05g的七水硫酸锰和1.0g的吐温80，MRS液体培养基pH＝6.0。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中灭菌的甘蔗糖蜜溶液的糖锤度为4～6°Bx。其它与具体实施方式一相同。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例一
本实施例的利用干酪乳杆菌发酵甘蔗糖蜜制备工业乙醇的方法，是按照以下步骤进行的：
(1)本实施例用到的甘蔗糖蜜来自于广西某大型制糖厂，因糖蜜中几乎不含有乳酸菌生长所必需的氮源，所以添加营养丰富的常用基础氮源；
最终，实施例中用到的发酵液配方为：1L糖锤度为5°Bx甘蔗糖蜜，加入浓度为10g
蛋白胨溶液、浓度为10g牛肉膏溶液和浓度为5g酵母膏溶液； 
(2)用浓度为5mol/L的NaOH溶液和浓度为5mol/L的HCl溶液，调节最适干酪乳杆菌生长的发酵基础液pH值至6.0；灌装到发酵罐中，密封所有进出口，灭菌，冷却，待用；
(3)干酪乳杆菌购买自American type culture collection(ATCC，编号为334)；从冷冻保存甘油管中挑取干酪乳杆菌菌株接入2mL的MRS液体培养基(pH＝6.0)，37℃培养24h；其中，1L的MRS液体培养基配方为：10.0g的蛋白胨、10.0g的牛肉膏、5.0g的酵母膏、20.0g的葡萄糖、5.0g的乙酸钠、2.0g的柠檬酸二胺、2.0g的磷酸氢二钾、0.2g的七水硫酸镁、0.05g的七水硫酸锰和1.0g的吐温80，MRS液体培养基pH＝6.0，MRS液体培养基pH＝6.0。
(4)菌株以1×108CFU/mL浓度，从MRS培养基中接入10mL灭菌的甘蔗糖蜜溶液，此糖蜜溶液参考步骤1中糖蜜发酵液的配制，37℃培养24h；此操作目的在于让菌株提前适应糖蜜发酵的环境，以达到发酵的最佳效果；
(5)菌株以1×108CFU/mL浓度，从糖蜜发酵液中接入步骤2中准备好的发酵罐。设置自动pH恒定系统，使pH值恒定在6.0(碱液：5mol/LNaOH溶液，酸液：5mol/LHCl溶液)。磁力搅拌器转数设置为100rpm；通入惰性气体保持无氧环境；发酵温度37℃，时间48h；
(6)利用超临界二氧化碳技术从酒精发酵液中提取乙醇。
利用实施例一的方法可以使干酪乳杆菌发酵甘蔗糖蜜生产乙醇的浓度达到1.17％。即如果如图1所示，利用此方法可以达到乙醇产率最高，乙醇与乳酸产量比例最大。蔗糖、葡萄糖和果糖在48h内几乎完全被利用。
本实施例采用的干酪乳杆菌一般被用来发酵生产干酪，常用底物为牛乳，可利用碳源为牛乳中的乳糖和半乳糖。在极少数文献中有提过干酪乳杆菌具有生产乙醇的能力，但是还没有人尝试研究利用干酪乳杆菌生产工业乙醇。本实施例正是利用此种方法使干酪乳杆菌生产工业乙醇的浓度有了极大的提高。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

Claims (6)

1.一种利用干酪乳杆菌发酵甘蔗糖蜜制备工业乙醇的方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：
一、从冷冻保存甘油管中挑取干酪乳杆菌接入MRS液体培养基，37℃培养24h；其中，MRS液体培养基pH＝6.0；
二、步骤一培养后的菌株，按浓度1×108CFU/mL接入灭菌的甘蔗糖蜜溶液，37℃培养24～30h；
三、将甘蔗糖蜜发酵液灌装到发酵罐中，密封所有进出口，灭菌冷却，待用；
四、步骤二培养后的菌株，按浓度1×108CFU/mL接入步骤三的发酵罐中发酵培养，设置自动pH恒定系统，使pH值恒定在5.95～6.05，磁力搅拌器转数设置为50～100rpm，向发酵罐中通入惰性气体，在发酵温度为37℃下发酵时间45～50h，然后利用超临界二氧化碳技术从酒精发酵液中提取乙醇，即完成所述的利用干酪乳杆菌发酵甘蔗糖蜜制备工业乙醇；
其中，所述的甘蔗糖蜜发酵液配方为：1L的糖锤度为4～6°Bx的甘蔗糖蜜溶液加入10.0g蛋白胨、10.0g牛肉膏和5.0g酵母膏，甘蔗糖蜜发酵液pH值为6.0。
2.根据权利要求1一种利用干酪乳杆菌发酵甘蔗糖蜜制备工业乙醇的方法，其特征在于采用NaOH溶液和HCl溶液调节糖蜜发酵液pH值至6.0。
3.根据权利要求1一种利用干酪乳杆菌发酵甘蔗糖蜜制备工业乙醇的方法，其特征在于使pH值恒定所用碱液为NaOH溶液，酸液为HCl溶液。
4.根据权利要求1一种利用干酪乳杆菌发酵甘蔗糖蜜制备工业乙醇的方法，其特征在于糖锤度为4～6°Bx的甘蔗糖蜜溶液是由冷藏贮存的应季糖蜜稀释至糖锤度为4～6°Bx而成的。
5.根据权利要求1一种利用干酪乳杆菌发酵甘蔗糖蜜制备工业乙醇的方法，其特征在于1L的MRS液体培养基配方为：10.0g的蛋白胨、10.0g的牛肉膏、5.0g的酵母膏、20.0g的葡萄糖、5.0g的乙酸钠、2.0g的柠檬酸二胺、2.0g的磷酸氢二钾、0.2g的七水硫酸镁、0.05g的七水硫酸锰和1.0g的吐温80，MRS液体培养基pH＝6.0。
6.根据权利要求1一种利用干酪乳杆菌发酵甘蔗糖蜜制备工业乙醇的方法，其特征在于步骤二中灭菌的甘蔗糖蜜溶液的糖锤度为4～6°Bx。
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Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘宏军等: "超临界二氧化碳在乙醇发酵－分离过程中的应用", 《天津轻工业学院学报》 *
孙天昊等: "干酪乳杆菌LC-STH-13高密度培养基优化", 《农产品加工》 *
张穗生等: "甘蔗糖蜜酒精高产酵母的发酵特性研究", 《广西科学》 *
王松等: "干酪乳杆菌12A碳源代谢的比较基因组学分析", 《微生物学通报》 *

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