CN104531530A

CN104531530A - 一种雨生红球藻的破壁方法

Info

Publication number: CN104531530A
Application number: CN201410748548.4A
Authority: CN
Inventors: 李本明
Original assignee: QINGDAO WUWEI INSULATION MATERIAL Co Ltd
Current assignee: QINGDAO WUWEI INSULATION MATERIAL Co Ltd
Priority date: 2014-12-10
Filing date: 2014-12-10
Publication date: 2015-04-22

Abstract

本发明公开了一种雨生红球藻的破壁方法，藻种培养、藻种预处理、去除叶绿素、细胞破壁等步骤。本方法冰浴条件下冰醋酸可以更快的渗透到雨生红球藻细胞的表层；匀浆过程中的搅拌离心力、挤压力、剪切力对海藻细胞进行破碎，并且物料之间的摩擦力加速细胞表面冰醋酸对细胞壁结构中糖蛋白的破坏；同时，冰浴醋酸的介入避免了匀浆过程中海藻细胞温度升高，最大程度的保护虾青素的理化活性。本发明所述的破壁方法，细胞的破壁率高达97.7%。

Description

一种雨生红球藻的破壁方法

技术领域

本发明涉及一种雨生红球藻的破壁方法，属于生物培养技术领域。

背景技术

雨生红球藻是一种生活在淡水中的单细胞绿藻，在特定条件下能积累大量的类胡萝卜素(可达干重的2％ -5％)，其中80％以上为虾青素及其酯类D。雨生红球藻的生活周期主要分为营养细胞和厚壁孢子，一般认为环境有利时，形成营养孢子；环境不利时，形成厚壁孢子并大量累积虾青素。虾青素(Astaxanthin)可作为脂溶性的色素，具有艳丽的红色和强的抗氧化性能；在食品工业中，不仅能有效起到保鲜、保色、保味、保质等作用，而且能为多类食品着色，增加食品的色泽美感；另外动物实验表明虾青素有抑制肿瘤发生、增强免疫功能等多方面的生理作用，因此虾青素在功能食品和医药等方面应用广泛。利用有机溶剂可以直接从雨生红球藻细胞中提取虾青素，但是由于雨生红球藻的厚壁孢子具有坚韧的细胞壁，若直接利用将导致其生物有效利用率降低，而厚壁孢子结构又阻碍了有机溶剂进入细胞内提取虾青素，因而虾青素提取率较低。故在虾青素提取前必须先进行孢子态细胞的破壁处理，以破坏雨生红球藻的细胞结构，特别是其细胞壁的结构，而雨生红球藻的破壁方法对于虾青素的提取率和质量至关重要。

目前，雨生红球藻的破壁方法主要有物理机械破壁方法、酶解法和化学法：酶解方法对于虾青素的破坏最小，但是破壁率较低并且增加了后续分离的难度，不适合大规模的工业化生产；化学方法比较系统，但是在其过程中使用了有机溶剂，不但成本较高并且不环保，不能达到食品生产的绿色标准；物理机械破壁方法绿色环保，分离简单，适合大规模的工业化生产，但是目前，细胞的破壁率较低，通常为70%，而达到90%的破壁方法耗能严重、成本昂贵。

雨生红球藻的物理机械破壁方法主要包括高压匀质方法、超声波法、研磨法、匀浆法、冻融解冻法和微波破解法，欧阳琴（福州大学学报，2005,33（1）：111-115）等研究后发现，高压匀质方法最适合雨生红球藻的破壁，可以达到92.9%的破壁率，但是虾青素的提取率并不理想仅为28.0μg/mg（细胞干重）；而周湘池（海洋与湖沼，2006,37（5）：424-428）等研究表明，匀浆法和超声波法对于后续虾青素提取和分离有影响，而直接研磨在破壁过程中降低了虾青素的活性，加液氮低温研磨法无污染并且最大限度的保留了虾青素的生理活性，但是液氮低温研磨法只适用于研究室而不适合大规模的工业化生产。专利CN101691348A采用超临界CO2萃取直接提取雨生红球藻干粉，该工艺绿色环保并且对虾青素的生理活性影响较小，但是该方法所用设备昂贵，成本很高，物特殊的破壁工艺且虾青素的提取率低。

目前，急需要一种绿色环保、成本低廉、对虾青素生理活性无影响且虾青素提取率低的雨生红球藻破壁方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种破壁率高、绿色环保无公害、成本低、适用于大规模工厂化生产的雨生红球藻的机械破壁方法，通过该方法对雨生红球藻进行破壁，对虾青素的生理活性影响最低，虾青素的提取率高并且符合食品生产的绿色标准。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：

一种雨生红球藻的破壁方法，包括以下步骤：

（1）、藻种培养：培养池自然培养6～8天增殖后，向池水中加入磷酸二氢钾和硝酸钠，并在池上覆盖红色薄膜，在波长为630nm～760nm 光照射下将雨声红球藻培养至转化态；然后向池水中继续添加磷酸二氢钾，并在池上覆盖蓝色薄膜，在波长为430nm～490nm光波照射下，让雨生红球藻细胞养至成熟态；

（2）藻种预处理：收集步骤1中成熟的雨生红球藻，在300-500r/min下离心10-15min后弃去上清液制备藻液；收集藻液，继续在3000-3500r/min下离心10-15min，之后去除上清液收集沉淀形成浓缩藻液；

（3）去除叶绿素：向浓缩藻液中加入20%甲醇和5%氢氧化钾的混合液，在60-65℃下搅拌处理10-20min从而去除叶绿素，最后在300-500r/min条件下离心5-10min，弃上清液得孢子态藻细胞悬浮液；

（4）细胞破壁：将步骤3中所得的孢子态藻细胞悬浮液与冰醋酸混合均匀，在-4-0℃下冰浴10-20min，然后向上述混合液中加入去离子水并且置于匀浆机中匀浆5-10min得藻浆液，向藻浆液中加入液氮混匀后静置5-10min后得破壁海藻液。

优选的，步骤1中，向池水中加入磷酸二氢钾和硝酸钠，使磷酸二氢钾在池水中的密度为0.005～0.01克/升、硝酸钠在池水中的密度为0.005-0.008克/升；所述的向池水中继续添加磷酸二氢钾，使磷酸二氢钾在池水中的密度为0.01～0.015克/升。

优选的，步骤4中，所述的孢子态藻细胞悬浮液与冰醋酸、去离子水的体积比为1:2-5:1-3。

优选的，步骤4中，所述的冰醋酸的浓度为0.3%-1%。

优选的，步骤4中，所述的液氮的加入体积为：100mL藻浆液中加入2-5mL液氮。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

冰浴条件下，冰醋酸可以更快的渗透到雨生红球藻细胞的表层；在匀浆过程中，利用螺旋桨施加的搅拌离心力、挤压力、剪切力对海藻细胞进行破碎，并且物料之间的摩擦力加速细胞表面的冰醋酸对细胞壁结构中糖蛋白的破坏；同时，由于冰浴的醋酸的介入避免了匀浆过程中温度的升高，最大程度的保护了虾青素的理化活性，所得的虾青素提取物为暗红色粘稠物质。本发明所述的破壁方法，细胞的破壁率高达97.7%。

具体实施方式

以下通过实施例进一步阐述本发明的有益效果：

实施例1：

一种雨生红球藻的破壁方法，包括以下步骤：

（1）、藻种培养：培养池自然培养6～8天增殖后，向池水中加入磷酸二氢钾和硝酸钠（使磷酸二氢钾在池水中的密度为0.005～0.01克/升、硝酸钠在池水中的密度为0.005-0.008克/升），并在池上覆盖红色薄膜，在波长为630nm～760nm 光照射下将雨声红球藻培养至转化态；然后向池水中继续添加磷酸二氢钾（使磷酸二氢钾在池水中的密度为0.01～0.015克/升），并在池上覆盖蓝色薄膜，在波长为430nm～490nm光波照射下，让雨生红球藻细胞养至成熟态；

（2）藻种预处理：收集步骤1中成熟的雨生红球藻，在400r/min下离心15min后弃去上清液制备藻液；收集藻液，继续在3000r/min下离心10min，之后去除上清液收集沉淀形成浓缩藻液；

（3）去除叶绿素：向浓缩藻液中加入20%甲醇和5%氢氧化钾的混合液，在60-65℃下搅拌处理15min从而去除叶绿素，最后在400r/min条件下离心10min，弃上清液得孢子态藻细胞悬浮液；

（4）细胞破壁：将步骤3中所得的孢子态藻细胞悬浮液与1%冰醋酸混合均匀，在-4-0℃下冰浴15min，然后向上述混合液中加入去离子水并且置于匀浆机中匀浆5min得藻浆液，孢子态藻细胞悬浮液与冰醋酸、去离子水的体积比为1:2:1；向藻浆液中加入液氮静置5min后得破壁海藻液，100mL藻浆液中加入2mL液氮。

实施例2：

操作过程与实施例1相同，所不同的是步骤4中，冰醋酸的浓度为0.3%。

实施例3：

操作过程与实施例1相同，所不同的是步骤4中，冰醋酸的浓度为0.6%。

实施例4：

操作过程与实施例3相同，所不同的是步骤4中，孢子态藻细胞悬浮液与冰醋酸、去离子水的体积比为1:5:2。

实施例5：

操作过程与实施例3相同，所不同的是步骤4中，孢子态藻细胞悬浮液与冰醋酸、去离子水的体积比为1:3:2。

实施例6：

操作过程与实施例5相同，所不同的是步骤4中，液氮的加入体积为100mL藻浆液中加入5mL液氮。

实施例7：

对比试验：

将未进行细胞破碎的孢子态藻细胞悬浮液记为对照组0，将仅用0.6%的冰醋酸（孢子态藻细胞悬浮液与冰醋酸体积比为1:3）对孢子态藻细胞悬浮液进行破壁处理记为对照组1，将仅对孢子态藻细胞悬浮液进行匀浆破壁处理记为对照组2，将仅对孢子态藻细胞悬浮液进行加液氮破壁处理记为对照组3，同时将实施例1-7记为实验组1-7。

将经过不同处理的对照组和实施例获得的破壁海藻液，分别加入加2倍重量的无水乙醇，低温10℃下震荡5min，离心回收乙醇；继续加乙醇、震荡、离心、回收乙醇这个过程2次，合并回收所有的乙醇，低温真空浓缩，乙醇挥发回收，留下的物质即为虾青素。

测量如下指标：

计算细胞破壁率：按照金传荫（食品化学，200,68:443-448）记载的“浮游生物计数框”进行细胞计数，计算公式为：细胞破壁率（%）=（原始未破壁细胞数目-破壁后完整细胞数目）/原始未破壁细胞数目×100%。

细胞干重计算：取步骤1中所得的孢子态藻细胞悬浮液100ml，置于80℃烘箱中烘干24h，冷却后称重。

计算虾青素提取物得率（100%）=虾青素提取物重量/细胞干重×100%。

计算产物中虾青素含量：准确称取25mg虾青素纯样品，用丙酮溶解并定容至25 mL，分别准确移取出0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0mL，用丙酮稀释并定容至50mL，于490nm处测吸光值，以丙酮做空白组绘制样品的标准曲线；称取虾青素提取物10mg，用丙酮稀释并并定容至25 mL，在490nm处测吸光值，将吸光值带入标准曲线中推出待测液浓度C，产物中虾青素重量=（C×25 mL/10mg×100%）×虾青素提取物重量。

计算虾青素得率（100%）=产物中虾青素重量/细胞干重×100%。

实验结果如表1所示：

表1：不同破壁处理对雨生红球藻破壁率和虾青素提取率的影响

组别	细胞干重mg(100ml)	虾青素提取物重量mg	虾青素提取物得率（%）	虾青素重量mg	虾青素得率（100%）	细胞破壁率（%）
							对照组0	399.7	3	0.75	1.7	0.42	——
对照组1	400.8	28	6.99	20	5.0	68
							对照组2	392.9	15	3.82	10.2	2.5	50
对照组3	399.3	10	2.5	7	1.75	20
							实施例1	399.4	120.8	30.25	99.9	25.0	93.2
实施例2	400.4	128.1	31.99	100.8	25.17	93.9
							实施例3	400.9	128.9	32.15	118.2	29.48	94.5
实施例4	399.1	130.1	32.60	120.9	30.29	94.8
							实施例5	398.7	136.7	34.29	130.2	32.66	96.9
实施例6	401.2	140.2	34.95	132.5	33.02	97.2
							实施例7	400.0	148.1	37	140.2	35.05	97.7

由本发明表1数据可知，本发明的冰醋酸冰浴、匀浆机匀浆和液氮低温处理相结合的方法对雨生红球藻进行破壁处理，其细胞破壁率和虾青素的提取率明显高于对照组，同时可以计算产物中虾青素的浓度，实施例1-7中虾青素浓度分别为82.7%、78.69%、91.70%、92.93%、95.25%、94.51%、94.66%，产物的浓度极高，而对照组0-3分别为56.67%、71.42%、68%和70%。

上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种雨生红球藻的破壁方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的雨生红球藻的破壁方法，其特征在于，步骤1中，向池水中加入磷酸二氢钾和硝酸钠，使磷酸二氢钾在池水中的密度为0.005～0.01克/升、硝酸钠在池水中的密度为0.005-0.008克/升；所述的向池水中继续添加磷酸二氢钾，使磷酸二氢钾在池水中的密度为0.01～0.015克/升。

3.根据权利要求1所述的雨生红球藻的破壁方法，其特征在于，步骤4中，所述的孢子态藻细胞悬浮液与冰醋酸、去离子水的体积比为1:2-5:1-3。

4.根据权利要求1所述的雨生红球藻的破壁方法，其特征在于，步骤4中，所述的冰醋酸的浓度为0.3%-1%。

5.根据权利要求1所述的雨生红球藻的破壁方法，其特征在于，步骤4中，所述的液氮的加入体积为：100mL藻浆液中加入2-5mL液氮。