CN104513854A - 一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药生物技术领域，尤其是一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒及其应用技术。本发明设计的试剂盒包括以下两种组成：PCR 反应缓冲液、酶混合液、沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体/耐药性基因多重反应液；或PCR 反应缓冲液、酶混合液、沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体多重反应液、耐药性基因反应液。本发明的试剂盒采用多重荧光定量PCR 技术，能在同一PCR 反应管中同时检测多个靶标基因，为同时检测病原体及其耐药性基因提供有力技术支撑。其方法具有对样本需要量少、成本低、操作简便、灵敏度高，特异性好的特点，具有极大的社会和经济意义。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域，尤其是一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒及其应用，具体涉及一种沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体和耐药性基因的试剂盒及其应用。
背景技术
性传播疾病(STD) 是一组全球性传染病，主要通过性接触传播，部分STD 则可通过非性接触传播，比如通过共用针头、哺乳甚至接触传播。
目前STD 在我国的发病率呈不断上升的趋势，其中由沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，CT) 、人型支原体(M.humenis，MH )和解脲支原体(Ureaplasma urealyticum，UU) 三种病原体引起的泌尿生殖道感染，已成为医院妇科、皮肤性病科、泌尿生殖科的常见疾病，为我国重点防治的对象。
沙眼衣原体（CT）是一类在细胞内寄生的微生物，革兰氏阴性。目前发现它有 15 个血清型，不同的血清型能引起不同的疾病。沙眼衣原体可以引起沙眼、包涵体包膜炎、泌尿生殖道感染、性病淋巴肉芽肿等疾病。非淋菌性尿道炎（NGU）的40%～50%是由沙眼衣原体感染引起的；为全国监测病种。
解脲支原体（UU）是脲原体属中的一种，是人类泌尿生殖道常见的寄生菌之一，是非淋球菌性尿道炎（NGU）的常见病原体之一。解脲支原体多寄生在男性尿道、阴茎包皮和女性阴道。若上行感染，可引起男性前列腺炎或附睾炎、女性阴道炎、宫颈炎，并可感染胎儿导致流产、早产及低体重胎儿，也能引起新生儿呼吸道和中枢神经系统的感染。
人型支原体(MH) 是支原体的一种，寄居于人的泌尿生殖道，是引起泌尿生殖道感染，尤其是女性泌尿生殖道感染的常见病原之一，可引起女性盆腔炎、肾盂肾炎、阴道炎等疾病。
近年来由于支原体衣原体引起的生殖道感染等疾病逐年增加，加上不规范治疗和盲目用药，耐药菌株不断增加，对各种抗菌药物的敏感性均显著降低，疗效也逐渐下降，抗生素的耐药性问题日益突出。耐药菌的快速准确的检测，在合理使用抗生素及减少耐药性发生和传播等方面有重要意义。其中四环素类耐药尤为严重。
培养法
目前，临床上人型支原体(MH)、解脲支原体(UU)及沙眼衣原体（CT）及耐药性检测方法主要是病原体的分离培养。但培养法检测耗时长，一般需经48-72 小时才能得到结果；灵敏度低，受采集、运送、保存等影响较大，容易出现假阴性结果；操作烦琐，导致各种操作的结果判别标准难以统一，需要的技术和设备要求高。免疫学方法相比培养法有了长足的进步，但是因为生殖道微生物之间存在的交叉反应使得该方法的特异性受到影响，容易出现假阳性反应，给治疗带来误判的可能。病原体的多重实时荧光定量PCR检测可以快速准确的确定病原体种类及耐药性基因，可在临床上作为早期快速诊断的方法，给病原体的用药选择及用药后监控，提供有力的技术支撑。目前临床上还没有相关同时检测病原体与耐药性基因的产品。
荧光定量PCR 检测技术融汇了PCR 的灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，是目前临床检验中认同程度很高的一种检测技术，已广泛应用于科学研究和临床检测。但多重荧光定量PCR 由于其技术难度在临床上的应用才刚刚开始。目前已上市产品中绝大多数为单通道检测，只能进行单重PCR反应，一个PCR反应管一次反应只能检测一种基因或病原体，不能特异地对多个靶标基因或病原体进行检测，且临床上没有相关方法的支原体耐药性检测试剂。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒及其应用。
一、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，该试剂盒包括以下各组组分：
PCR 反应液、酶混合液、沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体/耐药性基因多重反应液；
所述的沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体/耐药性基因多重反应液包括以下组分：
组分（1）：由一对检测沙眼衣原体的引物和一条检测沙眼衣原体的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.1 和SEQ ID No.2 所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.3所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分（2）：由一对检测解脲支原体的引物和一条检测解脲支原体的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.4 和SEQ ID No.5 所示；探针的碱基序列为SEQID No.6 所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分（3）：由一对检测人型支原体的引物和一条检测人型支原体的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.7 和SEQ ID No.8 所示；探针的碱基序列为SEQID No.9 所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分（4）：由一对检测解脲支原体四环素类药物的耐药性基因的引物和一条检测解脲支原体四环素类药物的耐药性基因的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.10 和SEQ ID No.11 所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.12所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。
二、根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述试剂盒包括以下组分：
PCR 反应液、酶混合液、沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体多重反应液、耐药性基因反应液；
所述沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体多重反应液包含以下组分：
组分（1）：由一对检测沙眼衣原体的引物和一条检测沙眼衣原体的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.1 和SEQ ID No.2 所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.3所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分（2）：由一对检测解脲支原体的引物和一条检测解脲支原体的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.4 和SEQ ID No.5 所示；探针的碱基序列为SEQID No.6 所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分（3）：由一对检测人型支原体的引物和一条检测人型支原体的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.7 和SEQ ID No.8 所示；探针的碱基序列为SEQID No.9 所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
所述耐药性基因反应液包含以下组分：
组分：由一对检测解脲支原体四环素类药物的耐药性基因的引物和一条检测解脲支原体四环素类药物的耐药性基因探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.10 和SEQ ID No.11 所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.12所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。
三、根据本发明的另一个实施例，进一步包括该试剂盒还包括有组分：阳性对照一和阴性对照。
四、根据本发明的另一个实施例，进一步包括该试剂盒还包括有组分：阳性对照二和阴性对照。
五、根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述的荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、ROX、CY3 或CY5 荧光报告基团，且沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体/耐药性基因多重反应液中组分（1）、组分（2）、组分（3）和组分（4）中的荧光报告基团各不相同。
六、根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述的荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、ROX、CY3 或CY5 荧光报告基团，且沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体多重反应液中组分（1）、组分（2）和组分（3）的荧光报告基团各不相同。
七、根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述的荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1 和Tamra 任意四种荧光淬灭基团。
八、根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述的PCR反应液包括10×缓冲液、25mM MgCl2、10mM dUTP 和10mM dNTPs。
九、根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述的酶混合液包括Taq 酶和UNG 酶，所述的Taq 酶为热启动Taq 酶，所述的UNG 酶为尿嘧啶-N- 糖基化酶。
十、根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述的阳性对照一包括以下组分：
组分（1）：为含有部分沙眼衣原体(CT) 的质粒pSotonE8 基因片段，大小为166bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.13 ；
组分（2）：为含有部分解脲支原体(UU)16S 核糖体RNA 基因片段，大小为164bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.14 ；
组分（3）：为含有部分人型支原体GAP基因片段，大小为160bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.15 ；
组分（4）：为含有部分解脲支原体(UU)四环素耐药Tn916基因片段，大小为406bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.16
十一、根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述的阳性对照二包括两种组合：
组合1包含以下组分：
组分（1）：为含有部分沙眼衣原体(CT) 的质粒pSotonE8 基因片段，大小为166bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.13 ；
组分（2）：为含有部分解脲支原体(UU)16S 核糖体RNA 基因片段，大小为164bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.14 ；
组分（3）：为含有部分人型支原体GAP基因片段，大小为160bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.15 ；
组合2包含以下组分：
为含有部分解脲支原体(UU)四环素耐药Tn916基因片段，大小为406bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.16。
十二、根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述的阴性对照为无菌水。
十三、本发明还进一步包括该试剂盒在非淋球菌性尿道炎、以及不孕不育常见病原体检测中的应用。
本发明的有益效果是：
（1）本发明的试剂盒能够同时检测出沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体和耐药性基因，填补了现有荧光定量PCR产品只能检测性病病原体不能检测耐药基因的空白。
（2）本发明还具有灵敏度高、特异性好、可重复性强、检测结果快速客观、且可节约成本等优点，在沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体和耐药性基因体外诊断领域具有极大的应用前景。
（2）本试剂盒操作简便且能有效防止污染，PCR 荧光检测时间（从标本处理开始）仅为2-3小时，PCR 荧光检测是全封闭操作，加入待测样本核酸提取物之后可以不再打开管盖，减少了污染产生的机会。反应液中加入了UNG 酶，防止了扩增产物的污染。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1 是本发明试剂盒参考品检测的曲线图。
图2 是本发明试剂盒检测人型支原体（MH）灵敏度试验结果图。
图3 是本发明试剂盒检测解脲支原体（UU）的灵敏度试验结果图。
图4 是本发明试剂盒检测沙眼衣原体（CT）的灵敏度试验结果图。
图5 是本发明试剂盒检测四环素类类药物灵敏度试验结果图。
图6 是本发明试剂盒检测人型支原体（MH）的特异性试验结果图。
图7 是本发明试剂盒检测解脲支原体（UU）的特异性试验结果图。
图8是本发明试剂盒检测沙眼衣原体（CT）的特异性试验结果图。
图9 是本发明试剂盒检测四环素类类药物的特异性试验结果图。
具体实施方式
下面结合附图1~9及实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例一
试剂盒包括以下组分：
PCR 反应液、酶混合液、沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体/耐药性基因多重反应液、阳性对照一、阴性对照；
PCR反应液包括10×缓冲液、25mM MgCl2、10mM dUTP 和10mM dNTPs ；
酶混合液包括Taq 酶和UNG 酶，所述的Taq 酶为热启动Taq 酶，所述的UNG 酶为尿嘧啶-N-糖基化酶。
沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体/耐药性基因多重反应液上游下游引物、及探针的配比为：6:4:2；优选的上游引物为600nM，下游引物为400nM，探针为200nM。
本实施例中使用的人型支原体、解脲支原体、沙眼衣原体及解脲支原体四环素耐药基因的引物和探针的核苷酸序列可参见表1。
表1 本发明中人型支原体、解脲支原体、沙眼衣原体及解脲支原体四环素耐药基因的引物和探针的核苷酸序列表
| CT-P | X1-TCAATGCAACGGGTTATTCACTCCC-Y1 | SEQ ID No.1 |
| CT-F | GCTTTTAACAACTTTCCAATCACT | SEQ ID No.2 |
| CT-R | CAGTTCCTCCTAATAAAGTTTCAATG | SEQ ID No.3 |
| UU-P | X2-CGACTTTCTACATCTTCTCATGCGA-Y2 | SEQ ID No.4 |
| UU-F | GCTAATACCGAATAATAACATCAAT | SEQ ID No.5 |
| UU-R | CAACTATCTGATACGTCGCACC | SEQ ID No.6 |
| MH-P | X3-ACTGTTTAGCTCCTATTGCCAACGTATTG-Y3 | SEQ ID No.7 |
| MH-F | ACTGTTTAGCTCCTATTGCCAACGTATTG | SEQ ID No.8 |
| MH-R | GTTGTCATAAATCCTTTTTCAATACC | SEQ ID No.9 |
| UU-TEL-F | GAACTGTATCCTAATGTGTG | SEQ ID No.10 |
| UU-TEL-F | GATACTCTAACCGAATCTCG | SEQ ID No.11 |
| UU-TEL-P | X4-GTTCTCGTTCCCTCTTTATCATGG-Y4 | SEQ ID No.12 |
注：X1、X2 、X3、X4 为荧光报告基团，Y1、Y2 、Y3、Y4 为荧光淬灭基团。引物和探针由专业合成公司合成。
阳性对照一包括以下组分：
组分（1）：为含有部分沙眼衣原体(CT) 的质粒pSotonE8 基因片段，大小为166bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.13；
组分（2）：为含有部分解脲支原体(UU)16S 核糖体RNA 基因片段，大小为164bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.14 ；
组分（3）：为含有部分人型支原体GAP基因片段，大小为160bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.15 ；
组分（4）：为含有部分解脲支原体(UU)四环素耐药Tn916基因片段，大小为406bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.16。
表2 本发明中人型支原体、解脲支原体、沙眼衣原体及解脲支原体四环素耐药基因阳性对照的核苷酸序列表
阴性对照为无菌水。
将上述实施例一制备的试剂盒进行检测使用，其具体方法如下：
一、先进行样本的采集与保存，要求如下
用医用棉拭子伸入男性尿道口或女性宫颈口约1-2cm, 旋转1 周，停留10 秒钟后取出，将拭子头放入1ml 生理盐水浸泡贴管壁挤干，取0.5ml 加入0.5ml 尿液保存液混合，该样本即为待测样本。样本采集后应及时检测，也可-20℃保存待测，保存期一般不超过4个月，长期保存请置于-70℃。样本避免反复冻融，采用干冰或冰袋低温运输。
二、检测方法
1. 试剂准备（试剂准备区）
反应液配制1（样本检测）：
| 反应液组份 | 加量 ( μl/反应) |
| PCR反应液 | 5 |
| 沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体/耐药性基因多重反应液 | 5 |
| 酶混合液 | 1 |
| 纯化水 | 7 |
| 总体积 | 18 |
反应液配制2（阴性对照）：
| 反应液组份 | 加量 (μl)/每反应 |
| PCR反应液 | 5 |
| 沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体/耐药性基因多重反应液 | 5 |
| 酶混合液 | 1 |
| 纯化水 | 7 |
| 总体积 | 18 |
反应液配制3（阳性对照）：
| 反应液组份 | 加量 (μl)/每反应 |
| PCR反应液 | 5 |
| 沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体/耐药性基因多重反应液 | 5 |
| 酶混合液 | 1 |
| 纯化水 | 7 |
| 总体积 | 18 |
2. 样本处理（样本处理区）
2.1 取出样本，振荡混匀（如为冻存样本应先置室温化冻）。吸取1ml样本于带螺口的离心管中，12,000rpm离心5分钟，小心吸弃上清，保留沉淀物。
2.2 加入50ul 细胞裂解液至样本沉淀物中，用枪头反复吹打至均匀液体，95-100℃沸水浴/干浴5分钟（避免爆管）。
2.3 样品12,000rpm离心10分钟，保留上清，取2ul用于荧光定量PCR检测（如果样本裂解产物当天不使用，建议保存在－20℃）。
应采用灭菌的带滤芯枪头及离心管，所有样品的制备均在样本处理区进行。
3.加样
3.1 在上述准备好的反应液配制1中分别加入处理好的待测样本（10pg-100ng）各2μl，终体积为20μl/管，盖紧管盖，瞬时低速离心。
3.2 在上述准备好的反应液配制2（阴性对照）中加入阴性对照参考品2μl，终体积为20μl/管，盖紧管盖，瞬时低速离心。
3.3 在上述准备好的反应液配制3 （阳性对照一）中加入阳性对照参考品 2μl，终体积为20μl/管，盖紧管盖，瞬时低速离心。
4. PCR扩增检测
4.1 将反应管放入荧光 PCR 扩增仪进行扩增检测。
4.2 循环参数设定（请参照各类仪器的操作说明进行设置）
三、检验结果分析
在仪器正常，阴性参考品、阳性参考品曲线（图1）均正常的情况下
1. 在 CT≤36，判断为对应通道病原体为阳性。
2. 在 36＜CT≤40，再重复一次实验，结果相同的情况下，判断为阳性。
3. 在 Ct＞40 或无扩增，此次结果判断为阴性。
检测结果判定为阳性，提示存在相应病原体或耐药基因，阴性提示无相应病原体或耐药基因。病原体存在耐药基因，表明对四环素治疗不敏感，建议改用其他抗生素药物治疗。病原体阳性、耐药基因阴性，建议用四环素药物治疗。
16例样本检测结果与临床相符，展示了该试剂盒的灵敏性和特异性，本实验结果与使用单重PCR 荧光定量方法相符，探针之间无明显交叉反应。
实施例二：
试剂盒包括以下组分：
PCR 反应液、酶混合液、沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体多重反应液、耐药性基因反应液、阳性对照1、阳性对照2、阴性对照；
PCR反应液包括10×缓冲液、25mM MgCl2、10mM dUTP 和10mM dNTPs ；
酶混合液包括Taq 酶和UNG 酶，所述的Taq 酶为热启动Taq 酶，所述的UNG 酶为尿嘧啶-N- 糖基化酶。
沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体多重反应液上游、下游引物及探针的配比为：6:4:2；优选的上游引物为600nM，下游引物为400nM，探针为200nM。
耐药性基因反应液上游、下游引物及探针的配比为：6:4:2；优选的上游引物为600nM，下游引物为400nM，探针为200nM。
阳性对照包括2种组合，组分如下：
阳性对照1包含以下组分：
组分（1）：为含有部分沙眼衣原体(CT) 的质粒pSotonE8 基因片段，大小为166bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.13 ；
组分（2）：为含有部分解脲支原体(UU)16S 核糖体RNA 基因片段，大小为164bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.14 ；
组分（3）：为含有部分人型支原体GAP基因片段，大小为160bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.15 ；
阳性对照2包含以下组分：
为含有部分解脲支原体(UU)四环素耐药Tn916基因片段，大小为406bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.16。
阴性对照为去无菌水。引物、探针及阳性参考品的核苷酸序列同实例一。
将上述实施例二制备的试剂盒进行检测使用，其具体方法如下：
一、先进行样本的采集与保存，要求同实施例一
二、检测方法
1. 试剂准备（试剂准备区）
反应液配制1（样本检测）：
反应液配制2（样本检测）
反应液配制3（阴性对照）：
| 反应液组份 | 加量 (μl)/每反应 |
| PCR反应液 | 5 |
| 沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体多重反应液 | 5 |
| 酶混合液 | 1 |
| 纯化水 | 7 |
| 总体积 | 18 |
反应液配制4（阴性对照）：
| 反应液组份 | 加量 (μl)/每反应 |
| PCR反应液 | 5 |
| 耐药性基因反应液 | 5 |
| 酶混合液 | 1 |
| 纯化水 | 7 |
| 总体积 | 18 |
反应液配制5（阳性对照1）：
| 反应液组份 | 加量 (μl)/每反应 |
| PCR反应液 | 5 |
| 沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体多重反应液 | 5 |
| 酶混合液 | 1 |
| 纯化水 | 7 |
| 总体积 | 18 |
反应液配制6（阳性对照2）：
| 反应液组份 | 加量 (μl)/每反应 |
| PCR反应液 | 5 |
| 耐药性基因反应液 | 5 |
| 酶混合液 | 1 |
| 纯化水 | 7 |
| 总体积 | 18 |
2. 样本处理（样本处理区）
2.1 取出样本，振荡混匀（如为冻存样本应先置室温化冻）。吸取1ml样本于带螺口的离心管中，12,000rpm离心5分钟，小心吸弃上清，保留沉淀物。
2.2 加入50ul 细胞裂解液至样本沉淀物中，用枪头反复吹打至均匀液体，95-100℃沸水浴/干浴5分钟（避免爆管）。
2.3 样品12,000rpm离心10分钟，保留上清，同一管分别取2ul用于病原体与耐药基因荧光定量PCR检测（如果样本裂解产物当天不使用，建议保存在－20℃）。
应采用灭菌的带滤芯枪头及离心管，所有样品的制备均在样本处理区进行。
3.加样
3.1 在上述准备好的反应液配制1和反应液配制2中分别加入处理好的待测样本（10pg-100ng）各2μl，终体积为20μl/管，盖紧管盖，瞬时低速离心。
3.2 在上述准备好的反应液配制3和反应液配制4（阴性对照）中加入阴性对照参考品（纯化水）各 2μl，终体积为20μl/管，盖紧管盖，瞬时低速离心。
3.3 在上述准备好的反应液配制5 （阳性对照1）中加入阳性对照1参考品（含部分人型支原体GAP基因、解脲支原体16S 核糖体RNA 基因、沙眼衣原体pSotonE8 基因片段 ）2μl，终体积为20μl/管，盖紧管盖，瞬时低速离心。
3.4 在上述准备好的反应液配制6 （阳性对照2）中加入阳性对照2参考品（含部分解脲支原体四环素耐药Tn916基因片段）2μl，终体积为20μl/管，盖紧管盖，瞬时低速离心。
4. PCR扩增检测
4.1 将反应管放入荧光 PCR 扩增仪进行扩增检测。
4.2 循环参数设定（请参照各类仪器的操作说明进行设置）
三、检验结果分析
结果分析与样本检测结果同实例一，无明显差异。
试验例一 本发明试剂盒的灵敏性试验
阳性对照参考品为人型支原体(MH)、解脲支原体(UU)和沙眼衣原体（CT）以及耐药性靶向基因扩增片段，通过专业机构合成；10倍梯度稀释至1000拷贝每毫升（图1中右面起跳的扩增曲线）。
阴性参考品为纯化水，纯化水1000ml，然后在灭菌锅中121℃，20min 高温灭菌，做好标记，室温保存。
采用本发明试剂盒进行检测。
检测结果表明：本发明试剂盒对于人型支原体(MH)、解脲支原体(UU)及沙眼衣原体（CT）及四环素耐药性的检测具有良好的灵敏性，达到1000拷贝每毫升，并且CT 值随浓度减少呈梯度改变。见图2、图3、图4、图5。
试验例二 本发明试剂盒的特异性试验
为了检测本发明人型支原体(MH)、解脲支原体(UU)及沙眼衣原体（CT）及四环素耐药性核酸检测试剂盒（荧光PCR 法）的特异性，用本发明人型支原体(MH)、解脲支原体(UU)及沙眼衣原体（CT）及四环素耐药性核酸检测试剂盒（荧光PCR 法）检测单纯疱疹病毒II 型（HSV-II）、人乳头状瘤病毒（HPV）、巨细胞病毒（CMV）、人型支原体、生殖支原体、阴道加特纳菌、阴道毛滴虫、嗜酸乳杆菌、白色念珠菌、沙门氏菌、志贺氏菌。
检测结果表明：本发明检测试剂盒能特异性扩增人型支原体(MH)、解脲支原体(UU)及沙眼衣原体（CT）及四环素耐药性基因，而不与阴道内其它细菌和病毒的核酸发生交叉反应，见图6、图7、图8、图9。
以上结果说明本发明的试剂盒在临床上普遍适用，且灵敏度好，特异性高，准确率高，且操作过程省时省力。
<110> 常州百代生物科技有限公司
<120> 一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒及其应用
<160> 16
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<212> DNA
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tcaatgcaac gggttattca ctccc 25
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caactatctg atacgtcgca cc 22
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actgtttagc tcctattgcc aacgtattg 29
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gttgtcataa atcctttttc aatacc 26
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gaactgtatc ctaatgtgtg 20
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Claims (13)
1.一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其特征是，该试剂盒包括以下各组组分：
PCR 反应液、酶混合液、沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体/耐药性基因多重反应液；
所述的沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体/耐药性基因多重反应液包括以下组分：
组分（1）：由一对检测沙眼衣原体的引物和一条检测沙眼衣原体的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.1 和SEQ ID No.2 所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.3所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分（2）：由一对检测解脲支原体的引物和一条检测解脲支原体的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.4 和SEQ ID No.5 所示；探针的碱基序列为SEQID No.6 所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分（3）：由一对检测人型支原体的引物和一条检测人型支原体的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.7 和SEQ ID No.8 所示；探针的碱基序列为SEQID No.9 所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分（4）：由一对检测解脲支原体四环素类药物的耐药性基因的引物和一条检测解脲支原体四环素类药物的耐药性基因的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.10 和SEQ ID No.11 所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.12所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括以下组分：
PCR 反应液、酶混合液、沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体多重反应液、耐药性基因反应液；
所述沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体多重反应液包含以下组分：
组分（1）：由一对检测沙眼衣原体的引物和一条检测沙眼衣原体的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.1 和SEQ ID No.2 所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.3所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分（2）：由一对检测解脲支原体的引物和一条检测解脲支原体的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.4 和SEQ ID No.5 所示；探针的碱基序列为SEQID No.6 所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分（3）：由一对检测人型支原体的引物和一条检测人型支原体的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.7 和SEQ ID No.8 所示；探针的碱基序列为SEQID No.9 所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
所述耐药性基因反应液包含以下组分：
组分：由一对检测解脲支原体四环素类药物的耐药性基因的引物和一条检测解脲支原体四环素类药物的耐药性基因探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.10 和SEQ ID No.11 所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.12所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求1一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其特征是，该试剂盒还包括有组分：阳性对照一和阴性对照。
4.根据权利要求2一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其特征是，该试剂盒还包括有组分：阳性对照二和阴性对照。
5.根据权利要求1所述的一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其特征是，所述的荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、ROX、CY3 或CY5 荧光报告基团，且沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体/耐药性基因多重反应液中组分（1）、组分（2）、组分（3）和组分（4）中的荧光报告基团各不相同。
6.根据权利要求2所述的一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其特征是，所述的荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、ROX、CY3 或CY5 荧光报告基团，且沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体多重反应液中组分（1）、组分（2）和组分（3）的荧光报告基团各不相同。
7.根据权利要求1或权利要求2所述的一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其特征是，所述的荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl 和Tamra 任意四种荧光淬灭基团。
8.根据权利要求1或权利要求2所述的一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其特征是，所述的PCR反应液包括10×缓冲液、25mM MgCl2、10mM dUTP 和10mM dNTPs。
9.根据权利要求1或权利要求2所述的一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其特征是，所述的酶混合液包括Taq 酶和UNG 酶，所述的Taq 酶为热启动Taq 酶，所述的UNG 酶为尿嘧啶-N- 糖基化酶。
10.根据权利要求3所述的一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其特征是，所述的阳性对照一包括以下组分：
组分（1）：为含有部分沙眼衣原体(CT) 的质粒pSotonE8 基因片段，大小为166bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.13 （具体序列见表2，以下涉及阳性对照核苷酸序列均见表2）；
组分（2）：为含有部分解脲支原体(UU)16S 核糖体RNA 基因片段，大小为164bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.14 ；
组分（3）：为含有部分人型支原体GAP基因片段，大小为160bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.15 ；
组分（4）：为含有部分解脲支原体(UU)四环素耐药Tn916基因片段，大小为406bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.16。
11.根据权利要求4所述的一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其特征是，所述的阳性对照二包括两种组合：
组合1包含以下组分：
组分（1）：为含有部分沙眼衣原体(CT) 的质粒pSotonE8 基因片段，大小为166bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.13 ；
组分（2）：为含有部分解脲支原体(UU)16S 核糖体RNA 基因片段，大小为164bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.14 ；
组分（3）：为含有部分人型支原体GAP基因片段，大小为160bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.15 ；
组合2包含以下组分：
为含有部分解脲支原体(UU)四环素耐药Tn916基因片段，大小为406bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.16。
12.根据权利要求1或权利要求2的一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其特征是，所述的阴性对照为无菌水。
13.根据权利要求1~12所述的一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒在非淋球菌性尿道炎、以及不孕不育常见病原体检测中的应用。
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