CN104507970A

CN104507970A - 通过抑制p68与钙调蛋白相互作用来预防癌症转移及抑制炎症的方法

Info

Publication number: CN104507970A
Application number: CN201380023852.6A
Authority: CN
Inventors: 刘志仁; 王海珍
Original assignee: Proda Biotech LLC
Current assignee: Proda Biotech LLC
Priority date: 2012-03-14
Filing date: 2013-03-13
Publication date: 2015-04-08
Anticipated expiration: 2033-03-13
Also published as: EP2825562A4; EP2825562B1; US20150037342A1; CN104507970B; EP2825562A1; WO2013138484A1; US11214624B2

Abstract

本发明揭示用于抑制癌症转移及炎症的组合物及方法。所述方法一般涉及对一受治疗者施用一含有能选择性地抑制p68RNA解旋酶在癌细胞中结合到钙调蛋白(CaM)的药剂的组合物。

Description

通过抑制P68与钙调蛋白相互作用来预防癌症转移及抑制炎症的方法

先前相关申请资料

本申请对在2012年3月14日提交的美国61/610,853号临时专利申请(U.S.Provisional PatentApplication Serial No.61/610,853)提出优先权要求，而且据此通过引用将所述美国临时专利申请全部并入本专利。

关于美国联邦资助的研究或发展的声明

本发明是在美国政府支持下由美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)根据“CA118113号协议”(Agreement CA118113)作出的。美国政府拥有所述发明的某些权利。

技术领域

本发明一般涉及细胞迁移，尤其涉及用于抑制癌细胞转移及炎症的多种组合物及方法。

背景

虽然癌症的研究及治疗方面已有极大进步，但癌症在美国是排名第二的主要死亡原因。这些死亡中大约有90％是由于癌症转移，而癌症转移指的是癌细胞从其起源组织迁移并在其他部位移生的能力。

发明内容

本发明揭示用于抑制细胞迁移的组合物及方法。由于转移及炎症涉及异常的细胞迁移。因此，本发明揭示用于抑制癌细胞转移或炎症的组合物及方法。所述方法一般涉及对一需要给药的受治疗者施用一含有能选择性地抑制p68核糖核酸解旋酶(p68RNA解旋酶)在癌细胞中结合到钙调蛋白(CaM)的药剂的组合物。

在有些实施例中，所述药剂是一种肽，该种肽含有人p68的IQ基序或一能结合人钙调蛋白(CaM)的保守性变体。所述人p68的IQ基序含有氨基酸序列FVSAGIQTSF RTGNPTGTYQ(SEQID NO:8)。然而，所述药剂也可以是含有氨基酸序列FVSAGIQTSF RTGNPTG(SEQ ID NO:7)或FVSAGIQTSFRTGNPTGAYG(SEQ ID NO:4)的肽。

在有些实施例中，用于本发明揭示的方法中的多种肽的分子大小及电荷相同，以便对癌细胞进行有效渗透。在有些实施例中，所述肽的长度为6至30个氨基酸。在有些实施例中，所揭示的肽进一步含有一细胞渗透(内化)序列。

在其他实施例中，所述药剂是一选择性地结合癌细胞中的p68RNA解旋酶的IQ基序的抗体。

本发明也揭示多种用于识别用于抑制癌症转移的药剂的方法。这些方法一般涉及在适合p68肽结合到钙调蛋白(CaM)肽的条件下，使一候选药剂接触一含有p68肽及钙调蛋白(CaM)肽的试样，以及测定所述p68肽结合到所述钙调蛋白(CaM)肽。在这些方法中，与一对照试样相比，p68/钙调蛋白(CaM)结合的减少显示药剂抑制癌症转移。在一个例子中，所述p68肽至少含有人p68核糖核酸(RNA)解旋酶的IQ基序或一能结合人钙调蛋白(CaM)的保守性变体，而且所述钙调蛋白(CaM)肽至少含有人钙调蛋白(CaM)的p68结合区域或一能结合p68的保守性变体。

本发明也揭示多种用于治疗癌症及抑制癌症转移的药用组合物。所述多种药用组合物可以含有一可选择性地抑制p68核糖核酸(RNA)解旋酶结合到钙调蛋白(CaM)的肽及一药学上可接受的载体。在有些实施例中，所述药用组合物按用于抑制癌症在受治疗者身上转移的单位剂量施用。在有些实施例中，介于大约1及2mg/kg之间的剂量的所述结合剂有效。在有些实施例中，所述药用组合物进一步含有一抗肿瘤药剂。

本发明也揭示一含有人p68的IQ基序或一能结合人钙调蛋白(CaM)的保守性变体及一细胞渗透序列的隔离肽。

附图说明

图1A为一柱形图，其显示人细胞角蛋白-18信使核糖核酸(CK-18mRNA)水平(定量逆转录-聚合酶链反应[RT-PCR]，相对于β-肌动蛋白)：(1)得自以PepIQ治疗(柱形1-5)、以一横跨氨基酸584-602的p68肽片段(“PepY593”，SEQ ID NO:2)治疗(柱形6-10)、以磷酸化的PepY593肽(“PepPhoY593”，SEQ ID NO:3)(柱形11-15)或一横跨氨基酸549-568的p68肽片段(“PepIQ”，SEQ ID NO:4)治疗(柱形16-20)(各片段在N-末端与TAT细胞可渗透性序列(SEQ ID NO:6)融合)的、带有SW620肿瘤的异种移植物的小鼠的脾脏提取物的人细胞角蛋白-18信使核糖核酸(CK-18mRNA)水平；或(2)在无肿瘤植入但直接注射100个SW620细胞(10²细胞/脾)的情况下，得自采集自小鼠的脾脏的人细胞角蛋白-18信使核糖核酸(CK-18mRNA)水平。

图1B为一图表，其显示在经过28日的细胞增生之后以缓冲剂治疗14日(柱形1)、以PepY593肽治疗14日(柱形2)、以PepPhoY593治疗14日(柱形3)或以PepIQ治疗14日(柱形4)的情况下，采集自小鼠的SW620肿瘤的肿瘤重量(g)。

图1C为一折线图，其显示SW620肿瘤在以缓冲剂(-■-)、PepY593肽(-·-)、PepPhoY593(-◆-)或PepIQ(-▲-)治疗之后，其肿瘤体积(mm³)为时间的函数而随时间变化，所述肿瘤体积以下列公式计算：肿瘤体积＝π/6x(宽度)2x长度。图1D为一柱形图，其显示以缓冲剂治疗(柱形1)、以PepIQ治疗(柱形2)、以PepY593肽治疗(柱形3)或以PepPhoY593治疗(柱形4)的SW620细胞中的溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入(经过48小时的培养之后的折叠变化)。

图2为一柱形图，其显示以缓冲剂治疗(柱形1)、以PepIQ治疗(柱形2)或以一带有TAT的乱序重排肽(“PepScram”，SEQ ID NO:5)治疗(柱形3)的SW480细胞在(相对于缓冲剂对照物的)一“博伊登室趋化性试验”(Boydon Chamber assay)中的细胞迁移。

图3A为一柱形图，其显示表达：(1)以靶向p68的核糖核酸干扰(RNAi)(“+”代表“siRNA(p68)”)或非靶核糖核酸干扰(RNAi)(“NT”)治疗；及(2)以空载体(Vec)转染或以一表达血凝素(HA)标记的p68(“HA-p68”)的载体转染(所述p68为野生型(“WT”)或所述p68含有IQ基序中的突变(“IQ-M”)、三磷酸腺苷酶(ATPase)活性缺失突变(“LGLD”)或Y593F突变)的SW480细胞的(相对于缓冲剂对照物的)一“博伊登室趋化性试验”(Boydon Chamber assay)中的细胞迁移。图3B为一柱形图，其显示以siRNA(p68)治疗并以空载体(Vec)或一表达WT、IQ-M、LGLD或Y593F HA-p68s的载体转染的SW480细胞的转移(在划痕创伤之后在一固定微观区域中的相对数量)。

图4为一柱形图，其显示三磷酸腺苷酶(ATPase)活性(μM水解自三磷酸腺苷的无机磷酸盐)，包括在：(1)存在存在对照(柱形1及5)、得自酵母的RNA提取物(柱形2)或体外组装微管(MT)培养基(柱形3-4、6-11)的情况下，(2)存在对照(柱形1-3)、0.5mM CaCl₂(Ca²⁺)(柱形4-6、8、10-11)或5mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)(柱形7及9)的情况下，以及(3)存在(柱形5-11)或不存在(柱形1-4)重组钙调蛋白(CaM)的情况下，对照组(柱形5-7)、HA-p68WT(柱形1-4、8-10)或免疫提纯自“SW480划痕试验”的细胞溶解产物的LGLD(柱形11)的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性。

图5A为一图表，其显示在经过26日的细胞增生之后以缓冲剂治疗14日(柱形1)、以PepScram治疗14日(柱形2)或以PepIQ治疗14日(柱形3)的情况下，所采集的4T1肿瘤的肿瘤重量(g)。图5B及5C为柱形图，其显示以缓冲剂治疗(柱形1)、以PepScram治疗(柱形2)或以PepIQ治疗(柱形3)的荷载4T1肿瘤的小鼠的肺脏中的转移结节的数目(图5B)及平均体积(图5C)。图5D为一柱形图，其显示来自以缓冲剂治疗(柱形1)、以PepScram治疗(柱形2)或以PepIQ治疗(柱形3)的荷载4T1肿瘤的小鼠的肝组织切片中的微转移病灶数目。所述微转移病灶数目按从每一肝脏的随机选择的三个组织切片随机选择的4个区域计算，而p值则通过成对“斯图顿特t-检验”(Student’st-Tests)来计算。

图6为一柱形图，其显示人细胞角蛋白-18信使核糖核酸(CK-18mRNA)水平(定量逆转录-聚合酶链反应[RT-PCR]，相对于β-肌动蛋白)：得自以PepIQ治疗(柱形1-5)或以PepScram治疗(柱形6-10)的、带有SW620肿瘤的异种移植物的小鼠的脾脏提取物的人细胞角蛋白-18信使核糖核酸(CK-18mRNA)水平；或在无肿瘤植入但直接注射100个SW620细胞(10²细胞/脾)的情况下，得自采集自小鼠的脾脏的人细胞角蛋白-18信使核糖核酸(CK-18mRNA)水平。

图7A为一柱形图，其显示人细胞角蛋白-18信使核糖核酸(CK-18mRNA)水平(定量逆转录-聚合酶链反应[RT-PCR]，相对于β-肌动蛋白)：(1)得自以空载体转染(柱形1-6)、以一表达增强绿色荧光蛋白(eGFP)的载体转染(柱形7-12)或以一包含融合到增强绿色荧光蛋白(eGFP)的C-末端的横跨氨基酸584-602的p68肽片段的融合蛋白(“eGFP-IQ”，SEQ ID NO:6)转染(柱形13-18)的、带有SW620肿瘤的异种移植物的小鼠的脾脏提取物的人细胞角蛋白-18信使核糖核酸(CK-18mRNA)水平；或(2)在无肿瘤植入但直接注射100个SW620细胞(10²细胞/脾)的情况下，得自采集自小鼠的脾脏的人细胞角蛋白-18信使核糖核酸(CK-18mRNA)水平。

图7B为一图表，其显示采集自运载以一表达eGFP-IQ(柱形1)或eGFP(柱形2)的载体转染的SW620细胞肿瘤的小鼠的小鼠脾脏的荧光强度(任意单位)。图7C为一图表，其显示在经过28日的细胞增生之后所采集的以空载体(Vec)转染(柱形1)或以一表达eGFP(柱形2)或eGFP-IQ(柱形3)的SW620肿瘤的肿瘤重量(g)。图7D为一柱形图，其显示以一表达eGFP(柱形1)或eGFP-IQ(柱形2)的载体转染的SW620细胞在(相对于eGFP对照物的)一“博伊登室趋化性试验”(Boydon Chamber assay)中的细胞迁移。p值通过成对“斯图顿特t-检验”(Student’s t-Test)来计算。

图8为一柱形图，其显示以0ng/ml(柱形1)、50ng/ml(柱形2)、100ng/ml(柱形3)或500ng/ml(柱形4)的表皮细胞生长因子(EGF)治疗的SW480细胞在(相对于对照物的)“博伊登室趋化性试验”(Boydon Chamber assay)中的细胞迁移。

图9为一柱形图，其显示：在不存在培养基(柱形1)的情况下、在存在核糖核酸(RNA)培养基(柱形2)的情况下、在存在MT培养基(柱形3-4)的情况下以及在最理想地存在0.5mM CaCl₂(Ca²⁺)(柱形4)的情况下，免疫提纯自SW480细胞(无划痕创伤处置)的细胞溶解产物的HA-p68的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性(μM水解自三磷酸腺苷的无机磷酸盐)。

图10A为一示意图，其显示类似于p68与钙调蛋白(CaM)的相互作用的“p68-CaM”融合蛋白。图10B为一柱形图，其显示以siRNA(p68)治疗并以一空载体(Vec)(柱形1)或一表达p68或p68-CaM的载体(柱形2)转染的SW480细胞在(相对于Vec对照物的)“博伊登室趋化性试验”(Boydon Chamber assay)中的细胞迁移。图10C为一柱形图，其显示：(1)在不存在培养基(柱形1)的情况下、在存在核糖核酸(RNA)培养基(柱形2)的情况下、或在存在MT培养基(柱形3-4)的情况下，(2)在存在0.5mM CaCl₂(Ca)的情况下，以及(3)在最理想地存在4mM ATP(柱形1-3)的情况下，组氨酸标记的p68-CaM的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性(μM水解自三磷酸腺苷的无机磷酸盐)。

图11为一柱形图，其显示以缓冲剂对照物治疗(柱形1)、以PepIQ治疗(柱形2)或以PepScram治疗(柱形3)的4T1细胞在(相对于对照物的)“博伊登室趋化性试验”(Boydon Chamber assay)中的细胞迁移。

具体实施方式

I.定义

术语“肿瘤性细胞”指的是经历异常细胞增殖(“瘤形成”)的细胞。肿瘤性细胞的增生超过其周围的正常组织或与其周围的正常组织不协调。即使在刺激因素停止之后，所述增生典型地以相同的过量方式持续，而且典型地导致肿瘤形成。

术语“转移”指的是恶性肿瘤细胞从一个器官或部位扩散到另一非相邻的器官或部位。癌细胞可以从一原发性肿瘤“脱离”、“泄漏”或“溢出”、进入淋巴管及血管、通过血液循环，然后定居下来并在身体的其他部位的正常组织中生长。当肿瘤细胞转移时，新肿瘤称为继发性或转移性癌症或肿瘤。

术语“抗癌”或“抗肿瘤”指的是能抑制或预防癌症生长、癌症侵袭及/或癌症转移的组合物，如药物或生物制剂。

术语“个人”、“宿主”、“受治疗者”及“患者”在本文中可相互替代使用，指的是给药或治疗的对象的任何个人。所述受治疗者可以是脊椎动物(如哺乳动物)。因此，所述受治疗者可以是人类患者或牲畜患者。

术语“治疗有效”指的是所使用的组合物的数量足以改善一疾病或紊乱的一个或多个病因或症状。这样的改善只需要病因或症状减轻或改变，而不一定是消除病因或症状。

术语“药学上可接受的”指的是那些与合理的利益/风险比率相称的、在没有过多毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症的条件下，在合理的医疗判断范围内适合用于接触人类及动物的组织的化合物、材料、组合物及/或剂型。

术语“治疗”指的是在意图治愈、改善、稳定或预防一疾病、病理状态或紊乱的情况下对一患者进行的医学管理。这个术语包括积极疗法(即特殊导向改善一疾病、病理状态或紊乱的疗法)，也包括病因疗法(即导向去除所述相关疾病、病理状态或紊乱的病因的疗法)。此外，这个术语包括纾缓疗法(即为减轻症状而不是治愈所述疾病、病理状态或紊乱而设计的疗法)；预防性疗法(即导向最小化或部分地或全面地抑制所述相关疾病、病理状态或紊乱的发展的疗法)；支持性疗法(即用于补充另一导向改善所述相关疾病、病理状态或紊乱的特异疗法的疗法)。

术语“预防”指的是防止或减缓一疾病或状态或减低所述疾病或状态的严重性的疗法。因此，如果某疗法可以治疗某表现一疾病的症状的受治疗者的所述疾病，则该种疗法也可以预防尚未患上一些或所有所述症状的受治疗者患上该疾病。

术语“抑制”指的是一活性、反应、状态、疾病或其他生物参数的减低。这个术语包括但不限于所述活性、反应、状态或疾病的完全根除。这个术语也可以包括(例如)所述活性、反应、状态或疾病比天然或对照水平减低10％。因此，所述减低可以是比所述天然或对照水平低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或它们之间的任何数量。

术语“肽”、“蛋白”及“多肽”在本文中可相互替代使用，指的是一包括两个或多个氨基酸(所述氨基酸由一个氨基酸的羧基键合到另一氨基酸的α-氨基)的天然或合成分子。

术语“融合蛋白”指的是通过在一个多肽的氨基末端与另一个多肽的羧基末端之间形成的肽键连接两个或多个多肽而形成的多肽。所述融合蛋白可以通过所述组分多肽的化学偶联来形成，或所述融合蛋白可以表达为一来自编码单一相邻融合蛋白的核酸序列的单一多肽。一单链融合蛋白为一带有一单一相邻多肽主链骨架的融合蛋白。融合蛋白可以通过使用分子生物学的传统技术将框架中的两个基因连接成为一单一核酸，然后在所述融合蛋白的生产条件下使所述核酸在一适当的宿主细胞中表达来制备。

术语“小分子”指的是一分子量少于2,000道尔顿(Daltons)或少于1,500道尔顿(Daltons)或少于1,000道尔顿(Daltons)的分子，比如一有机化合物或有机金属化合物。所述小分子可以是一亲水、疏水或两亲化合物。

本文中使用的“肽模拟物”一词的意思是肽的模拟物，包括标准肽化学的某些变更。肽模拟物典型地提高原肽的某些特性，比如提高稳定性、提高功效、提高输送、提高半衰期等等。基于已知的多肽序列制造肽模拟物的方法在(例如)美国5,631,280号专利、美国5,612,895号专利及美国5,579,250号专利中揭示。肽模拟物的使用可以涉及一非氨基酸残基与多个非酰胺键在一给定位置掺合。本发明的一个实施例为一肽模拟物，所述肽模拟物中的化合物的一键、一肽主链骨架或一氨基酸成分以一合适的模拟物替换。非天然氨基酸的一些非限定性例子(可以是合适的氨基酸模拟物)包括β-丙胺酸、L-α-氨基丁酸、L-γ-氨基丁酸、L-α-氨基异丁酸、L-ε-氨基己酸、7-氨基庚酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、Ν-ε-Boc-N-α-CBZ-L-赖氨酸、Ν-ε-Boc-N-α-Fmoc-L-赖氨酸、L-蛋氨酸砜、L-正亮氨酸、L-正缬氨酸、N-α-Boc-N-δCBZ-L-鸟氨酸、Ν-δ-Boc-N-α-CBZ-L-鸟氨酸、Boc-p-硝基-L-苯丙氨酸、Boc-羟脯氨酸以及Boc-L-硫代脯氨酸。

术语“抗体”指的是选择性地结合一目标抗原的天然或合成抗体。所述术语包括多克隆及单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子之外，也包括在术语“抗体”中的是那些免疫球蛋白分子的多个片段或多个聚合体，以及选择性地结合所述目标抗原的免疫球蛋白分子的人版本或人源化版本。

术语“变体”指的是一具有相对于野生型的一个或多个变形(比如一个或多个氨基酸残基的替换、插入、删除及/或切断)及它们的生物活性片段的肽(例如IQ基序)。在有些实施例中，一变体肽为在结构上或序列与SEQ ID NOS:1～8或其一对钙-钙调蛋白具有结合活性的片段中包含的一参考肽相关的肽，但所述肽具有一个或多个与参考肽相关的氨基酸替换。这样的变体可能是所述野生型肽的环化变体，而且可能包括天然或非天然氨基酸(例如氨基酸类似物)。

术语“特异性地结合”指的是一确定所述抗原或受体在一异质种群的蛋白及其他生物体中的存在的结合反应。一般上，一“特异性地结合”一第二分子(例如抗体)的第一分子(例如抗体)具有的相对于该第二分子的亲合常数(Ka)大于大约10⁵M^-1(例如10⁶M^-1、10⁷M^-1、10⁸M^-1、10⁹M^-1、10¹⁰M^-1、10¹¹M^-1以及10¹²M^-1或更高)。

II.组合物

本发明揭示在其所揭示的组合物及方法中使用的抑制p68核糖核酸(RNA)解旋酶与钙调蛋白(CaM)在一细胞中相互作用的多种药剂。在有些实施例中，所述药剂结合p68并阻滞p68结合到钙调蛋白(CaM)。在其他实施例中，所述药剂结合钙调蛋白(CaM)并阻滞p68结合到钙调蛋白(CaM)。

A.肽及肽模拟物

在有些实施例中，抑制p68与钙调蛋白(CaM)相互作用的药剂为一隔离肽或肽模拟物。关于某种肽的任何揭示应理解为包括揭示该种肽的肽模拟物。

在有些实施例中，所述肽为p68核糖核酸(RNA)解旋酶的一片段，该片段选择性地结合钙调蛋白(CaM)或其一保守性变体。这样的片段可以称为“CaM-结合片段”。在有些实施例中，这个p68肽含有p68的IQ基序，或其一能选择性地结合钙调蛋白(CaM)的保守性变体。

一般上，一选择性地结合一第二分子的第一分子(比如所揭示的多种肽)具有的相对于该第二分子的结合亲合力大于大约10⁵(例如10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹以及10¹²或更高)摩尔/升(M/l)。

如本文中所述，所揭示的多种肽具有多种不同长度及结构。在一些方面，每一种肽的长度为大约4至50个氨基酸之间，包括大约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。所述肽可以少于大约100个氨基酸残基，包括少于大约100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20个氨基酸残。所述肽的长度可能为大于大约8个氨基酸残基，包括大于大约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸残基。

在有些实施例中，所述CaM-结合肽的氨基酸序列为FVSAGIQTSF RTGNPTGTYQ(SEQ ID NO:8)、FVSAGIQTSF RTGNPTG(SEQ ID NO:7)、FVSAGIQTSFRTGNPTGAYG(SEQ ID NO:4)。在其他实施例中，所述CaM-结合肽是这个序列的结合钙调蛋白(CaM)的保守性变体。在有些实施例中，所述CaM-结合肽含有所述SEQ ID NO:4中的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。例如，与人p68(Accession No.NP_004387)的氨基酸566及568相比，所述SEQ ID NO:4含有一个在位置18的T至A替换及一个在位置20的Q至G替换。

为了提高效率，所揭示的隔离多肽可以是聚合体。例如，多抗原肽系统(MAPS)是基于许多肽抗原在其上锚定的径向分支赖氨酸枝的一小免疫惰性芯分子。结果是，一巨大分子的肽抗原-核心分子摩尔比率高，而且不需要进一步共轭至一载体蛋白。

因此，所述隔离多肽可能有两个或多个CaM-结合片段，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个片段。在一些方面，所述隔离多肽无支链，其中两个或多个片段在相同的线性多肽上。在其他方面，所述隔离多肽包括两个或多个氨基酸支链，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多氨基酸支链。因此，所述隔离多肽可能具有一带有2,3,4,5,6,7,8,9,10个或更多支链赖氨酸残基的肽基核心，其中两个或多个所述CaM-结合片段键合到两个或多个支链赖氨酸残基。此外，每个所述支链可能是单体或聚合体。

在一些方面，至少一个CaM-结合片段距离所述多肽的氨基末端少于大约0至大约20个氨基酸，包括距离所述氨基末端大约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。

所揭示的肽可能是人工序列，而且可能是在体外合成及/或重组地合成。所揭示的肽可能隔离自天然蛋白质。所述多种具有至少两个相邻序列的肽在天然蛋白质中不相邻。

1.细胞渗透肽

所揭示的组合物可以键合至一细胞渗透肽(亦称“蛋白转导域”)，以有效地进入所述细胞。

细胞渗透肽为短肽，它们促进多种分子载荷(例如其他肽)的细胞摄取。所述“载荷”一词通过经由共价键的化学键合或通过非共价相互作用与所述细胞渗透肽发生联系。细胞渗透肽的氨基酸组成成分一般含有高相对丰度的带正电荷的氨基酸，比如赖氨酸或精氨酸，或具有含有一交替式样的、极性/带电荷氨基酸及非极性疏水氨基酸的多个序列。这两种类型的结构依次称为聚阳离子型或两亲型。

细胞渗透肽有不同的大小、氨基酸序列及电荷，但所有细胞渗透肽具有一个明显特征，该特征是它们易位质膜及促进将多种分子载荷传送至细胞质或细胞器的能力。易位的机制可能涉及所述质膜中的直接渗透、内吞作用介导侵入或通过形成一过渡结构来易位。

细胞渗透肽的非限定例子包括聚精氨酸、触角足基因序列、HIV-1Tat及多种相关的肽、SynBl、SynB3、PTD-4、PTD-5、细胞穿透肽、Antp-3A(Antp突变体)、Buforin II、Transportan、MAP(原型两亲性肽)、K-FGF、Ku70、Prion、pVEC、Pep-1、SynBl、Pep-7、HN-1、BGSC(双-狐盐-亚精胺-胆固醇)以及BGTC(双-狐盐-三氨乙基胺-胆固醇)。

2.融合蛋白

在有些实施例中，多种所揭示的肽为融合蛋白。融合蛋白亦称嵌合蛋白，是通过连接两个或多个最初为不同蛋白编码的基因。这个融合基因的转译导致一具有得自每个初始蛋白的功能特性的单一多肽。也可以通过重组DNA技术来人工制造重组融合蛋白，以用于生物学研究或治疗。在一大规模突变(一般为一染色体易位)造成一含有来自两个不同基因的编码序列的部分的新编码序列时，嵌合突变体蛋白天然生成。

融合蛋白的功能成为可能是因为许多蛋白功能域模式化。换句话说，一多肽对应于一已知域(比如一酪氨酸激酶域)的线性部分可以在不损坏其固有酶能力的情况下，从所述蛋白的其他域去除。因此，本发明所揭示的任何功能域可以用于设计一融合蛋白。

重组融合蛋白为通过一融合基因的基因工程创造的蛋白。这典型地涉及将终止密码子从为第一蛋白编码的cDNA序列去除，然后通过结扎或重叠延伸聚合酶链式反应(PCR)，将第二蛋白的cDNA序列添加在框架中。该DNA序列将接着由一细胞表达为一单一蛋白。所述蛋白可以设计成包括两个初始蛋白的全序列或任一初始蛋白的一部分。

如果所述两个实体为蛋白，也经常添加接头(或“间隔区”)肽，这使得所述蛋白更可能独立地折叠并表现得像预期的那样。尤其是在所述接头使得可能进行蛋白提纯的情况下，蛋白或肽融合蛋白中的接头有时设计成带有用于蛋白酶或化学剂的分裂位点，这使得能够释放所述两个蛋白。这个技术经常用于通过融合一谷胱甘肽S转移酶(GST)蛋白、FLAG肽或一可以使用镍或钴树脂隔离(亲合色谱法)的六组氨酸肽(亦称6x组氨酸标记，6xhis-tag)来识别及提纯蛋白。嵌合蛋白也可以以毒素或与它们连结的抗体来制造，以研究疾病发展。

可选择地，内部核糖体进入位点(IRES)的元件可以用于创造多基因或多顺反子信息。IRES元件能够绕过依赖5'甲基化帽的转译的核糖体扫描模型，并开始在内部位点进行转译。来自小核糖核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎病毒及脑心肌炎病毒)的IRES元件以及一来自哺乳动物的信息的内部核糖体进入位点(IRES)已经被描述。IRES元件可以键合到异源开放阅读框。多个开放阅读框可以一起转录，每一开放阅读框由一个内部核糖体进入位点(IRES)隔离，以创造多顺反子信息。由于所述内部核糖体进入位点(IRES)，核糖体可进入每一开放阅读框，以供进行有效的转译。多个基因可以以一单一启动子/增强子有效地表达，以转录一单一信息。

B.抗体

在有些实施例中，抑制p68与钙调蛋白(CaM)的相互作用的是一抗体。可以用于本发明所揭示的多种组合物及方法的多种抗体包括任何类别的完整免疫球蛋白(即一完整的抗体)、其片段及至少含有一抗体的抗原结合可变域的合成蛋白。在多个抗体之中，所述可变域的序列不同，而且用于每一特定抗体相对于其特定抗原的键合及特异性。然而，所述可变性在抗体的整个可变域并非通常是均匀分布。所述可变性一般集中在三个称为“互补决定区”(CDRs)或超变区的片段，两种区都在轻链可变域及重链可变域中。所述可变域的较为高度保守部分称为框架(FR)。天然重链及轻链的可变域各包括四个框架(FR)区，这些框架区主要采用由三个互补决定区(CDRs)连接的β-片状结构，这形成多个环路，这些环路连接所述β-片状结构(在有些情况下形成所述β-片状结构的一部分)。每一域中的所述互补决定区(CDRs)由所述框架(FR)非常接近地连接在一起，而来自另一个域的互补决定区(CDRs)有助于形成抗体的抗原结合位点。因此，本发明所揭示的抗体至少含有对结合p68或钙调蛋白(CaM)及抑制p68与钙调蛋白(CaM)的相互作用有必要的互补决定区(CDRs)。

本发明也揭示具有生物活性的抗体的片段。不论是否结合到其他序列，所述片段包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、删除、替换或其他选定的变形，条件是所述片段与未修饰抗体或抗体片段相比，其活性并未显著地改变或削弱。

也可以采用技术来生产p68的CaM-结合域的特异性单链抗体。用于生产单链抗体的方法广为本领域中的技术人员所知。可以通过使用一短肽接头将重链及轻链的可变域融合来创造一单链抗体，从而在一单分子上重新构成一抗原结合位点。多种单链抗体可变区片段(scFvs)已经在不会显著地破坏抗原结合或所述结合的特异性的情况下开发，在所述多种单链抗体可变区片段(scFvs)中，一个可变域的C-末端经由一个15至25氨基酸肽或接头栓系到另一个可变域的N-末端。选择所述接头是为了允许所述重链及轻链在它们的适当构象取向中结合在一起。

可以通过连接两个单链抗体可变区片段(scFvs)来设计多个二价单链可变区片段(di-scFvs)。这可以通过产生一带有两个VH区及两个VL区的、可获得串列单链抗体可变区片段(scFvs)的单肽来完成。单链抗体可变区片段(scFvs)也可以以所述两个可变区折叠在一起太短的接头肽(长度大约为五个氨基酸)来设计，迫使单链抗体可变区片段(scFvs)二聚化。这个类别称为二价抗体。已经证实二价抗体的分离常数比相应的单链抗体可变区片段(scFvs)低40倍，意思是它们对它们的目标有较高的亲合力。更短的接头(长度为一个或两个氨基酸)导致三聚体(三链抗体或三价抗体)形成。四价抗体也已经生产。它们对它们的目标的亲合力比二价抗体来得较高。

一单克隆抗体可以从一充分同质种群的抗体(即所述种群中的单一抗体相同，除了于所述抗体分子的小子集中可能存在的可能天然突变之外)中取得。单克隆抗体包括“嵌合”抗体(其中所述重链及/或轻链的一部分相同于或类似于源自一特定物种或属于一特定抗体类别或子类别的抗体中的相应序列，而其余的链相同于或类似于源自另一物种或属于另一抗体类别或子类别的抗体中的相应序列)以及这样的嵌合抗体的片段，只要它们表现所期望的对抗活性。

单克隆抗体可以使用任何产生单克隆抗体的程序来制造。在一杂种细胞方法中，一小鼠或其他合适的宿主动物一般以一免疫剂来免疫，以引出生产或有能力生产将会特异性地结合到所述免疫剂的抗体的淋巴细胞。可选择地，所述淋巴细胞可以在体外免疫。

抗体也可以通过重组DNA方法制造。可以通过使用传统程序(例如通过使用能够特异性地结合到编码鼠科抗体的所述重链及轻链的基因的寡核苷酸探针)，轻易地对编码所揭示的抗体的DNA进行隔离及编序。也可以使用噬菌体表面显示技术来产生及筛选多个文库的抗体或活性抗体片段。

人抗体及人源化抗体

许多非人抗体(例如那些源自小鼠、大鼠或兔子者)在人身上天然抗原，因此可能在施用于人时引起不良的免疫反应。因此，在所述方法中使用人抗体及人源化抗体是为了降低抗体施用于人时引起不良的免疫反应的机会。

可以使用在接受免疫时有能力在不存在内源性免疫球蛋白的生产的情况下产生一完整系列的人抗体的转基因动物(例如小鼠)。例如，嵌合及生殖细胞系突变体小鼠身上的抗体重链连接区(J(H))基因的同合型缺失导致抑制内源性抗体的产生。转移这样的生殖细胞系突变体小鼠身上的人生殖细胞系免疫球蛋白基因微阵列，将导致在抗原激发时产生人抗体。

可选择地，所述抗体在其他物种中产生并“人源化”，以施用于人。非人(鼠科)抗体的人源化形式为嵌合免疫球蛋白、含有源自非人免疫球蛋白的小序列的免疫球蛋白链或其片段(比如Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂)、或其他抗原-结合子序列的抗体)。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中源自所述受体抗体的一互补决定区(CDR)的残基由源自具有期望的特异性、亲合力及能力的一非人物种(比如小鼠、大鼠或兔子)的一互补决定区(CDR)的残基(供体抗体)替换。在有些例子中，所述人免疫球蛋白的Fv框架残基由相应的非人残基替换。人源化抗体也可能含有在所述受体抗体或在所述引入互补决定区(CDR)或框架序列中都找不到的残基。一般上，所述人源化抗体将含有基本上全部的、至少一个可变域及一般为两个可变域，其中所有或基本上所有所述互补决定区(CDRs)相应于一非人免疫球蛋白的那些互补决定区，而且全部或基本上全部框架(FR)区域是一人人免疫球蛋白共有序列的那些框架(FR)区域。所述人源化抗体最理想地也将含有至少一免疫球蛋白恒定区域(Fc)的一部分，一般上是一人免疫球蛋白的恒定区的一部分。

用于人源化非人抗体的方法在本领域中广为人知。一般上，一人源化抗体具有从一非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常被称为“引入”残基，这些残基一般取自一“引入”可变域。抗体人源化技术一般涉及使用重组DNA技术来处理编码一抗体的一个或多个多肽链的DNA序列。人源化实质上可以通过用啮齿动物的互补决定区(CDRs)或互补决定区(CDR)序列替换一人抗体的相应序列。因此，一非人抗体(或其一片段)的人源化形式是一嵌合抗体或片段，其中基本上少于一完整人可变域已经由来自一非人物种的相应序列替换。在实践中，人源化抗体典型地是其中有些互补决定区(CDR)残基以及(可能)一些框架(FR)残基由来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基替换的人抗体。

为了减低抗原性，用于制成所述人源化抗体的人可变域(包括轻链及重链)的选择非常重要。根据“最佳适合”方法，一啮齿动物抗体的可变域的序列对整个文库的已知人可变域序列进行筛查。然后，最接近所述啮齿动物的可变域序列的人可变域序列被接受为所述人源化抗体的人框架(FR)。另一方法使用源自轻链或重链的一特定子群的所有人抗体的共有序列的一特定框架。相同的框架可以用于几个不同的人源化抗体。

人源化抗体可以通过使用亲代序列及人源化序列的三维模型来对亲代序列及多种人源化产物进行分析的程序制备。三维免疫球蛋白模型为本领域的技术人员常有及熟悉。可使用图解及显示选定的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。对这些显示进行检查使得能够对候选免疫球蛋白序列的功能中的残基的可能角色进行分析，即对影响所述候选免疫球蛋白序列结合其抗原的能力的残基进行的分析。照这样，可以从所述共有序列及引入序列选择及结合框架(FR)残基，以实现所期望的抗体特性，比如增加对目标抗原的亲合力。一般上，所述互补决定区(CDR)残基直接地及最充分地涉及影响抗体结合。

所述抗体可以结合到一培养基或以一可测定等分标记，或两者结合并标记。预期可用于本发明所述的组合物的可测定等分包括荧光标记、酶促标记及放射性标记。

单链抗体

通过使用一短肽接头将所述重链及轻链的可变域融合在一起，创造一单链抗体，从而在一单分子上重新构成一抗原结合位点。多种单链抗体可变区片段(scFvs)已经在不会显著地破坏抗原结合或所述结合的特异性的情况下开发，在所述多种单链抗体可变区片段(scFvs)中，一个可变域的C-末端经由一个15至25氨基酸肽或接头栓系到另一个可变域的N-末端。选择所述接头是为了允许所述重链及轻链在它们的适当构象取向中结合在一起。这些Fvs缺乏所述天然抗体的重链及轻链中存在的恒定区(Fc)。

单价抗体

体外方法也适合用于制备单价抗体。可以使用常规技术来实现抗体的消化，以产生抗体片段，尤其是Fab片段。例如，可以使用木瓜蛋白酶来执行消化。抗体的木瓜蛋白酶消化典型地产生两个相同的抗原结合片段，所述片段称为Fab片段，每一片段有一单抗原结合位点及一残基Fc片段。胃蛋白酶治疗产生一片段，其称为F(ab')₂片段，该片段有两个抗原结合位点而且还能够交联抗原。

在抗体消化中产生的Fab片段也含有所述轻链的恒定域及所述重链的第一恒定域。Fab'片段与Fab片段的不同，是由于在所述重链域的羧基末端添加少许残基，包括一个或多个源自抗体铰链区的半胱氨酸。所述F(ab')₂片段是二价片段，其包括由一在所述铰链区的二硫桥键连接的两个Fab'片段。Fab'-SH在本文中是用于其中所述恒定域的半胱氨酸残基载有一自由巯基的Fab'片段的名称。最初产生的抗体片段是成对的Fab'片段，所述成对的Fab'片段之间有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学耦合亦为已知。

杂交抗体

本发明所揭示的抗体可能为一杂交抗体。在杂交抗体中，一个重链及轻链对与在一个抗原表位的抗体中找到的重链及轻链对同源，而另一重链及轻链对则与在另一抗原表位的抗体中找到的重链及轻链对同源。这导致多功能强度的特性，即同时结合至少两个不同的抗原表位的能力。这样的杂种可以通过产生各自的成分抗体的杂交瘤的融合来形成，或通过重组技术形成。当然这样的杂种也可以使用嵌合链来形成。

抗体片段的结合物及融合物

可以通过将所述抗体或其一片段与一治疗剂耦合，将所述抗体的靶向功能用于治疗。所述抗体或片段(例如一免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分)与所述治疗剂的这样的耦合，可以通过制作一免疫结合物或通过制作一包括所述抗体或抗体片段及所述治疗剂的融合蛋白来实现。

C.药用组合物

本发明揭示多种含有有效治疗量的一种或多种所揭示的抑制p68结合到钙调蛋白(CaM)的治疗剂及一药学上可接受的载体的药用组合物。适合用于施用本发明中提供的化合物的药物载体包括本领域的技术人员已知的任何适合用于特定给药方式的载体。

所述药用化合物可以制备成合适的药物制剂，比如用于口服给药的溶液、悬浮液、药片、分散药片、药丸、胶囊、粉末、缓释制剂或酏剂，或供用于肠胃外给药的无菌溶液或悬浮液，以及透皮贴剂及干粉吸入剂。

在有些实施例中，所述组合物制备供单剂量给药。为了制备一组合物，使质量分数数量的化合物在一选定的有效浓度的载体中溶解、悬浮、分散或混合，使得所治疗的疾病状态获得减轻或更多症状获得改善。

活性药剂包括在所述药学上可接受的载体中，其数量足以在没有对所治疗的患者造成不良的副作用的情况下发挥有用治疗效果。所述有效治疗浓度可以通过在体外系统、活体外系统及活体内系统中对所述化合物进行测试来确定，然后从所述系统外推，供用于人用剂量。

所述药用组合物中的活性化合物的浓度将取决于所述活性化合物的吸收率、失活率及排泄率、所述化合物的物理化学特性、剂量日程表、给药数量以及本领域的技术人员已知的其他因素。

药物制备成提供多种单位剂型，包括大约0.01mg、0.1mg或1mg至大约500mg、1000mg或2000mg，而且在一个实施例中，药物制备成每单位剂型含大约10mg至大约500mg的活性成分或主要成分组合。

在所述组合物展现溶解度不足的情况下，可以使用多种用于增溶化合物的方法。这些方法包括但不限于使用助溶剂(比如二甲亚砜(DMSO))、使用表面活性剂(比如)、或溶解在碳酸氢钠水溶液中。

液状的药学上可给药组合物可以(例如)通过以下方法来制备：在一载体中(例如在水、盐水、右旋糖水溶液、甘油、乙二醇类、乙醇及类似物中)溶解、分散或混合一以上说明的活性组合物或自选药用辅料，从而形成一溶液或悬浮液。如果需要，将施用的药用组合物也可以含有少量的无毒辅助物质，比如润湿剂、乳化剂、增溶剂、pH缓冲剂及类似物，例如乙酸酯、柠檬酸钠、环糊精衍生物类、山梨醇酐单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯及其他这样的药用辅料。

可以制备含有0.005％至100％范围的活性成分而其余成分由无毒载体补足的剂型或组合物。所预期制备的组合物可以含有0.001％至100％的活性成分，或(在一个实施例中)含有0.1％至95％的活性成。

D.组配物

多种抗癌(抗肿瘤)药物可用于与本发明的方法及组合物组配。抗肿瘤药物包括阿西维辛(Acivicin)、阿柔比星(Aclarubicin)、盐酸阿可达佐(Acodazole Hydrochloride)、阿克罗宁(AcrQnine)、阿多来新(Adozelesin)、阿地白介素(Aldesleukin)、六甲嘧胺(Altretamine)、安波霉素(Ambomycin)、乙酸阿美蒽醌(Ametantrone Acetate)、氨苯哌酮(Aminoglutethimide)、安吖啶(Amsacrine)、阿那曲唑(Anastrozole)、安曲霉素(Anthramycin)、门冬酰胺酶(Asparaginase)、曲林菌素(Asperlin)、阿扎胞苷(Azacitidine)、阿扎替派(Azetepa)、阿佐霉素(Azotomycin)、巴马司他(Batimastat)、苯佐替派(Benzodepa)、比卡鲁胺(Bicalutamide)、比生群二盐酸盐(Bisantrene Hydrochloride)、二甲磺酸双奈法德(Bisnafide Dimesylate)、比折来新(Bizelesin)、硫酸博来霉素(Bleomycin Sulfate)、布喹那钠(Brequinar Sodium)、溴匹立明(Bropirimine)、甲磺酸丁二醇二酯(Busulfan)、放线菌素C(Cactinomycin)、卡芦睾酮(Calusterone)、卡醋胺(Caracemide)、卡贝替姆(Carbetimer)、卡铂(Carboplatin)、卡莫司汀(Carmustine)、盐酸卡柔比星(Carubicin Hydrochloride)、卡折来新(Carzelesin)、西地芬戈(Cedefingol)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、西罗霉素(Cirolemycin)、顺-二氯二氨合铂(Cisplatin)、克拉屈滨(Cladribine)、酒石酸阿利马嗪(Crisnatol Mesylate)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、阿糖胞苷(Cytarabine)、氮烯唑胺(Dacarbazine)、放线菌素D(Dactinomycin)、盐酸柔红霉素(Daunorubicin Hydrochloride)、地西他滨(Decitabine)、右奥马铂(Dexormaplatin)、地扎呱宁(Dezaguanine)、甲磺酸地扎呱宁(Dezaguanine Mesylate)、亚胺醌(Diaziquone)、多西他赛(Docetaxel)、阿得里亚霉素(Doxorubicin)、盐酸阿霉素(Doxorubicin Hydrochloride)、屈洛昔芬(Droloxifene)、柠檬酸屈洛昔芬(Droloxifene Citrate)、屈他雄酮丙酸酯(Dromostanolone Propionate)、达佐霉素(Duazomycin)、依达曲沙(Edatrexate)、盐酸依氟鸟氨酸(Eflomithine Hydrochloride)、依沙芦星(Elsamitrucin)、恩洛铂(Enloplatin)、恩普氨酯(Enpromate)、依匹哌啶(Epipropidine)、盐酸表柔比星(Epirubicin Hydrochloride)、厄布洛唑(Erbulozole)、盐酸依索比星(Esorubicin Hydrochloride)、雌莫司汀(Estramustine)、雌莫司汀磷酸钠(Estramustine Phosphate Sodium)、依他硝唑(Etanidazole)、乙碘油I 131(Ethiodized Oil I 131)、依托泊苷(Etoposide)、依托泊苷磷酸酯(Etoposide Phosphate)、氯苯乙嘧胺(Etoprine)、盐酸法屈唑(Fadrozole Hydrochloride)、法扎拉滨(Fazarabine)、芬维A胺(Fenretinide)、氟尿苷(Floxuridine)、磷酸氟达拉滨(Fludarabine Phosphate)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、氟西他滨(Flurocitabine)、磷喹酮(Fosquidone)、福司曲星钠(Fostriecin Sodium)、吉西他滨(Gemcitabine)、盐酸吉西他滨(Gemcitabine Hydrochloride)、胶体金Au 198(Gold Au 198)、羟基脲(Hydroxyurea)、盐酸伊达比星(Idarubicin Hydrochloride)、异环磷酰胺(Ifosfamide)、伊莫福新(Ilmofosine)、干扰素α-2a(Interferon Alfa-2a)、干扰素α-2b(Interferon Alfa-2b)、干扰素α-nl(Interferon Alfa-nl)、干扰素α-n3(Interferon Alfa-n3)、干扰素β-1a(Interferon Beta-1a)、干扰素γ-lb(Interferon Gamma-lb)、异丙铂(Iproplatin)、盐酸依立替康(Irinotecan Hydrochloride)、乙酸兰瑞肽(Lanreotide Acetate)、来曲唑(Letrozole)、乙酸亮丙瑞林(Leuprolide Acetate)、盐酸利阿唑(Liarozole Hydrochloride)、洛美曲索钠(Lometrexol Sodium)、罗莫司丁(Lomustine)、盐酸洛索蒽醌(Losoxantrone Hydrochloride)、马索丙考(Masoprocol)、美登素(Maytansine)、盐酸氮芥(Mechlorethamine Hydrochloride)、乙酸甲地孕酮(Megestrol Acetate)、乙酸美仑孕酮(Melengestrol Acetate)、美法仑(Melphalan)、美诺立尔(Menogaril)、巯基嘌呤(Mercaptopurine)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、甲氨蝶呤钠(Methotrexate Sodium)、氯苯氨啶(Metoprine)、美乌替派(Meturedepa)、米丁度胺(Mitindomide)、米托克星(Mitocarcin)、丝裂红素(Mitocromin)、丝裂吉菌素(Mitogillin)、丝裂马菌素(Mitomalcin)、丝裂霉素(Mitomycin)、丝裂帕菌素(Mitosper)、米托坦(Mitotane)、盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone Hydrochloride)、霉酚酸(Mycophenolic Acid)、诺考达唑(Nocodazole)、诺加霉素(Nogalamycin)、奥马铂(Ormaplatin)、亚磺酰吡啶(Oxisuran)、多西紫杉醇(Paclitaxel)、培门冬酶(Pegaspargase)、佩里霉素(Peliomycin)、戊氮芥(Pentamustine)、硫酸培洛霉素(Peplomycin Sulfate)、过磷酰胺(Perfosfamide)、哌泊溴烷(Pipobroman)、丙酰哌嗪二甲烷磺酸酯(Piposulfan)、盐酸咯克森特仑(Piroxantrone Hydrochloride)、光神霉素(Plicamycin)、普洛美坦(Plomestane)、卟吩姆钠(Porfimer Sodium)、泊非罗霉素(Porfiromycin)、泼尼莫司汀(Prednimustine)、盐酸甲基苄肼(Procarbazine Hydrochloride)、嘌呤霉素(Puromycin)、嘌呤霉素盐酸盐(Puromycin Hydrochloride)、吡唑呋喃菌素(Pyrazofurin)、异戊烯腺苷(Riboprine)、罗格替胺(Rogletimide)、沙芬戈(Safingol)、盐酸沙芬戈(Safingol Hydrochloride)、雌莫司汀(Semustine)、辛曲秦(Simtrazene)、磷酸乙酰天冬氨酸钠(Sparfosate Sodium)、稀疏霉素(Sparsomycin)、盐酸螺旋锗(Spirogermanium Hydrochloride)、螺莫司汀(Spiromustine)、螺铂(Spiroplatin)、链黑菌素(Streptonigrin)、链脲霉素(Streptozocin)、氯化锶Sr 89(Strontium Chloride Sr 89)、磺氯苯脲(Sulofenur)、他利霉索(Talisomycin)、紫杉烷(Taxane)、紫杉化合物(Taxoid)、替可加兰钠(Tecogalan Sodium)、替加氟(Tegafur)、盐酸替洛蒽醌(Teloxantrone Hydrochloride)、替莫泊芬(Temoporfm)、替尼泊苷(Teniposide)、替罗昔隆(Teroxirone)、睾内酯(Testolactone)、硫唑嘌呤胺(Thiamiprine)、硫鸟嘌呤(Thioguanine)、三胺硫磷(Thiotepa)、噻唑呋林(Tiazofurin)、替拉扎明(Tirapazamine)、盐酸拓扑替康(Topotecan Hydrochloride)、枸橼酸托瑞米芬(Toremifene Citrate)、乙酸曲托龙(Trestolone Acetate)、磷酸曲西瑞宾(Triciribine Phosphate)、三甲曲沙(Trimetrexate)、葡萄糖醛酸三甲曲沙(Trimetrexate Glucuronate)、曲普瑞林(Triptorelin)、盐酸妥布氯唑(Tubulozole Hydrochloride)、尿嘧啶氮芥(Uracil Mustard)、尿烷亚胺(Uredepa)、伐普肽(Vapreotide)、维替泊芬(Verteporfm)、硫酸长春碱(Vinblastine Sulfate)、硫酸醛基长春碱(Vincristine Sulfate)、长春地辛(Vindesine)、硫酸长春地辛(Vindesine Sulfate)、硫酸长春匹定(Vinepidine Sulfate)、硫酸长春甘酯(Vinglycinate Sulfate)、硫酸环氧长春碱(Vinleurosine Sulfate)、酒石酸长春瑞滨(Vinorelbine Tartrate)、硫酸长春罗定(Vinrosidine Sulfate)、硫酸利定(Vinzolidine Sulfate)、伏氯唑(Vorozole)、折尼铂(Zeniplatin)、净司他丁(Zinostatin)、盐酸佐柔比星(Zorubicin Hydrochloride)。

III.方法

A.治疗癌症

本发明揭示涉及多种对一需要给药的受治疗者施用一能抑制p68与钙调蛋白(CaM)相互作用的组合物来治疗一受治疗者身上的癌症的方法。具体地说，本发明所揭示的方法抑制癌症转移。

本发明所揭示的方法中的癌症可以是一经历无调节增生、侵袭及/或转移的受治疗者身上的任何细胞。在一些方面，所述癌症可以是任何正在接受放射治疗的任何赘生物或肿瘤。可选择地，所述癌症可以是在使用标准方法进行治疗时对放射治疗不够敏感的一赘生物或肿瘤。

所述癌症可以是一肉瘤、恶性淋巴瘤、白血病、癌、胚细胞瘤或生殖细胞肿瘤。可以使用本发明所揭示的组合物治疗的一具代表性但非限定性的癌症清单包括白血病、B细胞恶性淋巴瘤、T细胞恶性淋巴瘤、蕈样肉芽肿病、霍奇金病、骨髓白血病、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头部及颈部癌、头部及颈部的鳞状细胞癌、肾癌、肺癌类(比如小细胞肺癌及非小细胞肺癌)、成神经细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、肝癌、鳞状细胞癌(口部、喉部、喉门、喉及肺的鳞状细胞癌)、结肠癌、子宫颈癌、子宫颈癌、乳癌、上皮癌、肾癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食道癌、头部及颈部癌、大肠癌、造血系统癌、睾丸癌、结肠及直肠癌、前列腺癌及胰腺癌。

B.治疗炎症

本发明揭示多种抑制炎症及/或治疗一受治疗者身上的炎症的方法。这些方法涉及对一需要给药的受治疗者施用一能抑制p68与钙调蛋白(CaM)相互作用的组合物。

所述炎症可以是变应性紊乱、哮喘、儿童哮鸣、慢性阻塞性肺部疾病、肺支气管发育不良、囊肿性纤维化病、间质性肺病(例如结节病、肺纤维化病、硬皮肺病及普通型间质性肺炎)、耳鼻喉疾病(例如鼻炎、鼻息肉及中耳炎)、眼部疾病(例如结膜炎及巨乳头性结膜炎)、皮肤疾病(例如银屑病、皮炎及湿疹)、风湿性疾病(例如类风湿性关节炎、关节病、关节病性关节炎、骨关节炎、系统性红斑狼疮、系统性硬化症)、脉管炎疾病(例如亨-舍紫癜、吕弗勒氏综合症及川崎病)、心血管疾病(例如动脉粥样硬化)、肠胃疾病(例如肠胃系统中的嗜伊红细胞疾病、炎性肠病、肠易激综合症、大肠炎、腹腔及胃出血)、泌尿系统疾病(例如血管球性肾炎、间质性膀胱炎、肾炎、肾病、肾病综合症、肝肾综合症及中毒性肾损害)、中枢神经系统疾病(例如脑缺血、脊髓损伤、偏头痛、多发性硬化及睡眠呼吸紊乱)、内分泌腺体疾病(例如自身免疫性甲状腺疾病、糖尿病相关炎症)、风疹、过敏反应、血管性水肿、夸休可尔症的水肿、痛经、烧伤引起的氧化损伤、多发性创伤、疼痛、中毒性油综合症、内毒素休克、脓毒症、细菌感染症(例如源自幽门螺杆菌、铜绿假单胞菌或痢疾志贺菌的感染症)、霉菌感染症(例如外阴阴道假丝酵母菌病)、病毒感染症(例如肝炎、脑膜炎、副流行性感冒及呼吸道合胞病毒感染)、美镰状细胞血症、嗜伊红细胞过多综合症以及恶性肿瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤、白血病(例如嗜伊红细胞白血病及慢性骨髓性白血病)、肥大细胞增多症、真性红细胞增多症及卵巢癌)。具体地说，本发明的化合物可能对治疗以下疾病有用：变应性紊乱、哮喘、鼻炎、结膜炎、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、囊肿性纤维化病、皮炎、风疹、嗜伊红细胞肠胃疾病、炎症性肠病、类风湿性关节炎、骨关节炎及疼痛。

C.给药

视是否需要局部或全身治疗或视需治疗的部位而定，本文中揭示的组合物(包括药用组合物)可以以许多方式给药。例如，本文中所揭示的组合物可以通过静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、腔内或经皮的方式给药。所述组合物可以通过口服、肠胃外(例如静脉内)、肌肉内注射、腹膜内注射、经皮、体外、眼部、阴道、直肠、鼻内、局部或类似方式给药，包括局部鼻内给药或通过吸入剂给药。

所述组合物的肠胃外给药(如果使用肠胃外给药)方式一般是通过注射。注射药剂可以以传统剂型制备，其可能是液体溶液或悬浮液、适合在注射之前溶解液体中的悬浮液的固体剂型、或乳化剂。肠胃外给药的一个经修改的方式涉及慢释或缓释体系，使得能够维持一个恒定的剂量。

本文中揭示的组合物可以预防性地对患者或有罹患癌症风险的受治疗者给药。因此，所述方法可以进一步涉及在施用本文中揭示的组合物之前识别有罹患癌症风险的受治疗者。

所述组合物的精确需要数量将因不同受治疗者而有不同，取精确数量取决于受治疗者所属物种、其年龄、体重及整体状态、正在治疗的变应性紊乱、所使用的特定核酸或载体、给药方式等等。因此，不可能为每一组合物指定一精确的数量。然而，在已知本文中的教导的情况下，本领域中的技术人员当能够仅使用常规实验来确定一适当数量。例如，可以根据经验确定用于施加所述组合物的有效剂量及日程表，而进行这样的确定在本领域的技术范围之内。所述组合物的给药剂量范围大得足以对症状产生预期的效果。所述剂量不应大到导致副作用，比如有害的交叉反应、过敏反应等等。一般上，所述剂量将随患者的年龄、状态、性别及疾病的程度、给药途径或方案是否包括其他药物而变化，而且可以由本领域中的技术人员确定。如果发生任何禁忌，所述剂量可以由个别医生调整。剂量可以改变，而且可以每日一个或多个剂量给药，为时一日或数日。可以在关于已知种类的药物产品的适当剂量文献中获得关于给药剂量的指导。

D.筛选方法

本发明揭示识别可以用于治疗癌症或炎症的药剂的多种方法。所述方法可能涉及在允许p68与钙调蛋白(CaM)肽结合的情况下提供一含有p68肽及钙调蛋白(CaM)肽的试样，使所述试样接触一候选药剂，测定所述p68肽与所述钙调蛋白(CaM)肽的结合水平，以及对所述结合水平与一对照试样进行比较。在这个方法中，与所述对照试样相比，p68/钙调蛋白(CaM)结合的减少可以识别一可以用于治疗癌症的药剂。

p68与钙调蛋白(CaM)的结合可以使用常规方法来测定，比如不扰乱蛋白结合的免疫测定方法。所述方法可以是基于细胞或无细胞的测定。在其最简单及直接的意义上而言，免疫测定是涉及抗体与抗原之间的结合的结合测定。许多种类及格式的免疫测定广为人知，而且可用于测定本发明所揭示的生物标记。免疫测定的例子是酶联免疫吸附测定(ELISAs)、放射免疫测定(RIA)、放射免疫沉淀测定(RIPA)、免疫珠俘获测定、韦斯顿印迹分析、斑点印迹分析、凝胶迁移测定、流式细胞术、蛋白阵列、多微珠阵列测定、磁俘获、活体成像、荧光共振能量转移(FRET)以及光漂白后荧光恢复(FRAP)/光漂白后荧光定位(FLAP)。

p68与钙调蛋白(CaM)的结合可以使用荧光激活细胞分选术(FACS)测定。例如，本发明揭示以融合到荧光蛋白的p68及钙调蛋白(CaM)转染的多个细胞系。这些细胞系可以促成对已生物表达者进行高通量筛选及促成小分子以它们的生理形式结合到p68及钙调蛋白(CaM)。

一般上，可以从天然产品或合成(或半合成)提取物的大文库或化学品文库识别候选药剂。因此，实质上任何数目的化学提取物或化合物可以使用本文中描述的模范方法筛选。这样的提取物或化合物包括但不限于植物提取物、真菌提取物、原核提取物或动物提取物、发酵液、合成化合物以及现有化合物的变形。许多方法也可以用于产生任何数目的化学化合物(包括但不限于糖类化合物、油脂化合物、肽化合物及核酸化合物)的随机或定向合成(例如半合成或全合成)。合成化合物文库可从市场上获得，例如从化学品文库的承办商获得，这些化学品文库包括但不限于ChemBridge Corporation(美国加利福尼州圣迭戈市)、ChemDiv(美国加利福尼州圣迭戈市)、Life Chemicals(康奈提格州橙市)及Maybridge(英国康沃尔郡)。

可选择地，多个文库的细菌、霉菌、植物或动物提取物形式的天然化合物可从市场上从许多来源获得，这些来源包括02H(英国剑桥市)、MerLion Pharmaceuticals Pte Ltd(新加坡科学园II，新加坡117528邮区)及Galapagos NV(比利时梅赫伦市)。

此外，天然及合成产生的提取物文库可以(例如)通过标准萃取及分馏方法或通过标准合成方法结合固相有机合成、微波法合成及其他可能够制造大量供筛选的化合物的快速吞吐量方法来生产。此外，如果需要，可以使用标准的化学、物理或生物化学方法来容易地修饰或调整任何提取物文库或化合物(包括样品类型及样品溶解)。

当发现一粗提取物具有期望的活性时，有必要进一步分馏阳性引导性提取物，以隔离造成所观察到作用的化学成分。本文中描述的用于测定化合物的混合物中的活性的相同的方法可以用于提纯所述活性成分及测试其衍生物。这样的异源提取物的分馏及提纯方法在本领域中广为人知。如果需要，可对被证明是对治疗有用的药剂的化合物进行化学修饰。被识别为具有治疗价值的化合物随后可以使用疾病或状态的体外细胞模型及动物模型(比如本文中所揭示者)进行分析。

候选药剂包括多种化学物质种类，但经常是有机分子，例如分子量大于100道尔顿(Daltons)及小于大约2,500道尔顿(Daltons)的小有机化合物。候选药剂可以包括对与蛋白发生相互作用(尤其是氢键合)有必要的功能基团，而且一般包括至少一个胺基团、羰基团、羟基团或羧基团，例如包括至少两个所述功能化学基团。所述候选药剂通常含有周期碳或异环结构及/或以一个或多个上述功能基团代换的芳结构或多芳结构。

在有些实施例中，所述候选药剂是蛋白。在一些方面，所述候选药剂是天然蛋白或天然蛋白的片段。因此，可以使用(例如)含有蛋白或蛋白细胞提取物的随机或定向消化液的细胞提取物。照这样，可以制造多个文库的原核及真核蛋白，以使用本文中的方法进行筛查。所述文库可以是细菌蛋白、霉菌蛋白、病毒蛋白、真核蛋白及人蛋白。

实施例

实施例1：p68的肽片段(氨基酸549-568)抑制癌症转移

材料及方法

反应物、细胞系、抗体及克隆：

所述血凝素(HA)肽由AnaSpec合成。编码血凝素-标记p68(“HA-tagged p68”)的DNA序列被克隆到pHM6载体内。细胞系SW480/SW620购买自ATCC并遵照供应商的说明培养。抗p68的多克隆(Pabp68)及单克隆(P68-RGG)抗体与先前报告(Yang et al.,2005年)的相同。血凝素-标记(HA-tag)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、核纤层蛋白A/C(Lamin A/C)、钙调蛋白(CaM)、α-微管蛋白(α-tubulin)、β-微管蛋白(β-tubulin)、驱动蛋白-1(kinesin-1)的重链、动力蛋白中间链1(Dynein intermediate 1)及β-肌动蛋白(β-actin)抗体分别购买自Cell Signaling、Abnova、SantaCruz、Abeam及AnaSpec。

源自细胞提取物的血凝素-标记蛋白的免疫提纯：通过瞬时转染表达血凝素-标记(HA-tagged)蛋白的SW480细胞在带有10％FBS的L-15培养基中培养。所述细胞经历不同处理(比如划痕创伤)。收集所述细胞并在添加有所述蛋白酶的NETS缓冲剂中细胞溶解。为了减少非特异性的蛋白-蛋白相互作用在所述免疫提纯中发生，600mM(最终浓度)的6-氨基己酸(6-AcA)连同800mM(最终浓度)的氯化钠(NaCl)被添加到所述提取物，并在室温条件下温育2小时。将一可从市场上获得的多克隆抗血凝素抗体添加到所制备的提取物(500μl提取物/20μl的Abs)。所述混合物在4℃的温度条件下温育过夜。在温育之后，将蛋白G琼脂糖微珠(50μl，以3mg/ml的BSA预处理)添加到所述混合物中，然后再温育2小时。将所述蛋白G琼脂糖微珠置于NETS缓冲剂中清洗6次。将所述微珠结合蛋白直接用于一些测定(比如三磷酸腺苷酶测定)，或使用所述血凝素肽来洗提所述结合血凝素-标记蛋白。所述带有结合蛋白的微珠在洗提缓冲剂中悬浮，然后装在一小圆柱形容器中。将所述血凝素肽(σ)(500μg/ml洗提缓冲剂)流经所述圆柱形容器，以洗提所述微珠结合蛋白。收集分馏物并通过“十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳”(SDS-PAGE)及免疫印迹进行分析，以识别含有血凝素-标记蛋白的分馏物。进一步将所洗提的蛋白放在随后的试验缓冲剂中透析(比如放在结合缓冲剂中透析)，然后通过离心法浓缩。

SW620肿瘤的异种移植物及正位4T1肿瘤的转移抑制：所有动物实验根据美国乔治亚州立大学(Georgia State University)的“实验动物护理及使用委员会”(Institutional Animal Care and Use Committee,IACUC)的指南进行。以5x 10⁶SW620细胞或2x 10⁶4T1细胞对裸鼠或Balb/c小鼠(6至7周，Harlan Laboratory供应)进行皮下注射或正位注射。按适当的时间间隔，通过腹膜内注射对所述荷瘤小鼠施用适当剂量的肽。每2日对肿瘤形成及体积进行估定。在4周的时间过程中，根据公式4p/3x(宽度/2)²x(长度/2)，以肿瘤的两个互相垂直的直径来测量肿瘤体积。在所述实验结束时对所述肿瘤及器官进行收集及称重。从所采集的肿瘤及器官制备组织切片。通过苏木精-伊红染色(H&E)或免疫染色对组织切片进行分析。为了对SW620肿瘤进行转移分析，从脾脏制备组织提取物，从所述组织提取物提取总核糖核酸(total RNAs)。以隔离的核糖核酸(RNAs)执行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCRs)。为了测定4T-1细胞的转移，对肺脏及肝脏进行了检查。

结果

对含有Y593氨基酸的一p68肽片段(通过与Y593磷酸化p68竞争)抑制上皮细胞间质转型(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)的能力进行实验，这是由于抑制上皮细胞间质转型(EMT)显示该p68肽片段对干涉转移有用处。合成了三种肽。最前两种肽含有分别带有Y593磷酸化(“PepPhoY593”)及不带Y593磷酸化(“PepY593”)的p68的氨基酸584至602。第三种肽含有p68的氨基酸549至568，p68的所述氨基酸549至568含有一IQ基序(“PepIQ”)。所述PepIQ及PepY593作为对照肽使用。所述三种肽在N-末端与TAT细胞可渗透性序列融合(参阅表4的序列)。

所述肽以2mg/kg的剂量(腹膜内注射，每日一剂，为时两周)用于治疗SW620肿瘤的一个裸鼠异种移植物。使用SW620细胞是因为它们含有高度Y593磷酸化的p68(Carter,CL,et al.Oncogene 29:5427-5436(2010)；Yang,L,et al.Mol Cancer Res 3:355-363(2005))。现已公认SW620肿瘤的异种移植物会转移到淋巴结，而且通过检验脾脏中的SW620细胞，可以对所述转移进行分析(Liu,K,et al.J Immunol 171:4164-4174(2003))。

所述PepPhoY593肽对SW620的转移几乎没有起任何作用(见表1)，而癌症转移在很大程度上由所述PepIQ肽降低(见图1A)。如肿瘤生长及使用抗Ki-67的抗体进行的免疫染色所显示的那样(见图1B及图1C)，以任何所述肽进行的治疗对肿瘤生长率并没有重大作用。始终如一地，所述肽对SW620细胞的体外增殖没有任何作用(见图1D)。

我们也已通过分析上皮细胞间质转型(EMT)标记、E-钙黏着蛋白(E-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)的细胞水平，检验所述肽是否会废止血小板衍生生长因子(Platelet-derived Growth Factor,PDGF)激发的上皮细胞间质转型(EMT)。以所述PepPhoY593肽进行治疗导致波形蛋白(Vimentin)减少及E-钙黏着蛋白(E-cadherin)增加。然而，以PepIQ及PepY593进行治疗对E-钙黏着蛋白(E-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)的水平并没有重大影响。这些结果表明，所述PepPhoY593肽对癌症转移未起任何作用，而所述PepIQ肽则抑制了癌症转移。这些结果也表明，所述抑制作用并非由于对细胞增殖及上皮细胞间质转型(EMT)的抑制。通过使用所述PepIQ肽及一带有乱序重排序列的对照肽(PepScram)(见图6、表2及表4)进行的附加治疗，确认了所述PepIQ肽对癌症转移的作用。

一含有融合到增强绿色荧光蛋白(eGFP)的C-末端的p68的氨基酸549至568的融合蛋白(“eGFP-IQ”)(参阅表4的序列)在SW620细胞中表达，确定所述PepIQ序列对抑制癌症转移的作用。所述eGFP-IQ的表达大大降低了SW620异种移植物的癌症转移，而在eGFP单单作为一对照或缓冲剂表达时，并未观察到所述癌症转移降低(见图7A、图7B及表3)。所述癌症转移的降低并非由于肿瘤生长在所述融合蛋白表达时改变使然(见图7C)。

实施例2：所述IQ肽中断细胞迁移必需的p68-CaM相互作用

材料及方法

划痕创伤治疗；将使用吸管端的一个或多个划痕插入一个6孔细胞培养板。所述细胞进一步在血清饥饿条件下培养30分钟，然后培养一段附加的指示时间。所述经划痕处理的细胞直接由显微镜显现，或所述细胞经历固定然后通过免疫染色进行检验。可选择地，所述细胞被收集及分解。所制备的细胞提取物接着用于其他分析。

“博伊登室趋化性试验”(Boydon Chamber assay)：使用QCM^TM24孔荧光细胞迁移测定(QCM^TM24-Well Fluorimetric Cell Migration Assay)来测量SW480细胞的迁移。待测细胞首先在不同条件下在常规细胞培养板中处理。将所处理的细胞再悬浮到最佳培养基中(无血清)，然后将它们接种到细胞迁移检测试剂盒的内腔中。将所述带有10％FBS的L-15培养基添加到外腔。在温育过夜之后，将所述内腔中的培养基移开，然后使用细胞分离缓冲剂(包括在试剂盒中)将附着在外底侧的细胞分离。通过使用λm＝485nm及λm＝535nm来测量荧光性，以确定迁移细胞的数量。伴随着p68敲低的所述对照细胞的迁移定义为1。

结果

前述的实验显示，所述肽治疗对上皮细胞间质转型(EMT)标记的表达或对肿瘤生长及细胞增殖没有任何作用。细胞迁移可能是IQ肽的目标。与SW620细胞相比，SW480细胞具有相似的迁移特性，但其增殖率比前者低得多。在所述迁移测定中，所述PepIQ几乎完全抑制了细胞迁移(见图2)。同样地，所述eGFP-IQ在SW480细胞中的稳定表达也引人注目地抑制了细胞迁移(见图7D)。

在许多体外结合研究中，p68与钙调蛋白(CaM)相互作用，而且所述IQ基序提供p68-钙调蛋白(CaM)相互作用的位点。由于PeplQ及eGFP-IQ与p68竞争以同钙调蛋白(CaM)在细胞中相互作用，因此它们抑制了细胞迁移。

使用钙调蛋白(CaM)微珠拉下测定来确定所述PeplQ肽是否影响了p68与钙调蛋白(CaM)的相互作用。在这些实验中，肽治疗并未导致p68-CaM相互作用发生引人注目的变化。因此，在迁移刺激的条件下，通过使用一抗钙调蛋白(CaM)的抗体，以SW480细胞的提取物进行免疫共沉淀，从而检验所述p68-CaM相互作用。在经受多个划痕创伤处理的SW480细胞中观察到p68与钙调蛋白(CaM)免疫共沉淀的强劲增加，而且增加程度取决于引入划痕的数目。同样地，在表皮细胞生长因子(EGF)治疗进行时，p68与钙调蛋白(CaM)共沉淀强劲增加。

对细胞迁移变化进行的测量显示p68-CaM相互作用的增加与在表皮细胞生长因子(EGF)刺激下的细胞迁移紧密相关(见图8)。这些结果表明细胞迁移加强了p68-CaM相互作用。

为了检测所述PeplQ肽是否废止了由细胞迁移诱导的p68-CaM相互作用增强，在已经由所述肽治疗的SW480细胞的细胞溶解产物中探查p68-CaM相互作用。在这些实验中，并未在以所述肽治疗的细胞中观察到p68-CaM相互作用在多个划痕创伤时强劲增加的现象。同样地，p68-CaM相互作用并未在迁移刺激时，在eGFP-IQ表达的SW480细胞中引人注目地加强。然而，从所述划痕创伤细胞的提取物中检测到CaM与eGFP-IQ共沉淀增加，这表明所述eGFP-IQ与p68竞争以同CaM相互作用。

为了检测所述PeplQ肽是否中断了IQGAP1或Myosin-II与CAM的相互作用，使用所述抗CaM的抗体，对在经过/未经多个划痕创伤的情况下以所述PeplQ治疗的SW480细胞的细胞提取物进行免疫共沉淀。所述共沉淀物的免疫印迹显示，所述IQGAPl-CaM相互作用及Myosin-CaM相互作用并未受到所述PeplQ治疗的影响，不论所述细胞是否已由所述划痕创伤处置。所述结果表明，所述PeplQ肽很可能特异性地中断p68与CaM的相互作用。所述结果也排除了由于所述PepIQ隐蔽了所述细胞中的全部钙调蛋白(CaM)而因此抑制细胞迁移的这个可能性。因此，这些实验支持了下述观点：细胞迁移加强了p68-CaM相互作用，而且所述IQ肽中断了由细胞迁移诱导的p68-CaM相互作用，从而抑制细胞迁移。

内源性p68在SW480细胞中被敲低，而且血凝素-标记p68(“HA-tagged p68”)野生型p68肽(“WT”)、IQ-M肽、LGLD肽(一带有R403L突变的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性缺失突变体(“LGLD”)(Lin C,et al.Mol Cell Biol 25:7484-7493(2005)))、或Y593F突变体p68肽(Yang L,et al.Cell 127:139-155(2006))在所述细胞中表达。“博伊登室趋化性试验”(Boydon Chamber assay)显示，p68的敲低导致细胞迁移引人注目的减低，而且所述细胞迁移可以由野生型p68(WT p68)的表达完全恢复，但不能由所述IQ-M突变体恢复。作为一对照，所述细胞迁移也可以由在一不相关位点运载突变的一个突变体的表达恢复(Y595F)(图3A)。有趣的是，三磷酸腺苷酶(ATPase)活性缺失p68(LGLD)在所述p68敲低细胞中的表达并未恢复细胞迁移，这表明细胞迁移需要p68的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性(图3A)。

所述p68与CaM的相互作用在细胞迁移中的功能角色进一步由划痕创伤测定确认(图3B)。使用抗血凝素(anti-HA)抗体对所述外源地表达的HA-p68及突变体进行的免疫荧光染色显示，没有任何表达HA-IQ-M及HA-LGLD的细胞迁移到所述创伤处，而p68WT表达细胞正常地迁移到所述创伤区域。这些实验显示，细胞迁移需要所述p68-CaM相互作用。

实施例3：p68与钙调蛋白(CaM)的相互作用影响钙调蛋白(CaM)及p68定位到细胞质及定位到迁移细胞的前缘

只在迁移细胞中观察到强劲的细胞质p68染色。当所述细胞抵达迁移目的地时，p68专有地重新定位到细胞核。再者，在细胞质中及在迁移细胞的前缘有很高水平的p68染色，而且这个染色模式并未在非迁移细胞中观察到。由于p68与钙调蛋白(CaM)在迁移细胞中相互作用，预期p68及钙调蛋白(CaM)会展现相似的定位模式。为此，将划痕创伤导入SW480细胞。接着通过免疫染色对所述细胞进行分析。在这些实验中，p68及钙调蛋白(CaM)共定位，特别是在迁移细胞的前缘。在非迁移细胞中，p68专有地定位在细胞核中，而钙调蛋白(CaM)则可以在所述细胞中的几乎每一处检测到。然而，与非迁移细胞相比，在细胞迁移前缘及迁移细胞的细胞核中的钙调蛋白(CaM)水平显著增加。

在划痕创伤条件下，对外源地表达的HA-p68突变体LGLD及IQ-M的定位模式以及它们的表达对钙调蛋白(CaM)的细胞定位的作用进行了检验。将所述外源性p68敲低。所述HA-p68s、WT、LGLD或IQ-M肽在p68敲低细胞中表达。随后导入划痕创伤。使用抗血凝素(anti-HA)抗体进行的免疫染色显示，所述外源地表达的野生型HA-p68(WT HA-p68)定位到迁移细胞的前缘。所述三磷酸腺苷酶(ATPase)活性缺失突变体LGLD虽然在所述细胞核及细胞质中检测到，但它不能在细胞膜缘处积聚。有趣的是，所述IQ-M肽几乎专有地定位在细胞核中。钙调蛋白(CaM)在所述相同的HA-p68s表达细胞中的免疫染色显示，钙调蛋白(CaM)也不能在划痕创伤条件下、在表达LGLD或IQ-M突变体的细胞膜缘处积聚。所述结果表明，所述p68-CaM相互作用及p68的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性是钙调蛋白(CaM)在细胞迁移期间定位到细胞前缘的必需条件。

实施例4：p68核糖核酸解旋酶(p68RNA解旋酶)展现钙调蛋白(CaM)依赖性微管马达活性

材料及方法

微管拉下及滑动测定：按供应商的指导，在添加紫杉酚的温热PM缓冲剂(5mM管，pH 7.0，1mM MgCl₂)中重组微管。在室温条件下温育15分钟之后，所述微管(MTs)已可使用。在多种条件下，待测蛋白以所述重组微管温育。通过进行100,000g的离心过滤30分钟，将带有所述结合蛋白的微管(MTs)从所述温育液分离。在50μl的2倍的“十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳”(SDS-PAGE)上样缓冲液中，将所述微管(MTs)的共沉淀物再悬浮，并加热至85℃，为时10分钟，然后通过免疫印迹进行分析。将所述HA-p68-CaM、HA-p68或His-p68-CaM肽(10μl)上样到一载玻片上。以封闭缓冲液封闭所述载玻片。对于上样了HA-p68的载玻片，添加10μl含有0.5mM的Ca²⁺的钙调蛋白(CaM)到该载玻片，然后温育10分钟。在上样之后，以所述含Ca²⁺的漂洗缓冲液冲洗所述载玻片，以去除未结合的蛋白。接着将所制备的罗丹明(Rodamine)标记微管上样到所述载玻片上。使用相同的含Ca²⁺的漂洗缓冲液来去除未结合的微管。然后通过共聚焦显微镜来记录微管的运动。

钙调蛋白(CaM)微珠拉下：源自SW480细胞的完整细胞分解产物如先前所述的那样制备(Yang L,et al.Cell 127:139-155(2006)；Yang L,et al.Mol Cancer Res 3:355-363(2005))。以含有Ca²⁺的缓冲液(2mM CaCl₂，50mM NaCl于50mM Tris-HCl中，pH7.5)或含有乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)的缓冲液(5mM EGTA，50NaCl于50mM Tris-HCl中，pH 7.5)，对与重组钙调蛋白(CaM)结合的琼脂糖微珠(Abeam)进行预先冲洗。在冲洗之后，所述微珠与所述完整细胞分解产物在所述含有Ca²⁺的缓冲液或含有乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)的缓冲液中温育。在温育之后，对所述微珠进行大面积的冲洗。最后，将2倍的“十二烷基硫酸钠”(SDS)上样缓冲液添加到所述微珠，将所述微珠加热至85℃，为时10分钟。通过10％“十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳”(SDS-PAGE)及随后的免疫印迹，对由所述钙调蛋白(CaM)微珠下拉的蛋白进行分析。

三磷酸腺苷酶(ATPase)测定：通过使用一与先前描述的实验步骤，测定不同蛋白的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性(Huang Y,et al.J Biol Chem277:12810-12815(2002)；Lin C,et al.Mol Cell Biol 25:7484-7493(2005))，发现其更改轻微。在三磷酸腺苷酶(ATPase)测定缓冲液(10mM管，pH7.0，1mM MgCl₂，添加紫杉酚的25mM NaCl)，反应容积为50μl，含有4μg的MTs(或2μg的RNA)、4mM ATP(三磷酸腺苷)及0.5mM Ca²⁺或5mM EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)。添加10μl的提纯血凝素(HA)标记蛋白(结合或未结合到琼脂糖微珠)。所述三磷酸腺苷酶(ATPase)反应在37℃的温度条件下温育30分钟。在温育之后，将30μl的上清液添加到1ml的孔雀绿-钼试剂中。在室温条件下经过5分钟的温育之后，测量所述反应的吸光度为630nm(A₆₃₀)。通过在一“A_630nm对已知磷浓度”的标准曲线图中匹配所述A_630nm来确定释放出的无机磷的浓度。

结果

为了确定p68是否在迁移细胞中介导钙调蛋白(CaM)与微管马达的相互作用，通过从以多个划痕创伤处置的SW480细胞制备的细胞提取物中的免疫共沉淀，探查p68与两个广为人知的微管马达分子(驱动蛋白及动力蛋白)之间的相互作用。

在经过/未经多个划痕创伤处置的条件下，以免疫提纯自SW480细胞的细胞溶解产物的外源地表现的HA-p68进行共沉淀实验。所提纯的HA-p68与微管一起温育。在通过离心法沉淀所述微管之后，通过使用一抗血凝素(anti-HA)抗体的免疫印迹，检验所述微管沉淀物中HA-p68的存在。在存在钙调蛋白(CaM)的情况下，提纯自以多个划痕创伤处置的细胞的HA-p68与所述微管共沉淀。相反地，即使是在存在钙调蛋白(CaM)的情况下，免疫提纯自未经多个划痕创伤处置的SW480细胞的HA-p68却没有与所述微管共沉淀。在存在及不存在Ca²⁺及钙调蛋白(CaM)的情况下，所述HA-p68都不与未聚合的α-微管蛋白及β-微管蛋白共沉淀。有趣的是，在存在钙调蛋白(CaM)的情况下HA-p68与微管的共沉淀完全是Ca²⁺依赖性的，而因HA-p68与所述微管在存在或不存在三磷酸腺苷(ATP)的情况下及在存在非水解性三磷酸腺苷(ATP)类似物AMP-PNP的情况下都会共沉淀，三磷酸腺苷(ATP)是可有可无的。

进一步通过将罗丹明(Rodamine)标记微管结合到固定在载玻片上的HA-p68，检验p68-CaM与所述微管的相互作用。接着通过荧光显微镜观察所述微管结合到所述载玻片。在这些实验中，在存在钙调蛋白(CaM)及Ca²⁺的情况下，微管结合到提纯自以划痕创伤处置的SW480细胞的HA-p68肽。在没有添加钙调蛋白(CaM)的情况下，所述微管没有结合到HA-p68。所述微管也没有结合到提纯自未经多个划痕创伤处置的SW480细胞的HA-p68。进一步检验外源地表达的DsRed-p68与由eGFP标记的微管的共定位。在划痕创伤处置之下，DsRed-p68与eGFP标记微管共定位。因此，p68与微管相互作用，而所述相互作用取决于所述p68-CaM相互作用。

如果p68起着一类似微管马达分子的作用，则可预期该微管将刺激p68的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性。因此，在存在包括RNA及微管的多种可能培养基的情况下，对免疫提纯自经多个划痕创伤处置的SW480细胞的HA-p68的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性进行了分析。有趣的是，所述蛋白展示更强的微管激励的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性(见图4)；而且所述微管激励三磷酸腺苷酶(ATPase)活性是Ca²⁺依赖性的，这是由于乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)的添加降低了所述三磷酸腺苷酶(ATPase)活性(见图4)。所观察到的微管激励三磷酸腺苷酶(ATPase)活性来自p68，这是由于废止p68的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性的突变(LGLD)也废止了所述蛋白的微管激励三磷酸腺苷酶(ATPase)活性(见图9)。此外，在未经划痕创伤处置的情况下提纯自所述细胞提取物的HA-p68中，并未检测到这个微管依赖性三磷酸腺苷酶(ATPase)活性(见图4C)。

在经过/未经过划痕创伤处置的条件下，从SW480细胞提纯HA-p68，并将其附着到一载玻片。接着将罗丹明(Rodamine)标记微管添加到所述载玻片。接着记录在存在及不存在三磷酸腺苷(ATP)的情况下所述微管的迁移。首先，阳性对照动力蛋白(驱动蛋白)清楚地显示微管的迁移。在存在钙调蛋白(CaM)及Ca²⁺的情况下，微管在附着有HA-p68的载玻片上的迁移也很清晰易见。相反地，在带有提纯自未经划痕创伤处置的SW480细胞提取物的HA-p68的载玻片上，没有观察到所述微管的迁移。作为一阴性对照，所述迁移并未在没有添加三磷酸腺苷(ATP)的情况下观察到。统计分析表明，HA-p68/CaM在所述微管上展示的马达活性与一对照动力蛋白(驱动蛋白)的马达活性很相似(在一随机选择的50个微管的组中，滑动微管数目、平均滑动速度及最高滑动速度很相似)(见图5)。

既然所述p68及HA-p68肽不与两个很普通的微管相关动力蛋白免疫共沉淀，所观察到的HA-p68马达活性是由于其他细胞马达蛋白共纯化是比较不可能的。为了进一步排除所述马达活性是由于提纯期间的污染的可能性，构建了一p68-CaM融合蛋白(如图10A中所示)。HA-p68-CaM融合蛋白在SW480细胞中表达导致细胞迁移率大幅度增加(见图10B)，而且所表达的融合蛋白定位到所述迁移细胞的前缘。其实，所述融合蛋白的表达促进

片层足/丝足(lamellipodia/filopodia)在未经划痕创伤处置的情况下形成。这些观察表明所述融合蛋白在功能上类似由细胞迁移信号诱导的p68-CaM相互作用，所述融合蛋白His-p68-CaM接着表达，并从大肠杆菌(E.coli.)提纯。所述滑动测定以这个细菌性地表达的融合蛋白执行。在这些实验中，所述细菌性地表达的His-p68-CaM结合到微管，具有微管依赖性的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性(见图10C)，而且具有强大的微管马达活性(见表5)。

最后，为了确定p68是否确实沿着被诱导进行迁移的细胞中的微管迁移，在SW480细胞中外源地共表达与DsRed融合的p68(“DsRed-p68”)及eGFP-标记α-微管蛋白。使用带有多光子激发、能以慢速摄影为活细胞成像的共聚焦显微镜，记录DsRed-p68的沿着所述eGFP-标记微管的移动。所述荧光图像清晰地显示，p68在细胞迁移的诱导下沿着所述微管迁移。所述移动向着迁移前缘。所述结果表明，通过与钙调蛋白(CaM)相互作用，p68核糖核酸解旋酶(p68RNA解旋酶)可以作为一个微管马达。

实施例5：所述PepIQ抑制4T1细胞的正位模型的癌症转移

所述PepIQ在抑制SW620细胞的异种移植物模型的癌症转移方面很有效，这指示一个使用肽或其衍生物来干涉癌症转移的应用潜能。因此，对肽对另一癌症模型中的转移的作用进行了检验。将小鼠乳腺癌4T1细胞植入Balb/c小鼠的乳腺中。在植入4日之后，以所述PepIQ、所述对照肽(PepScram)及缓冲剂通过腹膜内注射(每日一剂，每剂2mg/kg，为时14日)，对所述小鼠进行治疗。在肿瘤植入之后第26日牺牲所述小鼠。采集并检验所述原发性肿瘤及主要转移器官、肺脏及肝脏。很明显的是，所述肽治疗并未导致原发性肿瘤生长的任何显著变化(图5A，以PepIQ治疗的组中的一只小鼠身上的肿瘤并未增长)。在所述缓冲剂治疗及所述PepScram治疗组中，观察到向着肺部的强劲转移，而且有多个转移位点，而在PepIQ治疗组中，4只小鼠中仅有3只小鼠在肺脏有癌症转移(一只小鼠的肺脏完全没有癌症转移)。PepIQ治疗组的小鼠肺脏中的可见癌转移结节数目少得多，而且所述结节比PepScram治疗组及缓冲剂治疗组的结节小得多(见图5B-5D)。在全部小鼠的肝脏中没有观察到任何可见癌转移结节。然而，组织学分析显示所述肝脏中的微转移病灶(见图5D)。来自每一小鼠的肝脏的三个随机选择组织切片的4个随机选择域中的微转移病灶的定量显示，所述PepIQ治疗组中的微转移病灶的平均数显然低于缓冲剂治疗组及PepScram治疗组的那些平均数(见图5D)。在来自所述PepIQ治疗组的四只小鼠中的两只小鼠的肝脏组织切片中，没有见到任何微转移病灶。所述PepIQ治疗组中的微转移病灶大小也显然小于对照组的微转移病灶大小(见图5D)。为了检验所述PepIQ是否影响4T1细胞的细胞迁移，进行了细胞迁移测定。“博伊登室趋化性试验”(Boydon Chamber assay)及划痕创伤测定都表明，在PepIQ治疗进行时，所述细胞迁移引人注目地减少(见图10)。

除非另外定义，本文中使用的所有技术及科学术语的意思与所揭示的发明所属领域的技术人员一般理解的相同。本文中引用之出版物及它们被引用之材料据此通过提及而并入本发明。

Claims

1.一种用于抑制一受治疗者身上癌症的转移的方法，包括对一需要给药的受治疗者施用一含有能选择性地抑制p68RNA解旋酶在癌细胞中结合到钙调蛋白(CaM)的药剂的组合物。

2.一种用于治疗一受治疗者身上的一炎症的方法，包括对一需要给药的受治疗者施用一含有能选择性地抑制p68RNA解旋酶结合到钙调蛋白(CaM)的药剂的组合物。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述药剂为一包括p68的IQ基序或一能结合CaM的保守性变体。如权利要求3所述的方法，其中所述肽包括氨基酸序列FVSAGIQTSFRTGNPTG(SEQ ID NO:7)。

4.如权利要求4所述的方法，其中所述肽包括氨基酸序列FVSAGIQTSFRTGNPTGAYG(SEQ ID NO:4)。

5.如权利要求3所述的方法，其中所述肽进一步包括一细胞渗透肽序列。

6.如权利要求3所述的方法，其中所述肽的长度为6至30个氨基酸。

7.如权利要求1或2所述的方法，其中所述药剂为一选择性地结合癌细胞中的p68RNA解旋酶的IQ基序的抗体。

8.一种用于识别用于抑制一受治疗者身上的癌症转移的药剂的方法，包括：

(a)在适合p68肽结合到CaM肽的条件下，使一候选药剂接触一含有p68肽的试样，以及

(b)测定所述p68肽结合到所述CaM肽，

其中所述p68肽含有人p68RNA解旋酶的IQ基序或一能结合人CaM的保守性变体，

其中所述CaM肽含有人CaM的p68结合区域或一能结合p68的保守性变体，

其中，与一对照试样相比，结合的减少显示药剂抑制癌症转移。

9.如权利要求9所述的方法，其中所述肽包括氨基酸序列FVSAGIQTSFRTGNPTG(SEQ ID NO:7)。

10.如权利要求10所述的方法，其中所述肽包括氨基酸序列FVSAGIQTSFRTGNPTGAYG(SEQ ID NO:4)。

11.一种药用组合物，包括一可选择性地抑制p68RNA解旋酶结合到钙调蛋白(CaM)的肽及一药学上可接受的载体，所述药用组合物按用于抑制癌症在受治疗者身上转移的单位剂量施用。

12.一种隔离肽，包括人p68的IQ基序或一能结合人CaM的保守性变体及一细胞渗透肽序列。

13.一种药用组合物，包括一可选择性地抑制p68RNA解旋酶结合到钙调蛋白(CaM)的肽及一药学上可接受的载体中的一抗肿瘤药剂。