CN104490867A - 苯甲酸衍生物在制备抗血管新生药物中的用途 - Google Patents

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吴春福
杨静玉
王立辉
陈国良
李猛
李华欢
蒋晓蕊
周启璠
方武宏
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Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及苯甲酸衍生物在制备抗血管新生药物中的用途。本发明提供的苯甲酸衍生物在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)微管形成实验，Transwell小室迁移实验和划痕实验，及小鼠肿瘤组织微血管密度实验等方面的作用，发现苯甲酸衍生物可以明显抑制内皮细胞微管的形成，明显抑制内皮细胞迁徙转移，并显著抑制荷瘤小鼠肿瘤组织中微血管密度。

Description

苯甲酸衍生物在制备抗血管新生药物中的用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及4-[1-(5,6,7,8-四氢-3,5,5,8,8-四甲基-2-萘基)乙烯基]苯甲酸衍生物以及含有此类化合物的药物组合物作为治疗血管新生相关疾病的药物的应用。
背景技术
血管新生指在原有血管的基础上芽生出新毛细血管的过程，包括以下过程：血管内皮细胞增殖，血管基底膜降解，内皮细胞迁移并形成微管，重塑基底膜，血管生成；该过程包含了血管内皮细胞与周围细胞外基质间的相互作用，主要受血管新生促进因子和血管新生抑制因子的调控。研究发现，多种生长因子如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血管生成素2和碱性成纤维细胞生长因子，及标配生长因子等都可以通过不同的途径调节血管新生。生理状态下，血管新生在胚胎发育、创伤修复、女性月经时短暂开放，其余时段则处于关闭状态，从而使血管的生长与退化维持在动态的平衡状态。
肿瘤是人体细胞异常分化增殖的恶性疾病。肿瘤在表现其生长、转移等生物学行为时与其中的微血管增生有密切的关系。无论原发性或转移性肿瘤,其持续性生长都必须依赖于新生血管的形成。肿瘤的生长首先需要建立一个新生血管网络。缺少血供的肿瘤直径一般只能维持在1～2mm以内。新生肿瘤血管表现为结构不规则,生长方式各不相同,提示肿瘤血管生成有着与正常新生血管不同的条件。恶性肿瘤细胞依赖丰富的新生毛细血管网及时得到其迅速无限生长所需的氧气和养料,并运走代谢废物。因此，抗肿瘤血管新生已经成为抗肿瘤发生发展的有效策略之一。目前抗血管新生药物已经有Avastin、Nexavar和Sutent等被美国FDA批准应用治疗恶性肿瘤，还有数十种抑制剂被批准进行临床实验。
关节炎与血管新生的关系密切,因为关节炎早期的病理改变为持久性滑膜炎及血管翳形成,尤其依赖于广泛的新生血管网的形成。血管翳具有类似于肿瘤组织的特性-侵蚀性,它可侵蚀和破坏关节软骨和骨组织,最终引起不可逆的关节僵直、功能丧失。在关节炎的滑液细胞中有VEGF的高表达,显示VEGF与关节炎发生的关系。临床研究证实,关节炎患者关节内新生血管增生的程度与患者的病情、滑膜增生及炎细胞反应的程度呈正比,抑制血管新生的药物可缓解关节炎的病情。
除了恶性肿瘤及关节炎与血管新生相关外，血管新生还与糖尿病视网膜病变、银屑病、血管新生性眼病和动脉粥样硬化等多种疾病或病理过程有关。
发明内容
发明目的
本发明提供式(I)4-[1-(5,6,7,8-四氢-3,5,5,8,8-四甲基-2-萘基)乙烯基]苯甲酸衍生物DW22在制备用于血管新生相关疾病的治疗和/或预防药物中的应用。
式(I)
本发明要解决的技术问题在于式(I)4-[1-(5,6,7,8-四氢-3,5,5,8,8-四甲基-2-萘基)乙烯基]苯甲酸衍生物在制备用于血管新生相关疾病的治疗和/或预防药物中的应用，尤其是在制备肿瘤血管新生、眼科疾病、类风湿性关节炎、血管瘤、银屑病等血管新生性疾病中的应用。其中，所述抑制血管新生药物可抑制肿瘤血管新生，可抑制病变组织血管新生。其中，所述肿瘤血管新生包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤血液癌症的血管新生、Kaposi’s肉瘤病变组织血管新生、Paget’s疾病血管新生、血管瘤病变组织血管新生、血管瘤、实体瘤病变组织血管新生、多发性血管瘤、血管母细胞瘤和良性血管增生疾病。所述病变组织血管新生包括关节炎病变组织血管新生、血管新生性眼病、银屑病病变组织血管新生和动脉粥样硬化组织血管新生。
本发明还提供含有有效量的式(I)4-[1-(5,6,7,8-四氢-3,5,5,8,8-四甲基-2-萘基)乙烯基]苯甲酸衍生物以及药学可接受成分的组合物在制备抑制血管新生药物中的应用。根据本发明可以将治疗有效量的4-[1-(5,6,7,8-四氢-3,5,5,8,8-四甲基-2-萘基)乙烯基]苯甲酸衍生物和药学上接受的任意一种辅料制成药物组合物，也可以添加其他与4-[1-(5,6,7,8-四氢-3,5,5,8,8-四甲基-2-萘基)乙烯基]苯甲酸衍生物没有拮抗作用的其他抗血管新生药物。可以在本发明的抑制血管新生的药物中加入一种或多种药学上可以接受的载体。其制剂可以是药学上的任意一种剂型，包括但不限于胶囊剂、片剂、微囊制剂、注射剂、栓剂、喷雾剂或软膏剂等。
优点和效果：
经研究表明，本发明提供的式(I)中4-[1-(5,6,7,8-四氢-3,5,5,8,8-四甲基-2-萘基)乙烯基]苯甲酸衍生物在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)微管形成实验，Transwell小室迁移实验和划痕实验等具有明显的抑制作用，可以明显抑制内皮细胞微管的形成，明显抑制内皮细胞有阻力的迁徙转移。
本发明中所用的4-[1-(5,6,7,8-四氢-3,5,5,8,8-四甲基-2-萘基)乙烯基]苯甲酸衍生物为沈阳药科大学药物化学实验室合成和鉴定。
附图说明
图1、图2为本发明化合物激活维甲酸受体RXR，抑制组蛋白脱乙酰化酶HDAC的示意图；图1为Bexa贝沙罗汀，图2为HDAC组蛋白去乙酰化酶；
图3为本发明化合物抑制VEGF诱导人脐静脉内皮细胞HUVEC侵袭的示意图(VEGF血管表皮生长因子)；
图4为本发明化合物抑制VEGF诱导人脐静脉内皮细胞HUVEC转移的示意图(VEGF血管表皮生长因子)；
图5为本发明化合物抑制VEGF诱导人脐静脉内皮细胞HUVEC小管生成的示意图(VEGF血管表皮生长因子)；
图6为本发明化合物在体抗血管新生的示意图。
具体实施方式
实施例1、衍生物的制备及作用靶点
1.1化合物的来源和配制
DW22纯度大于98％，化合物用DMSO溶解配制成100mM母液，临用时用培养液稀释制需要浓度。
1.2化合物的作用靶点
DW22是具有双靶点的化合物，其一作为维甲酸类似物激活维甲酸受体(RXRα)，其二抑制HDAC的活性，抑制细胞生长，诱导细胞分化及凋亡。
1.2.1材料肺癌A549细胞，乳腺癌MDA-MB-435细胞，培养液购自Gibco，Bexarotene、SAHA购自Sigma，CRBPII-tk-luc由makishima.makoto惠赠，pCMX-hRXR,和pRL Renilla Luciferase Reporter Vector购自PromegaCorporation，Cell Lysis Buffer购自Beyontime，BCA protein assay购自Beyontime，HDAC fluorescent activity assay kit购自Biovison。
1.2.2实验方法
DW22、Bexarotene、SAHA以DMSO溶解成100mM母液储备，临用时以培养液稀释；在5％CO2，37℃饱和湿度的培养箱中培养A549、MDA-MB-435细胞。培养液以90％RPMI-1640或MEM基础培养基和10％FBS比例混合。
CRBPII-tk-luc、pCMX-hRXR、pRL Renilla Luciferase Reporter Vecto三种质粒(浓度比10:3:2)转染A549、MDA-MB-435细胞，转染5h后，以不同浓度的DW22、Bexarotene处理细胞，转染48h后，Dual-Luciferase Reporter AssaySystem检测RXR活性。
A549、MDA-MB-435细胞以不同浓度的DW22、SAHA处理24h，cell lysisbuffer裂解细胞，BCA protein assay测蛋白浓度，HDAC fluorescent activity assaykit检测HDAC活性。
1.2.3结果
如图1DW22显著激活RXR，并呈现浓度依赖效应；在1μM和50μM浓度下，DW22比Bexarotene有更加显著的激活RXR作用。
如图2DW22抑制HDAC的活性，并呈现浓度依赖效应；在5μM浓度下，DW22与SAHA有相似的HDAC活性抑制效应。
实施例2、DW22对VEGF诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)侵袭能力的影响
2.1材料
原代HUVEC细胞，培养液、LSGS、胰酶购自Gibco，Transwell小室购自Corning，基质胶购自BD，钙黄绿素购自Sigma。
2.2实验方法
DW22以DMSO溶解成100mM母液储备，临用时以培养液稀释；在5％CO2，37℃饱和湿度的培养箱中培养HUVEC细胞。培养液以90％M200基础培养基和2％LSGS比例混合。
Transwell小室以1：8基质胶与培养液混合后包被，37度凝固0.5h后备用，上室加入200μl不含VEGF的培养液，下室加入500μl含VEGF培养液，药物处理组加入1、5、20μM的DW22，培养12h后取出，棉签擦去上室表面细胞，以钙黄绿素染色观察下室表面细胞，采用高内涵药物分析系统拍照，并分析计数。
2.3结果
结果如图3所示，DW22能够抑制VEGF诱导的HUVEC细胞侵袭，此结果表明，DW22够明显抑制VEGF诱导的血管内皮细胞侵袭，可能具有抑制新生血管生成的能力。
实施例3、DW22对VEGF诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移能力的影响
3.1材料
原代HUVEC细胞、培养液、胰酶购自Gibco。
3.2实验方法
DW22以DMSO溶解成100mM母液储备，临用时以培养液稀释；在5％CO2，37℃饱和湿度的培养箱中饥饿处理HUVEC细胞，然后在培养皿中间划痕，加入含或者不含20ng/mlVEGF的0.5％FBS的ECGM基础培养基。药物处理组加入1、5、20μM的DW22，培养12h后取出，显微镜下观察结果，并计数。
3.3结果
结果如图4所示，DW22能够抑制VEGF诱导的HUVEC细胞迁移，此结果表明，DW22够明显抑制VEGF诱导的血管内皮细胞迁移，可能具有抑制新生血管生成的能力。
实施例4、DW22对VEGF诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)小管生成的影响
4.1材料
原代HUVEC细胞、培养液、LSGS、胰酶购自Gibco，96孔板购自Corning，基质胶购自BD，钙黄绿素购自Sigma。
4.2方法
DW22以DMSO溶解成100mM母液储备，临用时以培养液稀释；在5％CO2，37℃饱和湿度的培养箱中培养HUVEC细胞。培养液以90％M200基础培养基和2％LSGS比例混合。
96孔板没空加入1：1混合的基质胶与培养液，37度凝固1h后加入100μLHUVEC细胞悬液，每孔15000个细胞，培养12h后拍照观察，VEGF刺激浓度为20ng/ml。
4.3结果
结果如图5所示，DW22能够抑制VEGF诱导的HUVEC细胞小管生成,此结果表明，DW22能够明显抑制VEGF诱导的血管内皮小管生成，可能具有抑制新生血管生成的能力。
实施例5、DW22对人肝癌细胞MDA-MB-435在体抗血管新生的影响
5.1材料
MDA-MB-435细胞，Balb/c nude雄性鼠，抗CD31抗体、羊抗兔二抗、3,3-二氨基联苯胺购自Sigma。
5.2方法
每只鼠接种100ul细胞悬液(5*106个细胞)，11天后，处死小鼠，剥离瘤组织进行免疫组织化学实验，其步骤简介如下:包埋瘤组织，脱蜡，抗原修复，血清或生物素封闭，加一抗，加二抗，加3,3-二氨基联苯胺，苏木精染色。
5.3结果
结果如图6所示，DW22能够下调血管新生相关标志物CD31，此结果表明，DW22能够明显抑制新生血管的形成。

Claims (9)

1.式(I)中苯甲酸衍生物在制备抗血管新生药物中的用途，
式(I)DW22分子量364。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的抑制新生血管生成的药物为肿瘤血管新生的药物。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的抑制新生血管生成的药物为抑制关节炎病变组织的血管新生的药物。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的抑制新生血管生成的药物为抑制银屑病变组织血管新生的药物。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的抑制新生血管生成的药物为抑制新生血管性眼病的药物。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的抑制新生血管生成的药物为抑制动脉粥样硬化病变处血管新生的药物。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的抑制新生血管生成的药物为抑制糖尿病并发症眼病的药物。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的抑制新生血管生成的药物剂型为胶囊剂、片剂、微囊制剂、注射剂、栓剂、喷雾剂或软膏剂。
9.根据权利要求1中所述的用途，其特征在于：含有有效量的式(I)4-[1-(5,6,7,8-四氢-3,5,5,8,8-四甲基-2-萘基)乙烯基]苯甲酸衍生物以及药学可接受成分的组合物在制备抑制血管新生药物中的应用。
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