CN104483374B - 一种用maldi‑tof‑tof质谱对蛋白质n端序列进行从头测序的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用MALDI‑TOT‑TOF(基质辅助激光解吸电离‑串联飞行时间)质谱对蛋白质N端序列进行从头测序的方法和试剂盒。该方法涉及蛋白质的分离、还原烷基化、蛋白质的化学修饰、酶切肽段的质谱分析、蛋白质N端肽段的质谱识别与从头测序。该方法对胶内蛋白质的赖氨酸进行胍基化，选择性地将TMPP‑Ac修饰在蛋白质N端氨基上；并通过加入终止试剂和洗涤。该方法所得的蛋白质N端氨基修饰物不受过量的试剂和相应的副产物的影响，与质谱技术相容。该方法可对蛋白质的N端肽进行富集，结合反相液相色谱和生物质谱技术，既容易确定蛋白质的N端肽段，又可以很方便地进行从头测序。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质测序技术领域，具体涉及一种用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间(MALDI-TOF-TOF)质谱对蛋白质N端序列进行从头测序的方法和试剂盒。
背景技术
所有蛋白质的合成都起始于N端，N末端序列具有很高的特异性，可用于鉴定蛋白且对其生物学功能有着巨大的影响。因此，通过对蛋白质N端序列的研究有利于分析蛋白质的高级结构，揭示蛋白质的生物学功能。
目前对蛋白N端测序主要分为两大类，其一为非质谱技术，例如经典的Edman降解法、利用反转录RT-PCR得到对应蛋白的cDNA，再来反推得到蛋白序列；其二为质谱技术。经典的Edman降解法已经广泛应用于蛋白质的N端测序，对于整体纯化的蛋白的N端序列分析仍是很有价值的研究工具。但是Edman降解法受到以下诸多限制：①用于序列分析的蛋白质或多肽必须是高纯度的；②N端封闭的蛋白质难以进行Edman反应；③不适于高通量分析，灵敏度不够。利用反转录RT-PCR得到对应蛋白的cDNA，再来反推得到蛋白序列，其特点是更加简便、快速，但它对翻译加工所导致的氨基酸残基的修饰及突变等情况无能为力。
质谱技术已成为当前进行蛋白质鉴定和蛋白质N末端肽测定的主要方法，通过将蛋白质酶切后，对所产生的肽段进行二级质谱分析，再进行数据库搜索而进行鉴定，这些数据库是唯一适于基因组已经测序的生物体。尽管被测序的生物数量越来越多，仍然有大量的遗传密码未知的物种。另一方面由于蛋白质序列的不知原因的突变，蛋白质序列的多形态，数据库中的序列错误以及蛋白质的翻译后修饰等原因存在，使得基于数据库搜索的蛋白质鉴定和蛋白质N末端肽测定存在困难。从头测序方法(de Novo)不依赖现有的数据库，根据肽段有规律碎裂的特点，直接从图谱中推导出肽段的序列，能够分析新物种、基因组未测序物种以及蛋白质的翻译后修饰的串联质谱数据，具有数据库搜索方法不可替代的优势。
许多对末端肽的研究方法采用的是质谱技术与多种化学方法及生物酶法的结合。通过N端的各种化学标记，运用MS/MS或多级质谱(MSn)的碰撞诱导裂解(CID)、源后裂解(PSD)等碎裂技术测序；或标记的N端肽段先经过选择性的分离，再进行从头测序。在所报道的用于标记N端肽段的试剂中，(N-琥珀酰亚胺基氧代羰基甲基)三(2,4,6-三甲氧苯基)溴化膦(TMPP-Ac-OSu)引起大家极大的兴趣，它被用于多肽的从头测序、翻译后修饰和N端测序，其特点是标记TMPP-Ac后的肽段，在用MALDI-TOF/TOF质谱仪进行CID或PSD碎裂时，产生特征的573.2峰，且主要产生连续的a离子系列，图谱简单，便于从头测序；但是过量的反应试剂及其副产物严重干扰随后的反相液相色谱分析(RP-LC)和质谱分析，影响其广泛应用于蛋白质组学。目前报道的方法不仅将TMPP-Ac标记在蛋白质N端，而且还标记在中间肽和其中的赖氨酸上，因此难以识别出蛋白质N端肽。另一方面，赖氨酸的分子量为(128.09496)与谷氨酰胺的分子量(128.05858)相差很近，难于分辨。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单快速高灵敏度的、具有良好特异性和普适性，既可对蛋白质N端进行测序，又可对其进行从头测序的高通量方法，具体为一种用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间(MALDI-TOF-TOF)质谱对蛋白质N端序列进行从头测序的新方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种用MALDI-TOF-TOF质谱对蛋白质N端序列进行从头测序的方法，该方法涉及蛋白质的分离、还原烷基化、蛋白质的化学修饰、酶解、分离富集修饰的蛋白质N端肽段以及N端肽段的质谱识别和从头测序，具体步骤包括：
(1)用一维凝胶电泳(SDS-PAGE GEL)分离蛋白质或将蛋白质凝结在胶上；
(2)在胶内用还原剂打开蛋白质分子中的二硫键，破坏其高级结构；用烷基化试剂封闭巯基，防止其重新形成二硫键；
(3)在胶内对蛋白质的赖氨酸进行胍基化；
(4)在胶内对蛋白质N端氨基进行酰基化修饰，然后进行终止和洗涤，去除过量的修饰试剂和相应的副产物；
(5)用化学消化或酶消化法对蛋白质进行消化，产生适于质谱分析的肽段；
(6)用质谱分析技术分析蛋白质N端肽段，使其裂解产生碎片离子的质谱图；
(7)用反相液相色谱技术分离富集蛋白质N端肽段，用质谱分析技术高通量地测定蛋白质N端肽段。
其中：
所述胍基化为用O-甲基异脲或S-甲基异脲进行胍基化修饰。
酰基化修饰试剂为三(2,4,6-三甲氧苯基)膦基乙酰基衍生物，其使蛋白质N端氨基带上TMPP-Ac基团。
所述三(2,4,6-三甲氧苯基)膦基乙酰基衍生物为(N-琥珀酰亚胺基氧代羰基甲基)三(2,4,6-三甲氧苯基)溴化膦。
步骤(4)中进行终止的化学试剂为羟胺、赖氨酸或甘氨酸；进行洗涤的化学试剂为去离子水和乙腈。
步骤(5)所述酶优选自胰蛋白酶、葡萄球菌蛋白酶(Glu-C)或α-糜蛋白酶。
所述质谱分析技术为LC-MALDI-TOF-TOF或MALDI-TOF-TOF。
本发明的目的还在于提供一种用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间(MALDI-TOF-TOF)质谱对蛋白质N端序列进行从头测序的试剂盒。
该试剂盒含有：
(a)一种化学试剂，对蛋白质的赖氨酸进行胍基化修饰；
(b)一种化学试剂，对蛋白质的N端氨基进行修饰，使其带上TMPP-Ac基团；
(c)两种或多种化学试剂，对蛋白质的修饰反应进行终止；
(d)两种或多种化学试剂，去除过量的反应试剂和相应的副产物。
其中，(a)中所述化学试剂为O-甲基异脲或S-甲基异脲。
(b)中所述化学试剂为三(2,4,6-三甲氧苯基)膦基的乙酰化试剂。
(c)中所述化学试剂为三氟乙酸水溶液、羟胺或赖氨酸或甘氨酸；(d)中所述化学试剂为乙腈和去离子水。
为方便使用，该试剂盒还可包含以下组分中的一种或多种：用于打开蛋白质分子中二硫键的还原剂，如三羧乙基膦(TCEP)；封闭巯基防止其重新形成二硫键的烷基化试剂，如碘代乙酰胺；蛋白质消化剂，如胰蛋白酶、葡萄球菌蛋白酶(Glu-C)或α-糜蛋白酶；缓冲溶液，如磷酸氢钠-磷酸二氢钠。
本发明的方法和试剂盒适用于蛋白质的鉴定与N端序列的快速测定，适用于生物学、医学、药物学研究和应用领域中蛋白质的鉴定和N端测序，特别适合于基因工程重组产品或药物的N端序列分析及质量控制，可对蛋白质组进行规模化的N端测序。
本发明的方法和试剂盒具有广泛的实用性。用途包括但不限于：在医学、药学、农业和畜牧业等领域进行各种动植物和微生物的蛋白质研究。
本发明的有益效果为：
1.本方法具有良好的特异性，可以将TMPP-Ac选择性地标记在蛋白质N端，克服了目前已有方法中存在的难以区分蛋白质N端肽与中间肽、以及蛋白质中所含赖氨酸与谷氨酰胺难区别的问题，可全面用于蛋白的N端测序。
2.TMPP-Ac标记后的肽段用质谱分析时，产生特征峰573.2，图谱简单，便于从头测序；此外，蛋白质的N端氨基带上TMPP-Ac基团后，其疏水性增强，经高压反相液相色谱分离分析时，其保留时间延长，质谱识别简便，据此可将蛋白质组中的N端分离富集出来。
3.赖氨酸的分子量为(128.09496)与谷氨酰胺的分子量(128.05858)相差很近，难于分辨，本方法通过将赖氨酸胍基化则可将两者进行很好的区分。
4.本方法中所有的修饰反应均为“在胶内”进行，通过加入终止试剂和大量地洗涤，所得的蛋白质N端氨基修饰物不受过量的试剂和相应的副产物的影响，与质谱技术相容。
5.本方法大大提高和简化了蛋白质N端测序的速度和通量化水平，显著增加了N端肽在二级质谱中的裂解效率，且图谱简单，可根据二级质谱图对蛋白末端肽进行从头测序。
附图说明
图1为人血红蛋白TMPP-Ac修饰前后酶解所得多肽的MALDI-TOF质谱图；其中，图1a为修饰前，图1b为修饰后。
图2为TMPP-Ac修饰后人血红蛋白N端肽的MALDI-TOF-TOF串联质谱图及从头测序；其中，图2a的序列为VLSPADK,C+1301.21Da，图2b的序列为VHLTPEEK,C+1524.56Da。
图3为胍基化和TMPP-Ac修饰后人血红蛋白用葡萄球菌蛋白酶酶切后N端肽的MALDI-TOF-TOF串联质谱图及从头测序；其中，图3a序列为VHLTPEE,C+1396.54Da；图3b的序列为VHLTPE,C+1267.50Da。
具体实施方式
下面通过实施例结合附图对本发明给予进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域的技术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。
实施例1人血红蛋白的N端测序
1.1胶内蛋白的制备
提取蛋白质，每个Eppendorf管中加入4μL 2.5mg/mL的蛋白质，2.5μL tris-HClpH 8.8，1μL水，4.2μL 30％Acr/Bis，0.1μL 10％SDS，0.2μL TEMED，1μL 10％AP，0.8μL300mM TCEP。混匀，67℃水浴加热还原10分钟，切胶，加新配制的100μL 100mM碘代乙酰胺(IAA)，室温黑暗反应30分钟，进行烷基化保护。用200μL乙腈/水(1:1)振荡20分钟，弃上清，共洗涤两次；加入200μL乙腈振荡10分钟，弃上清。
也可用本领域传统的蛋白质分离技术，如一维或二维凝胶电泳方法分离蛋白，将蛋白固定在胶上，用考马斯亮蓝方法显色。
1.2蛋白的酰基化
在上述的Eppendorf管中加入6μL pH 4.6-9.0磷酸缓冲液，加3μL 10mM新配的(N-琥珀酰亚胺基氧代羰基甲基)三(2,4,6-三甲氧苯基)溴化膦(TMPP-Ac-OSu)乙腈溶液，反应30分钟；加入30μL100mM赖氨酸(或甘氨酸)振荡15分钟，终止反应。再用乙腈/水(1:1)洗涤二次；加入50μL水，在水浴中放置20分钟，水浴温度为50-100℃；再用200μL乙腈洗涤一次。
1.3胶内酶切
加入含10μL 20ng/μL胰酶的50mM NH4HCO3溶液，于37℃孵化17小时。将胶内酶切的多肽按本领域传统方法洗脱出来，冻干。
1.4MALDI-TOF-TOF质谱分析
吸取0.5μL1pmol上述制备的酶切产物点在靶板上，再与含0.1％TFA和50％乙腈的CHCA(10mg/mL)基质溶液混合，自然放干，用MALDI-TOF-TOF-MS测定得质谱图，所有的MALDI-TOF-TOF质谱分析是5800Proteomics Analyzer质谱仪(美国应用生物系统公司)上进行。实验中所得数据都在反射正离子模式中进行，质谱分子量的校正采用外标法。质量测定的准确度通常在10ppm。做质谱分析时，先做一级质谱，然后选择最强的50个峰进行二级质谱分析。
1.5MALDI-TOF-TOF质谱结果分析
图1a是0.5μL 1p的人血红蛋白酶解所得多肽的MALDI-TOF质谱图，图1b是0.5μL1p的TMPP-Ac修饰的人血红蛋白酶解所得多肽的MALDI-TOF质谱图，比较两图可知，图1b比图1a只有两个多肽的区别，它们分别是m/z为1301.21和1524.56，这些是人血红蛋白α，β链的N端肽被TMPP-Ac修饰后所产生的，说明此方法能选择性地修饰蛋白质的N端肽。
在所有的二级图中，只有m/z为1301.21和1524.56两个肽段产生有TMPP-Ac的裂解峰m/z573.189，这些是人血红蛋白α，β链的N端肽被TMPP-Ac修饰后所产生的，据此可将蛋白质的N端肽与中间肽区别开。由图2a，2b可知，所得二级质谱图图谱简单，主要为连续的a离子碎裂离子，且均有TMPP-Ac的裂解峰m/z573.189，它既可以数据库检索得到序列，也可很方便地从头测序，它们的序列分别为VLSPADK,C+1301.21Da(图2a)，VHLTPEEK,C+1524.56Da(图2b)。
实施例2人血红蛋白的N端测序
2.1胶内蛋白的制备
方法同实施实例1中的1.1。
2.2蛋白的胍基化
在上述的Eppendorf管中加入5μL2N的O-甲基异脲的碳酸钠水溶液，反应30分钟，加入5μL 5％三氟乙酸水溶液，终止反应。用200μL乙腈/水(1:1)振荡10分钟，弃上清，共洗涤两次；加入200μL乙腈振荡10分钟，弃上清。
2.3蛋白的酰基化
方法同实施实例1中的1.2。
2.4胶内酶切
加入含10μL 20ng/μL葡萄球菌蛋白酶(Glu-C)的50mM NH4HCO3溶液，于37℃孵化17小时。将胶内酶切的多肽按本领域传统方法洗脱出来，冻干。
2.5MALDI-TOF-TOF质谱结果分析
在所有的二级图中，只有m/z为1267.50和1396.54Da的多肽产生有TMPP-Ac的裂解峰m/z573.189，这是人血红蛋白β链的N端肽被TMPP-Ac修饰后所产生的，据此可将蛋白质的N端肽与中间肽区别开。图3是胍基化和TMPP-Ac修饰后人血红蛋白用葡萄球菌蛋白酶酶切后N端肽的MALDI-TOF-TOF串联质谱图，由图可知，所得二级质谱图图谱简单，主要为连续的a离子碎裂离子，它既可以数据库检索得到序列，也可很方便地从头测序，它们的序列分别为VHLTPEE,C+1396.54Da(图3a)，VHLTPE，C+1267.50Da(图3b)。
Claims (8)
1.一种用MALDI-TOF-TOF质谱对蛋白质N端序列进行从头测序的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用一维凝胶电泳分离蛋白质或将蛋白质凝结在胶上；
(2)在胶内用还原剂打开蛋白质分子中的二硫键，破坏其高级结构；用烷基化试剂封闭巯基，防止其重新形成二硫键；
(3)在胶内对蛋白质的赖氨酸进行胍基化；
(4)在胶内对蛋白质N端氨基进行酰基化修饰，然后进行终止和洗涤，去除过量的修饰试剂和相应的副产物；
(5)用化学消化或酶消化法对蛋白质进行消化，产生适于质谱分析的肽段；
(6)用质谱分析技术分析蛋白质N端肽段，使其裂解产生碎片离子的质谱图；
(7)用反相液相色谱技术分离富集蛋白质N端肽段，用质谱分析技术高通量地测定蛋白质N端肽段；
所述MALDI-TOF-TOF质谱指的是基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱；
所述胍基化为用O-甲基异脲或S-甲基异脲进行胍基化修饰；
所述酰基化修饰试剂为三(2,4,6-三甲氧苯基)膦基乙酰基衍生物，其使蛋白质N端氨基带上TMPP-Ac基团。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述三(2,4,6-三甲氧苯基)膦基乙酰基衍生物为(N-琥珀酰亚胺基氧代羰基甲基)三(2,4,6-三甲氧苯基)溴化膦。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中进行终止的化学试剂为羟胺、赖氨酸或甘氨酸；进行洗涤的化学试剂为去离子水和乙腈。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱分析技术为LC-MALDI-TOF-TOF或MALDI-TOF-TOF。
5.一种用于权利要求1-4任一项所述的方法的试剂盒，其特征在于，此试剂盒含有：
(a)一种化学试剂，对蛋白质的赖氨酸进行胍基化修饰；
(b)一种化学试剂，对蛋白质的N端氨基进行修饰，使其带上TMPP-Ac基团；
(c)两种或多种化学试剂，对蛋白质的修饰反应进行终止；
(d)两种或多种化学试剂，去除过量的反应试剂和相应的副产物；
所述MALDI-TOF-TOF质谱指的是基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，(a)中所述化学试剂为O-甲基异脲或S-甲基异脲。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，(b)中所述化学试剂为三(2,4,6-三甲氧苯基)膦基的乙酰化试剂。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，(c)中所述化学试剂为三氟乙酸水溶液、羟胺或赖氨酸或甘氨酸；(d)中所述化学试剂为乙腈和去离子水。
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