CN104480039B - 抗生素产生菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗生素产生菌及其应用。本发明所述的抗生素产生菌系链霉菌属，命名为链霉菌Lnu‑13(Streptomyces sp.lnu‑13)，保藏编号为CCTCC NO：M2014555。本发明所述的Lnu‑13菌株经PCR技术，DNA测序仪分析，该菌株的16SrDNA序列由1409个碱基组成。本发明采用平板对峙法，检测Lnu‑13对多种供试病原菌的拮抗作用，其中对金黄葡萄球菌、甜瓜枯萎病菌和番茄叶霉病菌均具有较强的抑制作用。

Description

抗生素产生菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种具有高效、广谱的抗多种植物病原菌的链霉菌菌株及其应用。
本发明所称的抗生素产生菌，命名为链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)，已于2014年11月6日，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2014555。
背景技术
放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，广泛应用的抗生素约70％是各种放线菌所产生。一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂、维生素和有机酸等。此外，放线菌还可用于甾体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。因此，放线菌与人类关系密切，开发新的抗生素产生菌种在医药工业及农业生物防治上有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有广谱拮抗活性的土壤放线菌—链霉菌Lnu-13。
本发明的另一目的在于提供链霉菌Lnu-13在抗植物病原真菌和病原细菌中的应用。
本发明的抗生素产生菌，命名为链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)，已于2014年11月6日，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2014555。
本发明的链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)，是从辽宁省仙人洞国家自然保护区土壤中分离得到。将土壤样品稀释105，利用高氏一号培养基，采用常规的平板划线分离法进行分离培养，挑取放线菌单菌落，编号备用，筛选而得。
1、链霉菌Lnu-13的显微形态特征
图1为Lnu-13在光学显微镜100X下的孢子丝和气生菌丝形态，在显微镜下观察，Lnu-13菌株基内菌丝无横膜，不断裂；气生菌丝发达，多分枝，孢子丝大部分为直形、波曲形，有些为螺旋状。孢子呈圆形或椭圆形。图2为Lnu-13在高氏一号培养基上培养特征(正面)，图3为Lnu-13在高氏一号培养基上培养特征(反面)，图中显示Lnu-13在高氏一号培养基上生长良好，表面形状为棉絮状，菌落与培养基着生紧密。菌株Lnu-13的菌丝形态符合链霉菌属的特征。
2、Lnu-13生理生化特性：
菌株Lnu-13使牛奶凝固和胨化、水解淀粉能力较强、能产生硫化氢但较弱，不能液化明胶，不能分解纤维素、不能还原硝酸盐，氯化钠对菌株成长影响不大。在供试的碳源中，不能利用木糖，在含有葡萄糖、半乳糖和蔗糖的培养基上生长旺盛，对淀粉和纤维二糖的利用能力较差。
3、链霉菌Lnu-13的16S rDNA序列分析方法：
(1)链霉菌Lnu-13的DNA提取采用反复冻融法，以此为模板进行PCR扩增。
(2)PCR引物：正向引物BSF8/27：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′
反向引物BSR1541/1522：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′
(3)PCR引物由上海生物工程有限公司合成。
(5)PCR扩增条件：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃1.5min；30个循环；72℃5min。
本发明链霉菌Lnu-13菌株，PCR产物测序由上海生物工程有限公司完成，测得的序列如SCQ ID NO.1所示，将所测得的16S rDNA序列用BLAST搜索工具从GeneBank中调出与其相关的16S rDNA序列，然后用CLASTAL X软件进行多序列比对，并采用MEGA4.1软件中的邻位相接法(Neighbor-Joining)进行系统进化树的构建与同源性比较，所构建的系统进化树见图4。
链霉菌Lnu-13菌株经PCR技术，DNA测序仪分析，它的16S rDNA序列全长1409bp，将其与GeneBank数据库中相关菌株的16S rDNA序列进行比较，结果与已报道的蓝色链霉菌(Streptomyces cyaneus)同源性达到99％。
本发明从辽宁省仙人洞国家自然保护区土壤中得到的链霉菌Lnu-13，通过生理生化反应，并利用PCR反应扩增该菌株的16S rDNA，经过测序鉴定，利用CLASTAL X软件进行多序列比对，然后用MEGA4.1软件中的邻位相接法(Neighbor-Joining)进行系统进化树的构建，鉴定链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)菌株为蓝色链霉菌(Streptomycescyaneus)。
本发明的有益效果是：本发明所提供的链霉菌Lnu-13对多种常见植物病原真菌具有拮抗作用，同时对病原细菌具有很好的抑菌效果，其中对金黄葡萄球菌抑制作用最强，抑菌带宽达到18.6mm。以甜瓜枯萎病为例对Lnu-13发酵液进行了田间药效实验，结果显示Lnu-13对甜瓜枯萎病具有很好的防治效果，防治效果可以达到71％，且对甜瓜幼苗生长有一定的促进作用。本发明所提供的链霉菌Lnu-13具有高效广谱的抑菌谱，展示了该菌株在农业的生物防治及医药行业具有很好的应用前景。
附图说明
抗生素产生菌，命名为链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，简称：CCTCC，保藏单位地址：中国，武汉大学，邮政编码：430072。保藏日期为2014年11月6日，保藏编号为CCTCC NO：M2014555。
图1为Lnu-13的孢子丝和气生菌丝形态(光学显微镜100X)。
图2为Lnu-13在高氏一号培养基上培养特征(正面)。
图3为Lnu-13在高氏一号培养基上培养特征(反面)。
图4为Lnu-13菌株的系统发育进化树。
具体实施方式
实施例1链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)的抑菌作用
1)活化：将链霉菌Lnu-13(Streptomyces sp.lnu-13)(CCTCC NO：M 2014555)，在无菌操作台上操作，用无菌接种环沾取保藏的菌液后均匀涂在高氏1号斜面固体平板上，28℃培养3～5天。
2)采用平板对峙法，刮取经过活化的Lnu-13孢子制备悬浮液，根据供试病原菌分别在PDA((病原真菌)及牛肉膏蛋白胨(病原细菌)固体平板中间均匀划线，30℃培养3～5天。再于Lnu-13划线垂直方向等距离接种各种病原菌，继续培养2～5天，观察记录抑菌情况。每处理重复3次，结果如表1。
病原菌分别采用：金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)，产气肠杆菌(Enterobacter aerogene)，蜡质芽孢杆菌(Bacilluscereus)，辣椒根腐病菌(Pepper Root Rot)、番茄叶霉病菌(Cladosporium fulvum)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、甜瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)。
表1
病原菌 抑菌带平均宽度
金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 18.6mm
热带假丝酵母(Candida tropicalis) 7.6mm
产气肠杆菌(Enterobacter aerogene) 9.8mm
蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus) 11.3mm
辣椒根腐病菌(Pepper Root Rot) 12.1mm
番茄叶霉病菌(Cladosporium fulvum) 15.8mm
番茄早疫病菌(Alternaria solani) 14.6mm
甜瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum) 16.7mm
由表1可见，本发明的链霉菌Lnu-13对所有供试菌株均有一定的抑制作用。其中对金黄葡萄球菌抑制作用最强，抑菌带宽达到18.6mm,对甜瓜枯萎病菌、番茄叶霉病菌抑制作用较强，抑菌带宽度分别为16.7mm和15.8mm，对番茄早疫病菌、辣椒根腐病菌和蜡质芽孢杆菌具有很强的抑制作用，抑菌带宽分别为14.6、12.1、11.3mm，对热带假丝酵母和产气肠杆菌抑制作用相对弱一些，抑菌带宽7.6mm和9.8mm。
实施例2链霉菌Lnu-13发酵液对甜瓜枯萎病的防治效果
将本发明获得的菌株Lnu-13在高氏一号斜面培养基上28℃培养，产生足量的孢子后制成孢子悬浮液，接种于发酵培养基，发酵培养基的组成如下：按重量百分比，玉米粉3.0％，花生饼粉2.0％，MgSO40.03％，NaCl 0.01％，CaCO30.2％，余量为水。28℃，180r/min振荡培养5天。发酵液7000r/min离心20min，上清液添加合适的载体制成粉剂进行田间防效实验。
甜瓜枯萎病菌用玉米砂培养基于26℃培养10天后，与灭菌细土等比例混合制成菌砂土，培养基质为灭菌泥炭和蛭石混合物，Lnu-13菌剂以1:400的比例拌与基质，每盆均匀拌入菌砂土5g,以0％多菌灵WP做对照。移栽长势一直的甜瓜健康幼苗，接种甜瓜枯萎病菌，20天后取苗，调查发病情况，计算防效。
本发明采用了生产中常用的抗真菌药剂多菌灵为阳性对照，实验结果显示，菌株Lnu-13的发酵液对甜瓜枯萎病具有很好的药效，防治效果可达71.1％。优于对照药剂50％多菌灵WP，而且经过Lnu-13处理的甜瓜幼苗长势明显好于其他处理，叶色浓绿，根系发达，说明Lnu-13对植株的生长有一定的促进作用。
表2

Claims (5)

1.一种抗生素产生菌，其特征在于：命名为链霉菌(Streptomyces sp.)Lnu-13，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2014555，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的链霉菌Lnu-13在抑制辣椒根腐病菌、番茄叶霉病菌、番茄早疫病菌、甜瓜枯萎病菌、金黄葡萄球菌、产气肠杆菌、蜡质芽孢杆菌及热带假丝酵母中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于方法如下：将链霉菌Lnu-13于发酵培养基中发酵，取发酵上清液，发酵上清液与基质混合使用制成粉剂，施于已感染有植物病原菌的植物根部。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的基质是泥炭和蛭石。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：发酵上清液与基质按重量比1:400混合。
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