CN104458975B - 一种应用于金花茶茶多酚、黄酮类成分检测的测试方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及固相萃取‑气相色谱‑质谱联用技术领域,提供了一种应用于金花茶茶多酚、黄酮类成分检测的测试方法,包括固相萃取吸附‑气相色谱‑质谱联用检测,所述固相萃取为直接搅拌方式搅拌棒固相萃取,所述搅拌棒涂有基于二维或三维的石墨烯‑聚合物涂层。所述石墨烯‑聚合物涂层的材料包括石墨烯及石墨烯改性材料,所述石墨烯改性材料包括氧化石墨烯、石墨烯‑聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、石墨烯‑聚吡咯、石墨烯‑聚甲基三甲氧基硅烷和石墨烯类纳米材料。本发明的应用于金花茶茶多酚、黄酮类成分检测的测试方法具有检测准确、灵敏度高、选择性吸附效果好和使用寿命长的特点。
Description
技术领域
本发明涉及固相萃取-气相色谱-质谱联用技术领域,特别涉及一种应用于金花茶茶多酚、黄酮类成分检测的测试方法。
背景技术
金花茶属于山茶科、山茶属,与茶、山茶、南山茶、油茶、茶梅等为孪生姐妹。金花茶的花金黄色,耀眼夺目,仿佛涂着一层蜡,晶莹而油润,似有半透明之感。金花茶单生于叶腋,花开时,有杯状的、壶状的或碗状的,娇艳多姿,秀丽雅致。以前,人们没有见到过花色金黄的种类。1960年,中国科学工作者首次在广西南宁一带发现了一种金黄色的山茶花,被命名为金花茶。国外称之为神奇的东方魔茶,被誉为“植物界大熊猫”、“茶族皇后”,是国家八种一级保护植物之一,广东梅州、广西防城港等地也有人工引种。
关于金花茶,《本草纲目》有载:“山茶产南方……又有一捻红,千叶红、千叶白等名,或云亦有黄色者”;广西《地方志》亦有记载:“金花茶,常绿灌木,生长在荒山野岭中”;“金花茶的叶和花,经加工可作名贵清热、治痢疾、去脂降压”。在两广地区民间,千百年来百姓广泛应用金花茶泡茶或煲汤以清热解毒,降脂降糖、利尿去湿、降压及提高免疫力等。
研究发现,金花茶叶和花中富含茶多酚,β-谷甾醇,花青素、总黄酮(异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷、双氢黄(醇)及新黄酮类等)、多种氨基酸、齐墩果酸、可溶性糖、天然维生素E、十八碳酸、邻苯二甲酸单(乙基己基)酯、山奈酚等天然活性成分及硒、锰、铁、锌等微量元素。
茶多酚,又叫茶单宁、茶鞣质,是茶叶中多酚类物质的总称,包括黄烷醇类(儿茶素) 、花色苷类(花青素和花白素)、酚酸类及缩酚酸类物质等。茶多酚为一类含有多酚羟基的化学物质, 能清除体内活性自由基,具有很强的抗氧化作用, 因此是一种很有前途的天然食品抗氧化剂。与传传统的抗氧化剂如抗氧剂264、丁基羟基茴香醚相比, 抗氧剂264、丁基羟基茴香醚作为抗氧化剂也具有许多优点, 但同时存在不同程度的毒性。而茶多酚作为天然抗氧化剂不但具有安全性高、无毒副作用等优点, 而且抗氧化能力也优于其他的诸如维生素E、维生素C等同类天然抗氧化剂, 因此已成为人们研究与开发的热点。
黄酮类化合物,又称类黄酮,是指基本母核为2-苯基色原酮类化合物,现在则泛指两个具有酚羟基的苯环通过中央三碳原子相互连接的一系列化合物,是一大类天然产物,广泛存在于植物界,是许多中草药的有效成分,也广泛自于水果、蔬菜、茶、葡萄酒、种子或是植物根。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇,其它包括双氢黄(醇)、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等。近年来,由于自由基生命科学的进展,使具有很强的抗氧化和消除自由基作用的类黄酮受到空前的重视。类黄酮参与了磷酸与花生四烯酸的代谢、蛋白质的磷酸化、钙离子的转移、自由基的清除、抗氧化活力的增强、氧化还原作用、螯合作用和基因的表达。
目前关于金花茶中茶多酚和总黄酮类活性成分研究大多局限在传统紫外光谱、色谱检测或溶剂浸提、膜分离等。在分析灵敏度、检测限、分离效率、实验结果重现性等方面存在一些不足,如分析灵敏度差、检测限高、分离效率低和实验结果重现性难度大等。
固相微萃取技术作为一种新型的样品预处理技术于1990年由Pawliszyn提出,由于其节省溶剂且操作简单快速,因此应用广泛。搅拌棒吸附萃取是一种新型的固相微萃取样品前处理技术,具有固定相体积大、萃取容量高、无需外加搅拌子、可避免竞争性吸附、能在自身搅拌的同时实现萃取富集等优点,广泛应用于食品、医药、环境和生物样品分析的前处理。
搅拌棒吸附萃取是一种非常适合低浓度样品富集的技术,只需要将外壁包裹着吸附材料的磁力吸附搅拌棒放入装有样品溶液的杯或瓶中,开动磁力搅拌器搅拌几分钟到十多分钟,富集后的活性有效成分就会被富集吸附在搅拌棒上。通过萃取搅拌棒的富集,可以具有分析多种浓度低于ppb的化合物的能力。
搅拌棒吸附萃取不需要大量的溶剂萃取,富集效率比固相微萃取高,因为动态搅拌富集,重复性也比固相萃取好,使用简单方便,适合金花茶活性成分分析,特别是半挥发或不挥发的茶多酚、总黄酮类成分,一般的吹脱捕集技术或顶空分析技术很难分析,但是,应用固相萃取技术分析上述组分具有较好的效果。该技术常与高效液相色谱、液相色谱-质谱、气相色谱-质谱、毛细管电泳等联用实现对有效成分的同步检测。
但是,搅拌棒固相萃取技术尽管优势明显,但是其性能很大程度取决于其涂层材料的性能。传统的搅拌棒固相微萃取所用的萃取纤维搅拌棒表面涂有的薄层吸附高分子材料多为全氟化树脂、聚吡咯、甲基乙烯基硅氧烷、环氧-聚二甲基硅氧烷等,这些材料往往价格较高且质地脆弱,在实际加工中需要通过加厚涂层保证吸附性能,涂层的加厚会造成既会降低检测灵敏度,又会提高搅拌棒涂层在实际操作过程中发生断裂的概率,在分析某些物质例如植物活性成分时还会出现样品在固相萃取涂层材料的遗留现象或基质干扰现象,严重影响检测的准确性。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题,结合金花茶成分检测的现状,针对搅拌棒固相萃取检测技术存在的问题,形成了一种应用于金花茶茶多酚、黄酮类成分检测的测试方法,具有检测准确、灵敏度高、选择性吸附效果好和使用寿命长的特点。
本发明的内容为:
一种应用于金花茶茶多酚、黄酮类成分检测的测试方法,包括固相萃取吸附-气相色谱-质谱联用检测,所述固相萃取为直接搅拌方式搅拌棒固相萃取,所述搅拌棒涂有基于二维或三维的石墨烯-聚合物涂层。
采用直接搅拌方式的搅拌棒固相萃取,操作方便,有效减少繁琐操作工序带来的累计误差。通过选用石墨烯作为搅拌棒的涂层材料,可以充分利用石墨烯具有的优异的力学性能、质量轻、比表面积大、杨氏模量和断裂强度大等特点,又可以利用其机械、力学、化学、电学性能优异,而且原料易得的优势。因此,采用石墨烯类纳米材料替代传统的应用在搅拌棒固相萃取技术的全氟化树脂等涂层材料,可以发挥石墨烯的理论比表面积为 2630 m2/g的优点,有效增大搅拌棒固相萃取涂层超大比表面。同时,石墨烯涂层材料与含苯环类物质如茶多酚、总黄酮等化合物之间存在着较强的π-π相互作用,因而对金花茶中该类物质具有较好的选择性萃取吸附效果。由于石墨烯涂层机械性能优异,使上述材料在高速旋转萃取耐磨性出色,材料杨氏模量和断裂强度大,可使搅拌棒使用寿命大大延长,从而大大有利于金花茶茶多酚、总黄酮活性成分检测结果的重现性。
进一步地,所述石墨烯-聚合物涂层的材料包括石墨烯及石墨烯改性材料,所述石墨烯改性材料包括氧化石墨烯、石墨烯-聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、石墨烯-聚吡咯、石墨烯-聚甲基三甲氧基硅烷和石墨烯类纳米材料。
进一步地,所述石墨烯-聚合物涂层的材料为以可再生资源碳化制备的活性碳通过改进型Hummers法及可逆加成-断裂链转移聚合方法合成的。
进一步地,所述石墨烯-聚合物涂层为纳米涂层。单层石墨烯往往仅有0.7-1.2nm厚,多层石墨烯涂层也仅有几个纳米厚,材料理论比表面积为 2630 m2/g,实际比表面400-800m2/g,,因而基于石墨烯的固相搅拌棒萃取吸附工艺可以获得更高的萃取量、更低的检出限和更好的重现性,可以实现对金花茶中茶多酚、总黄酮类活性成分的高灵敏、宽范围及良好重现性检测。
进一步地,所述可再生资源碳化制备的活性碳的原料包括稻草、甘蔗渣和玉米杆。
进一步地,所述石墨烯-搅拌棒萃取联用检测为选择性检测,所述选择性检测的活性成分包括茶多酚和总黄酮类。
进一步地,所述总黄酮类包括儿茶素、表儿茶素、花色苷、花青素、没食子酸、原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸酯、缩酚酸、黄烷-3、4-二醇、黄烷酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮、羟基-[4]-黄烷醇、 山柰素、山柰酚和槲皮素。
进一步地,进行萃取前的样品处理包括金花茶浓缩液的制备步骤。
本发明的有益效果是:
第一、检测准确,通过选用石墨烯作为搅拌棒涂层材料,采用选择性吸附代替竞争性吸附,有效提高检测的准确程度;
第二、灵敏度高,石墨烯材料是纳米级的薄层材料,可以显著增大吸附表面积,降低涂层的厚度,显著提高检测的灵敏度;
第三、选择性吸附效果好,石墨烯材料的选择性吸附为基于π-π共轭键作用,选择性强,分离效果好;
第四、使用寿命长,石墨烯材料的机械性能、力学性能优异,耐磨能力强,可以延长搅拌棒的使用寿命;
第五、维护成本低,直接进行选择性吸附,减少传统竞争性吸附繁琐的分离步骤,没有分离成本,大大节约日常使用和维护的检测成本。
具体实施方式
为了进一步理解本发明的内容,下面就发明内容和具体实施例进行具体的描述:
一种应用于金花茶茶多酚、黄酮类成分检测的测试方法,包括固相萃取吸附-气相色谱-质谱联用检测,所述固相萃取为直接搅拌方式搅拌棒固相萃取,所述搅拌棒涂有基于二维或三维的石墨烯-聚合物涂层。所述石墨烯-聚合物涂层的材料包括石墨烯及石墨烯改性材料,所述石墨烯改性材料包括氧化石墨烯、石墨烯-聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、石墨烯-聚吡咯、石墨烯-聚甲基三甲氧基硅烷和石墨烯类纳米材料。所述石墨烯-聚合物涂层为纳米涂层。
在石墨烯涂层材料的具体制备上,可以按照如下方法进行:
第一步、利用可再生资源碳化制备活性碳:选用可再生资源包括稻草、甘蔗渣和玉米杆,称取优选洗净后干燥的稻草、甘蔗渣或玉米杆,切段粉碎,过30目筛,放入瓷坩埚中,加入物质的量浓度为0.05 mol/L的氯化锌溶液作为活化剂,搅拌混匀, 将混匀的料液在室温下浸渍12 h。随后将浸渍好的料液放入马弗炉中,从室温开始以升温速率为10 ℃/min升至900 ℃, 保温一定时间后将活化好的试样从马弗炉中取出, 立即将试样倒入到一定浓度的盐酸水溶液中, 再将试样用水洗涤至pH值为7。再将洗涤好的试样放入电热鼓风烘箱中, 110 ℃烘干4 h, 在干燥器中静置冷却。最后将试样粉碎过300 目筛, 即得到稻草源活性炭粗品。上述粗品采用规格6000-8000的Cellu.sep透析袋,在pH为7.38的去离子水中透析约一周,真空干燥后即得活性炭纯样。
第二步、改进型Hummers法制备石墨烯氧化物:将第一步制得的活性炭进行过筛,筛目为300 目,称取并加入到浓 H2SO4、 K2S2O8 和 P2O5的混合物中,加热上述混合体系至80 ℃,保持该温度,磁力搅拌5小时。随后冷却反应体系至室温,将混合物倾入500mL去离子水中,静置过夜后将上述静置物经0.2微米滤膜过滤,洗涤并自然晾干,得预氧化石墨。将该预氧化的石墨加入到0℃的120ml的浓H2SO4中,随后,缓慢加入KMnO4,并控制反应温度在20 ℃搅拌。高锰酸钾加毕,控制反应体系在35 ℃搅拌4小时,随后,加入去离子水,并通过外围冰浴控制温度在50 ℃以下。搅拌1.5小时后,再加入去离子水,半小时后,逐滴滴入30% 的H2O2,反应体系迅速由棕色转变为棕黄色。撤去搅拌装置,过滤该棕黄混合物,用体积比为1: 10的HCl洗涤以除去金属离子,随后再用去离子水反复洗涤,得棕色固体,室温干燥后,将上述棕色固体制成质量浓度为0.5%的水分散液,连续透析一周,最后过滤,洗涤,重新分散超声1小时,过滤,60℃真空干燥24小时,即可制备得到石墨烯氧化物纳米片。将上述石墨烯氧化物纳米片重新分散于水中,超声30分钟后加入适量水合肼,100 ℃回流24小时,过滤,60 ℃真空干燥24小时,即可制备得到石墨烯纳米片。
第三步、石墨烯-聚合物的制备:活化内插管。准确量取一定质量的乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇6000、二甲基甲酰胺偶氮二异丁腈,超声涡旋至得到澄清的溶液。将石墨烯加入上述溶液,使其浓度为1.0 mg/mL,然后在循环水中超声30 min即得到分散均匀的溶液,取上述预聚液若干
灌入0.6 mL离心管中,插入内插管,排出溶液中的气泡。将其上端依次用封口胶与聚四氟乙烯生料带封口后,即可在微波炉中进行反应,微波反应结束后用医用镊子小心将键合有涂层的搅拌棒取出,依次用体积比为1:1的甲醇/水溶液和丙酮在60 ℃摇床上清洗涂层,涂层清洗完毕后保存于三次水中备用。
在应用在金花茶成分检测的石墨烯-搅拌棒萃取联用检测上,所述石墨烯-搅拌棒萃取联用检测为选择性检测,所述选择性检测的活性成分包括茶多酚和总黄酮类。所述总黄酮类包括儿茶素、表儿茶素、花色苷、花青素、没食子酸、原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸酯、缩酚酸、黄烷-3、4-二醇、黄烷酮、 黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮、羟基-[4]-黄烷醇、 山柰素、山柰酚和槲皮素。
进行萃取前的样品处理包括金花茶浓缩液的制备步骤。在具体操作上,金花茶浓缩液的制备可以按照如下方法进行:采摘春季新鲜的金花原叶,采用电子秤称重;对采摘的春季新鲜金花原叶进行筛选,遴选出最鲜嫩、最优质叶片,除去质量较差叶片;优选出的金花原叶原料必须符合《中华人民共和国药典》(2010年版)要求,无霉变、无异味、无杂质;将优选出金花茶原叶洗净后,用中药粉碎机粉碎,将粉碎后的金花原叶20公斤;加入95%以上的丙酮40-60L,利用索氏提取器提取5-6小时,得提取液A;提取后残渣加入50L左右95%以上的丙酮,在40-60℃条件下超声约1.5小时,得提取液B,合并提取液A和B,利用旋转蒸发仪旋转蒸发除去丙酮,得到有机相的金花茶浓缩液。
具体的实际检测可以按照如下步骤进行:
第一步、仪器及操作条件,设置气相色谱-质谱如下:气质联用系统为岛津2010 plus系列,包括A℃-20s自动进样器,GC-2010气相系统,QP2010 plus EI-Single-Quadrupoles 质谱检测器,色谱柱为Agilent GC Columns RxiTM-5ms,总长30 m,液膜厚度为0.25 μm,内径为0.25 mm。气相色谱条件:载气为高纯氦气,恒压模式,进样口温度290℃,进样模式为不分流进样,进样量为1μL,柱温程序:初始温度70 ℃,保持2 min,以15 ℃/min升至190 ℃,保持1 min,以10℃/min升至260 ℃,以5 ℃/min升至285 ℃,保持10 min。质谱条件:离子源温度为220 ℃,接口温度为280 ℃,检测电压为1.02 kv,溶剂切除时间为4.5 min,选择离子模式;
第二步、分析检测:随后将保存于三次水中的涂有石墨烯聚合物的搅拌棒浸入上述制备的金花茶叶浓缩液中,通过磁力搅拌搅拌10分钟,通过气相色谱-质谱系统分析不同组分保留时间和质谱碎片,得到金花茶中茶多酚、总黄酮类物质含量信息。
以上所述,仅为本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制;凡本行业的普通技术人员均可按说明书所示和以上所述而顺畅地实施本发明;但是,凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内,可利用以上所揭示的技术内容而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化,均为本发明的等效实施例;同时,凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等,均仍属于本发明的技术方案的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种应用于金花茶茶多酚、黄酮类成分检测的测试方法,包括固相萃取吸附-气相色谱-质谱联用检测,其特征在于:所述固相萃取为直接搅拌方式搅拌棒固相萃取,所述搅拌棒涂有基于二维或三维的石墨烯-聚合物涂层;
所述石墨烯-聚合物涂层为纳米涂层;所述石墨烯-搅拌棒萃取联用检测为选择性检测,所述选择性检测的活性成分包括茶多酚和总黄酮类。
2.根据权利要求1所述的应用于金花茶茶多酚、黄酮类成分检测的测试方法,其特征在于:所述石墨烯-聚合物涂层的材料包括石墨烯及石墨烯改性材料,所述石墨烯改性材料包括石墨烯-聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、石墨烯-聚吡咯和石墨烯-聚甲基三甲氧基硅烷。
3.根据权利要求2所述的应用于金花茶茶多酚、黄酮类成分检测的测试方法,其特征在于:所述石墨烯-聚合物涂层的材料为以可再生资源碳化制备的活性碳通过改进型Hummers法及可逆加成-断裂链转移聚合方法合成的。
4.根据权利要求3所述的应用于金花茶茶多酚、黄酮类成分检测的测试方法,其特征在于:所述可再生资源碳化制备的活性碳的原料包括稻草、甘蔗渣和玉米杆。
5.一种根据权利要求4所述的应用于金花茶茶多酚、黄酮类成分检测的测试方法在金花茶活性成分检测的应用,其特征在于:所述总黄酮类包括儿茶素、表儿茶素、花色苷、花青素、没食子酸、原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸酯、缩酚酸、黄烷-3、4-二醇、黄烷酮、 黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮、羟基-[4]-黄烷醇、 山柰素、山柰酚和槲皮素。
6.根据权利要求5所述的应用于金花茶茶多酚、黄酮类成分检测的测试方法在金花茶活性成分检测的应用,其特征在于:进行萃取前的样品处理包括金花茶浓缩液的制备步骤。
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