CN104458929B - 一种检测促性腺激素释放激素类似物和睾酮的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种促性腺激素释放激素类似物的组合物，其采用液相色谱与质谱联用技术测定，同时测定睾酮和促性腺激素释放激素类似物；另外提供一种方法能够同时成功检测样品中的睾酮和促性腺激素释放激素类似物，实现在使用促性腺激素释放激素类似物及其组合物后，同时检测其体内促性腺激素释放激素类似物和睾酮的含量及其变化过程。
Description
技术领域
本发明涉及一种促性腺激素释放激素类似物的组合物，其采用液相色谱与质谱联用技术测定，同时测定睾酮和促性腺激素释放激素类似物。
背景技术
促性腺激素释放激素(LHRH)，是丘脑下部弓状核合成的10肽，结构为Pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，下丘脑脉冲释放LHRH，可以刺激垂体释放促性腺激素释放激素，1971年Schall从50万头猪、羊下丘脑分离出几毫克的LHRH，并人工合成确证了LHRH的结构，因此获得诺贝尔医学与生理学奖。哺乳动物的LHRH具有相同的结构，LHRH的第5～6、6～7、9～10位氨基酸链稳定性差，极易受肽链内切酶作用而裂解，因而LHRH在体内半衰期仅有2～4min，如果将其6位和10位氨基酸进行置换或去除，可得到9肽LHRH激动剂(agonists)，其化学结构与LHRH极为相似，但稳定性大大提高，半衰期可达5h以上。LHRH激动剂和LHRH拮抗剂(antagonist)，统称LHRH类似物(LHRHa)，它们都是通过与内源性LHRH竞争受体而发挥作用。
促性腺激素释放激素类似物可因给药方式和用药剂量的不同而引起性腺轴的正反双向反应。生理脉冲式注射LHRH对垂体-性腺轴起兴奋与刺激作用，表现为升调节，促进青春期发育，对维持生殖系统的功能具有重要作用。但大量的动物实验及临床观察发现，当给予外源性大剂量的LHRH或其类似物时，对生殖系统有抑制作用。促性腺激素释放激素类似物最初会刺激垂体分泌促性腺激素(Gn),即黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)。当垂体经过长期的刺激后会进入不应期,促性腺激素的释放会减少,因而使性类固醇(睾酮)降低至去势水平。上述作用是可逆转的。临床上被用于治疗各种激素依赖性疾病如前列腺癌、子宫内膜异位、子宫肌瘤和性早熟等。
目前促性腺激素释放激素类似物组合物在临床上主要被用作治疗激素依赖性肿瘤如前列腺癌、乳腺癌等。市场上常用的有：①戈舍瑞林(Goserelin)，商品名诺雷德(Zoladex)；②亮丙瑞林,商品名抑那通(Leuprorelin)；③曲普瑞林(Triptorelin)，商品名达菲林(Diphereline)；④布舍瑞林(Buserelin)；⑤那法瑞林(Nafarelin)。
促性腺激素释放激素类似物组合物已上市的产品主要有注射剂和长效缓释制剂，其临床常用剂量非常低，临床应用的不良反应是由于激素的产生被抑制而可能引起的药理副作用，临床极低的用量，就可能引起极强的临床不良反应，因此临床治疗时应密切监测性类固醇血浆水平。检测药物体内浓度与药效指标参数变化，可以优化给药方案,可更有效发挥药物作用,提高临床疗效,这些情况都迫切需要建立一种操作简单，特异性好及高灵敏的检测技术。
促性腺激素释放激素类似物(如曲普瑞林、戈舍瑞林)目前多采用放射免疫进行定量，免疫法由于存在交叉反应，影响低浓度定量结果的准确性，并且其具有放射性，对检测人员有潜在的伤害可能；且其试剂盒非常昂贵，不适合临床及科研使用；睾酮的定量过程有液质联用分析和酶联免疫法。液质联用分析采用衍生化样品前处理，操作复杂，同时睾酮做为一种内源性化合物，从分析角度来说，使得分析更加复杂。如果需要同时获得睾酮和促性腺激素释放激素类似物的数据，目前采用的是同一时间段采集二个血浆样品，分别处理，分别测定(Pharmacokinetic/pharmacodynamic model of the testosterone effects oftriptorelin administered in sustained release formulations in patients withprostate cancer—Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics(2012),342(3),788-798)，此种处理使得样品前期处理的工作量大，批次之间可能会造成差异，采用不同检测数据之间统计分析也会有较大误差。
为了克服这些缺点，我们将睾酮和促性腺激素释放激素类似物同时提取出来，进一步采用液质联用来同时进行睾酮和促性腺激素释放激素类似物的定量分析。采用此分析过程能降低成本，减少工作量，操作简单、结果准确、特异性好、灵敏度高，极大的提高分析速度，减少结果偏差；给临床用药如给药间隔、剂量调整等提供准确指导，同时对促性腺激素释放激素类似物组合物设计提供更好的支持。
发明内容
针对现有技术存在的上述缺陷，本发明人进行深入研究，提供一种促性腺激素释放激素类似物的组合物，其采用液相色谱与质谱联用技术测定，同时测定睾酮和促性腺激素释放激素类似物，液相色谱的流动相采用含酸的水溶液-甲醇体系进行梯度洗脱，所述酸为丙酸；酸的体积百分浓度0.01-0.1％，优选为0.01-0.05％。
在液质联用测定血浆中促性腺激素释放激素类似物的过程中，血浆前处理对实验结果起到关键作用，本发明可采用固相萃取处理血浆样品，首次将睾酮和促性腺激素释放激素类似物萃取到一个样品单元中，为同时测定睾酮和促性腺激素释放激素类似物打下基础。
所述固相萃取过程采用的固相萃取柱可以根据促性腺激素释放激素类似物不同适当调整，如曲普瑞林可以采用活化好的StrataTM-X SPE固相萃取柱，戈舍瑞林可以采用活化好的HLB固相萃取柱。
在采用液质联用测定中，液相色谱流动相的选择具有非常重要的作用。本发明所述流动相的有机相选择甲醇，相比乙腈等其他有机溶剂，在测定促性腺激素释放激素类似物和睾酮时甲醇能够产生更高的响应值和较好的色谱行为；流动相的水相中添加酸可明显提高方法的灵敏度，其中添加丙酸比甲酸、乙酸等其他酸，可以显著提高灵敏度。
所述梯度洗脱含酸水溶液和甲醇的体积比具体如下表
本发明另一方面还涉及哺乳动物在使用促性腺激素释放激素类似物组合物后，检测体内促性腺激素释放激素类似物和睾酮含量变化及代谢的方法，其用于检测哺乳动物在使用促性腺激素释放激素类似物组合物后体内促性腺激素释放激素类似物的含量及其变化过程，和其药效参数睾酮的体内浓度变化过程的用途。方法采用液相色谱与质谱联用技术测定，同时测定睾酮和促性腺激素释放激素类似物，液相色谱的流动相采用含酸的水溶液-甲醇体系进行梯度洗脱，所述酸为丙酸；酸的体积百分浓度0.01-0.2％，优选为0.01-0.08％。方法可采用固相萃取处理血浆样品，采用的固相萃取柱可以根据促性腺激素释放激素类似物不同适当调整，如曲普瑞林可以采用活化好的StrataTM-X SPE固相萃取柱，戈舍瑞林可以采用活化好的HLB固相萃取柱。液相色谱梯度洗脱为，第一时间段含酸的水溶液A与甲醇B的体积比为75-95∶5-25，优选80：20；第二时间段A与B的体积比为30-50∶50-70，优选40：60；第三时间段A与B体积比为15-35∶65-85；第四时间段A与B的体积比为1-10∶90-99；第五时间段A与B的体积比为75-95∶5-25，优选80：20。通过本发明所述的方法能够同时成功检测样品中的睾酮和促性腺激素释放激素类似物，实现在哺乳动物使用促性腺激素释放激素类似物及其组合物后，同时检测其体内促性腺激素释放激素类似物和睾酮的含量及其变化过程。
本发明所述哺乳动物使用促性腺激素释放激素类似物组合物后，检测体内促性腺激素释放激素类似物和睾酮含量变化及代谢的方法，具有优于现有检测技术的灵敏度和特异性，可用于样品中同时检测睾酮和促性腺激素释放激素类似物，为确定促性腺激素释放激素类似物组合物在体内的药代和药效研究提供了有效的检测手段。本发明所述方法可用于促性腺激素释放激素类似物组合物的开发，在临床上测定使用促性腺激素释放激素类似物制剂的患者体内药物代谢动力学(PK)参数和药物效应动力学(PD)参数的变化，通过连续观察其动态变化能够为指导临床促性腺激素释放激素类似物组合物的合理使用提供实验依据。
所述体积百分浓度为100ml水中所含酸的体积(ml)数。
所述检测限是指在样品中能检出的被测组分的最低浓度(量)，即产生信号(峰高)为基线噪音标准差k倍时的样品浓度，一般将检测限定义为信噪比(S/N)3:1时的浓度。
所述定量限是指在样品中能检出的被测组分的浓度(量)，即产生信号(峰高)为基线噪音标准差k倍时的样品浓度，一般将定量限定义为信噪比(S/N)10:1时的浓度。
附图说明
图1曲普瑞林和睾酮在流动相为0.05％丙酸水溶液-甲醇的液质检测图谱
图2戈舍瑞林和睾酮在流动相为0.02％丙酸水溶液-甲醇的液质检测图谱
图3达菲林在大鼠血浆中的PK/PD曲线图谱
图4诺雷德在大鼠血浆中的PK/PD曲线图谱
具体实施方式
下面通过实施例对本发明加以进一步的说明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1流动相为0.02％丙酸水溶液-甲醇检测戈舍瑞林和睾酮标液
标准溶液样配制
精密称量醋酸戈舍瑞林对照品，以甲醇溶液配制成1.00mg/mL母液备用。睾酮储备液(100μg/mL)，均购买自美国Sigma公司。以甲醇-水-甲酸(60:40:0.08v/v/v)为稀释液，将睾酮和戈舍瑞林稀释成以下浓度的标准混合液,0.02+0.005、0.05+0.01、0.1+0.03、0.2+0.1和0.5+0.3ng/mL。
液相条件色谱柱：ZORBAX Eclipse plus C18(2.1mm x 50mm,1.8μm,Stockport,UK)流动相：A：0.02％丙酸水溶液，B：甲醇；流速：0.4mL/min，柱温：40℃，进样量：10μl。Agilent1290高效液相色谱系统，包括二元输液泵，自动进样器，柱温箱。梯度条件如下：
质谱条件：QTRAP5500型质谱仪，配有离子喷雾离子化源，美国Applied Biosystem公司，Analyst1.5.2数据处理软件
离子源：电喷雾电离源(ESI)，CAD：9，气帘气压力(CUR)：40psi，GS1：50，GS2：60，TEM：600℃；喷射电压：5500V，正离子方式检测；扫描方式为多反应监测(MRM)，用于定量分析的离子反应分别为：戈舍瑞林,m/z 635.4→607.3,睾酮m/z 289.3→97.0；戈舍瑞林DP电压为40V；CE电压为30eV；睾酮DP电压为87V；CE电压为26eV。
以此液相色谱及质谱条件对标准溶液样品检测，戈舍瑞林和睾酮检测限浓度分别为0.005和0.02ng/mL，检测响应值分别为247和4720cps，信噪比分别为4.7和5.0。具体液质检测图谱见图2。
实施例2流动相为0.02％丙酸水溶液-甲醇检测戈舍瑞林和睾酮-d3标液
标准溶液样品的配制同实施例1，配制时将睾酮替换成睾酮-d3。
液相条件色谱柱：ZORBAX Eclipse plus C18(2.1mm x 50mm,1.8μm,Stockport,UK)；流动相：A：0.02％丙酸水溶液，B：甲醇；流速：0.4mL/min，柱温：40℃，进样量：10μl。Agilent 1290高效液相色谱系统，包括二元输液泵，自动进样器，柱温箱。梯度条件如下：
| Time(min) | A | B |
| 0 | 90 | 10 |
| 1.8 | 90 | 10 |
| 2.2 | 35 | 65 |
| 2.8 | 30 | 70 |
| 3.8 | 30 | 70 |
| 4.5 | 8 | 92 |
| 5.0 | 90 | 10 |
| 7.0 | 90 | 10 |
质谱条件：QTRAP5500型质谱仪，配有离子喷雾离子化源，美国Applied Biosystem公司，Analyst1.5.2数据处理软件
离子源：电喷雾电离源(ESI)，CAD：9，气帘气压力(CUR)：40psi，GS1：50，GS2：60，TEM：600℃；喷射电压：5500V，正离子方式检测；扫描方式为多反应监测(MRM)，用于定量分析的离子反应分别为：戈舍瑞林,m/z 635.4→607.3,睾酮-d3,m/z 292.2→97.0,戈舍瑞林DP电压为40V；CE电压为30eV；睾酮-d3DP电压为87V；CE电压为26eV。
以此液相色谱及质谱条件对标准溶液样品检测，戈舍瑞林和睾酮-d3检测限浓度分别为0.005和0.02ng/mL，检测响应值分别为275和5029cps，信噪比分别为4.5和5.1。
实施例3流动相为0.05％丙酸水溶液-甲醇检测曲普瑞林和睾酮标液
标准溶液样品的配制同实施例1，将戈舍瑞林替换成曲普瑞林。
液相条件色谱柱：Eclipse plus RRHD C8(2.1mm x 50mm,1.8μm,Agilent)；流动相：A：0.05％丙酸水溶液，B：甲醇；流速：0.4mL/min，柱温：40℃，进样量：10μl。Agilent1290高效液相色谱系统，包括二元输液泵，自动进样器，柱温箱。梯度条件如下：
| Time(min) | A | B |
| 0 | 95 | 5 |
| 1.8 | 95 | 5 |
| 2.5 | 40 | 60 |
| 3.2 | 40 | 60 |
| 5.0 | 30 | 70 |
| 5.4 | 30 | 70 |
| 6.2 | 8 | 92 |
| 6.7 | 8 | 92 |
| 7.2 | 95 | 5 |
| 8.0 | 95 | 5 |
质谱条件：QTRAP5500型质谱仪，配有离子喷雾离子化源，美国Applied Biosystem公司
离子源：电喷雾电离源(ESI)，CAD：9，气帘气压力(CUR)：40psi，GS1：50，GS2：55，TEM：600℃；喷射电压：5000V，正离子方式检测；扫描方式为多反应监测(MRM)，用于定量分析的离子反应是分别为m/z 656.5→249.1(曲普瑞林)，289.2→97.0(睾酮)；曲普瑞林和睾酮DP电压分别是50和87V，CE电压分别为42和26eV。
以此液相色谱及质谱条件对标准溶液样品检测，曲谱瑞林和睾酮检测限浓度分别为0.005和0.02ng/mL，检测响应值分别为215和4960cps，信噪比分别为3.7和4.9，具体液质检测图谱见图2。
实施例4流动相为0.05％丙酸水溶液-甲醇测定曲普瑞林和睾酮-d3大鼠血浆标准曲线
血浆样品处理：取100μl内标溶液(10ng/mL亮丙瑞林和1.00ng/mL的睾酮-13C3标记物)、100μl大鼠血浆样品、然后加入100μl甲醇-水(60:40,水中含0.2％甲酸)于1.5mLEppendorf离心管中，加入500μl甲醇，涡流混合1min，离心10min(13500rpm.)，取上层所有溶液至另一含500μl水的2mL Eppendorf离心管中，混匀，加入已经活化好的StrataTM-X固相萃取柱，分别以1mL水和1mL甲醇-水(60:40,)洗杂质，1mL甲醇(含0.01％甲酸)洗脱，洗脱液置于50℃水浴，氮气吹干。100μl甲醇-水(60:40,水中含0.2％甲酸)溶解，涡流后取10μl进样至液质系统。
血浆标准曲线的制备：取100μl大鼠空白血浆样品于于Eppendorf离心管中，加入系列标准溶液，制备成血浆中曲谱瑞林浓度分别为0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10和30ng/mL；睾酮-d3浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1、3、10和30ng/mL的标准曲线，其余操作同“血浆样品处理”。
液相条件色谱柱：Eclipse plus RRHD C8(2.1mm x 50mm,1.8μm,Agilent)。流动相：A：0.05％丙酸水溶液，B：甲醇；流速：0.4mL/min，柱温：40℃，进样量：10μl。Agilent1290高效液相色谱系统，包括二元输液泵，自动进样器，柱温箱。梯度条件如下：
| Time(min) | A | B |
| 0 | 80 | 20 |
| 1.2 | 80 | 20 |
| 2.0 | 40 | 60 |
| 2.6 | 40 | 60 |
| 4.0 | 20 | 80 |
| 4.2 | 20 | 80 |
| 4.5 | 2 | 98 |
| 4.7 | 2 | 98 |
| 5.0 | 80 | 20 |
| 6.0 | 80 | 20 |
质谱条件：QTRAP5500型质谱仪，配有离子喷雾离子化源，美国Applied Biosystem公司
离子源：电喷雾电离源(ESI)，CAD：9，气帘气压力(CUR)：40psi，GS1：50，GS2：55，TEM：600℃；喷射电压：5000V，正离子方式检测；扫描方式为多反应监测(MRM)，用于定量分析的离子反应是分别为m/z 656.5→249.1(曲普瑞林)和605.5→249.1(亮丙瑞林)，睾酮289.2→97.0，睾酮-d3 292.2→97.2，内标睾酮-13C3为292.2→100.2；睾酮、睾酮-d3和睾酮-13C3DP电压是87V，CE电压分别为26eV.曲普瑞林和亮丙瑞林DP电压分别为50V和160V；CE电压分别为42eV和25eV。
以此液相色谱及质谱条件对标准溶液样品检测，曲谱瑞林和睾酮-d3在血浆中定量限分别为0.01和0.05ng/mL，其响应值分别为892和8960cps，信噪比分别为11.4和10.8。
实施例5流动相为0.02％丙酸水溶液-甲醇测定戈舍瑞林和睾酮-d3大鼠血浆标准曲线
血浆样品处理：取100μl内标溶液(10ng/mL阿拉瑞林和1.00ng/mL的睾酮-13C3标记物)、100μl大鼠血浆样品、然后加入100μl甲醇-水(60:40,水中含0.2％甲酸)于1.5mLEppendorf离心管中，加入500μl甲醇，涡流混合1min，离心10min(13500r.p.m.)，取上层所有溶液至另一含500μl水的2mL Eppendorf离心管中，混匀，加入已经活化好的HLB固相萃取柱，分别以1mL水和1mL甲醇-水(60:40,)洗杂质，1mL甲醇(含0.01％甲酸)洗脱，洗脱液置于50℃水浴，氮气吹干。100μl甲醇-水(60:40,水中含0.2％甲酸)溶解，涡流后取10μl进样至液质系统。
血浆标准曲线的制备：取100μl大鼠空白血浆样品于于Eppendorf离心管中，加入系列标准溶液，制备成血浆中曲谱瑞林浓度分别为0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10和30ng/mL；睾酮-d3浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1、3、10和30ng/mL的标准曲线，其余操作同“血浆样品处理”。
液相条件色谱柱：ZORBAX Eclipse plus C18(2.1mm x 50mm,1.8μm,Stockport,UK)。流动相：A：0.02％丙酸水溶液，B：甲醇；流速：0.4mL/min，柱温：40℃，进样量：10μl。Agilent1290高效液相色谱系统，包括二元输液泵，自动进样器，柱温箱。梯度条件如下：
| Time(min) | A | B |
| 0 | 80 | 20 |
| 1.8 | 80 | 20 |
| 2.2 | 40 | 60 |
| 2.8 | 30 | 70 |
| 3.8 | 30 | 70 |
| 4.5 | 5 | 95 |
| 5.0 | 80 | 20 |
| 7.0 | 80 | 20 |
质谱条件：QTRAP5500型质谱仪，配有离子喷雾离子化源，美国Applied Biosystem公司，Analyst1.5.2数据处理软件
离子源：电喷雾电离源(ESI)，CAD：9，气帘气压力(CUR)：40psi，GS1：50，GS2：60，TEM：600℃；喷射电压：5500V，正离子方式检测；扫描方式为多反应监测(MRM)，用于定量分析的离子反应分别为：戈舍瑞林,m/z 635.4→607.3,睾酮289.2→97.0，睾酮-d3,m/z292.2→97.0,阿拉瑞林，m/z584.5→249.1，睾酮-13C3，m/z292.2→100.2。睾酮、睾酮-d3、睾酮-13C3DP电压是87V，CE电压为26eV.戈舍瑞林和阿拉瑞林DP电压为40V；CE电压为32eV。
以此液相色谱及质谱条件对标准溶液样品检测，戈舍瑞林和睾酮-d3在血浆中定量限分别为0.01和0.05ng/mL，检测响应值分别为1092和8760cps，信噪比分别为11.9和10.7。
实施例6流动相为0.02％甲酸水溶液-甲醇检测曲普瑞林和睾酮
标准系列溶液样品,配制方法同实施例3。
液相色谱流动相:0.02％甲酸水溶液A-甲醇B，其它液相色谱及质谱条件同实施例3
以此液相色谱及质谱条件对标准溶液样品检测，曲普瑞林和睾酮最低检测线浓度分别为0.1和0.5ng/ml。
实施例7流动相为0.02％乙酸水溶液-甲醇检测戈舍瑞林和睾酮-d3
标准系列溶液样品,配制方法同实施例1,
液相色谱流动相:0.02％乙酸水溶液A-甲醇B，其它液相色谱及质谱条件同实施例1
以此液相色谱及质谱条件对标准溶液样品检测，戈舍瑞林和睾酮-d3浓度检测限浓度为0.01和1.0ng/ml，戈舍瑞林峰形拖尾。
实施例8流动相为0.01％三氟乙酸水溶液-甲醇检测曲普瑞林和睾酮
标准系列溶液样品，配制方法同实施例3
液相色谱流动相:0.01％三氟乙酸水溶液A-甲醇B，其它液相色谱及质谱条件同实施例3以此液相色谱及质谱条件对标准溶液样品检测，曲普瑞林和睾酮浓度检测限浓度分别为0.1和1.5ng/ml。
试验例1检测SD大鼠血浆中睾酮和曲普瑞林
试验药物：曲普瑞林微球(IPSEN公司生产，批号：C16453)。
试验动物：SD大鼠10只，月龄3个月左右，体重在250g左右，雄性。
试验方法：10只大鼠肌肉注射给药，给药剂量0.6mg/kg，给药容积为0.15mL/kg；分别于给药前(0小时)及给药后0.5h、1h、6h、1d、2d、3d、4d、7d、14d、21d、28、35d、和42d采血。
标准曲线的制备：取100μl大鼠空白血浆样品于于Eppendorf离心管中，加入系列标准溶液，制备成血浆中曲普瑞林浓度分别为0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10和30ng/mL；睾酮浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1、3、10和30ng/mL的标准曲线，其余操作同“血浆样品处理”。
血浆样品处理：取100μl内标溶液(10ng/mL亮丙瑞林和1.00ng/mL的睾酮-13C3标记物)、100μl大鼠血浆样品、然后加入100μl甲醇-水(60:40,水中含0.2％甲酸)于1.5mLEppendorf离心管中，加入500μl甲醇，涡流混合1min，离心10min(13500rpm)，取上层所有溶液至另一含500μl水的2mL Eppendorf离心管中，混匀，加入已经活化好的StrataTM-X固相萃取柱，分别以1mL水和1mL甲醇-水(60:40,)洗杂质，1mL甲醇(含0.01％甲酸)洗脱，洗脱液置于50℃水浴，氮气吹干。100μl甲醇-水(60:40,水中含0.2％甲酸)溶解，涡流后取10μl进样至液质系统。
液相-质谱串联检测条件同实施例4
试验结果：PK/PD图谱见图3
结果表明：该方法可以在大鼠体内同时检测出睾酮、曲普瑞林，检测限、定量限符合实验要求，满足该类组合物在大鼠体内PK/PD的研究需要。
试验例2检测SD大鼠血浆中睾酮和戈舍瑞林
试验药物：戈舍瑞林缓释植入剂(产品批号：JB826；分装批号：1210139)。
试验动物：SD大鼠10只，月龄3个月左右，体重在250g左右，雄性。
试验方法：10只大鼠皮下注射给药，给药剂量0.9mg/只；分别于给药前(0小时)及给药后0.5h、1h、6h、1d、2d、3d、4d、9d、11d、13d、15d、18d、21d和28d采血。
标准曲线的制备：取100μL大鼠空白血浆样品于Eppendorf离心管中，加入系列标准溶液，制备成血浆中戈舍瑞林浓度分别为0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10和30ng/mL；睾酮-d3浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1、3、10和30ng/mL的标准曲线，其余操作同“血浆样品处理”。
血浆样品处理：取100μl内标溶液(10ng/mL阿拉瑞林和1.00ng/mL的睾酮-13C3标记物)、100μL大鼠血浆样品、然后加入100μl甲醇-水(60:40,水中含0.2％甲酸)于1.5mLEppendorf离心管中，加入500μL甲醇，涡流混合1min，离心10min(13500rpm)，取上层所有溶液至另一含500μL水的2mL Eppendorf离心管中，混匀，加入已经活化好的HLB固相萃取柱，分别以1mL水和1mL甲醇-水(60:40,)洗杂质，1mL甲醇(含0.01％甲酸)洗脱，洗脱液置于50℃水浴，氮气吹干。100μl甲醇-水(60:40,水中含0.2％甲酸)溶解，涡流后取10μL进样至液质系统。
液相-质谱串联检测条件同实施例5
试验结果：PK/PD图谱见图4
结果表明：该方法可以在大鼠体内同时检测出睾酮、戈舍瑞林，检测限、定量限符合实验要求，满足该类组合物在大鼠体内PK/PD的研究需要。
Claims (9)
1.一种液相色谱与质谱联用技术检测促性腺激素释放激素类似物和睾酮的测定方法，其特征在于，所述测定方法为同时测定促性腺激素释放激素类似物和睾酮，液相色谱的流动相采用含酸的水溶液-甲醇体系进行梯度洗脱，所述酸为丙酸，酸的体积百分浓度为0.02％，液相条件的色谱柱为Eclipse plus C18 column，所述梯度洗脱具体为：0-1.8分钟，含酸的水溶液A与甲醇B的体积比为80∶20；2.2-2.3分钟，A与B的体积比为40∶60；2.8-3.8分钟，A与B体积比为30∶70,4.5-4.6分钟，A与B的体积比为5∶95；5.0-7.0分钟，A与B的体积比为80∶20。
2.一种液相色谱与质谱联用技术检测促性腺激素释放激素类似物和睾酮的测定方法，其特征在于，所述测定方法为同时测定促性腺激素释放激素类似物和睾酮，液相色谱的流动相采用含酸的水溶液-甲醇体系进行梯度洗脱，所述酸为丙酸，酸的体积百分浓度为0.05％，液相条件的色谱柱为Eclipse plus RRHD C8 column，所述梯度洗脱具体为：0-1.8分钟，含酸的水溶液A与甲醇B的体积比为95∶5；2.5-3.2分钟，A与B的体积比为40∶60；5.0-5.4分钟，A与B体积比为30∶70,6.2-6.7分钟，A与B的体积比为8∶92；7.2-8.0分钟，A与B的体积比为95∶5。
3.一种液相色谱与质谱联用技术检测促性腺激素释放激素类似物和睾酮的测定方法，其特征在于，所述测定方法为同时测定促性腺激素释放激素类似物和睾酮，液相色谱的流动相采用含酸的水溶液-甲醇体系进行梯度洗脱，所述酸为丙酸，酸的体积百分浓度为0.05％，液相条件的色谱柱为Eclipse plus RRHD C8 column，所述梯度洗脱具体为：0-1.2分钟，含酸的水溶液A与甲醇B的体积比为80∶20；2.0-2.6分钟，A与B的体积比为40∶60；4.0-4.2分钟，A与B体积比为20∶80,4.5-4.7分钟，A与B的体积比为2∶98；5.0-6.0分钟，A与B的体积比为80∶20。
4.根据权利要求1-3任一项所述的测定方法，其特征在于所述促性腺激素释放激素类似物为戈舍瑞林。
5.根据权利要求1-3任一项所述的测定方法，其特征在于所述促性腺激素释放激素类似物为曲普瑞林。
6.根据权利要求1-3任一项所述的测定方法，其特征在于测定时采用的组合物检测样品为血浆样品，采用固相萃取处理。
7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于质谱的离子源为电喷雾电离源(ESI)，CAD：9，气帘气压力(CUR)：40psi，GS1：50，GS2：60，TEM：600℃。
8.根据权利要求2-3任一项所述的测定方法，其特征在于质谱的离子源为电喷雾电离源(ESI)， CAD：9，气帘气压力(CUR)：40psi，GS1：50，GS2：55，TEM：600℃。
9.根据权利要求1-3任一项所述的测定方法，其用于检测哺乳动物在使用促性腺激素释放激素类似物组合物后体内促性腺激素释放激素类似物的含量及其变化过程，和其药效参数睾酮的体内浓度变化过程的用途。
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