CN104434924B - 曲美替尼在制备逆转肿瘤多药耐药性药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物应用技术领域，公开了曲美替尼在制备逆转肿瘤多药耐药性药物中的应用。曲美替尼可显著逆转由膜转运蛋白介导的肿瘤多药耐药性，使得P‑糖蛋白高表达细胞恢复对抗癌药物的敏感性。所述逆转肿瘤多药耐药性药物可将曲美替尼与抗癌药物合用，通过恢复抗性细胞对抗癌药物的敏感性，达到抗性肿瘤的治疗与控制效果。

Description

曲美替尼在制备逆转肿瘤多药耐药性药物中的应用
技术领域
本发明属于药物应用技术领域，具体涉及一种曲美替尼在制备逆转肿瘤多药耐药性药物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤是我国攻关的重点疾病之一。肿瘤治疗过程中的一大缺点是肿瘤细胞对常规抗癌化疗药产生原发或诱发性的耐药性，导致临床化疗失败。肿瘤细胞在化疗的过程中长期接触某一种化疗药物，不仅会产生对这一药物的抗性，还会对其他结构和功能不同的多种化疗药物产生交叉抗性，这种现象被称作多药耐药(MDR)。因此，肿瘤耐药基因的表达和逆转MDR的研究成为肿瘤治疗亟待解决的问题。MDR的发生与多种因素有关，目前研究最广泛的是ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC)转运蛋白，目前已经明确了49种ABC转运蛋白，都有共同的ATP结合域，水解ATP释放能量将药物泵出膜外，这些膜转运蛋白降低了多药耐药肿瘤细胞内抗肿瘤药物的积累和滞留，使药物浓度低于治疗浓度的阈值，因为限制了肿瘤细胞的杀灭。哺乳动物中相关转运蛋白分子水平的研究，已能分离和描述多种转运蛋白的基因编码，主要的三种转运蛋白包括P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)和乳腺癌耐药蛋白(BCRP)。P-糖蛋白是一种能量依赖性药泵，可以将药物从胞内泵至胞外，从而降低药物在MDR细胞内的浓度进而导致治疗失败，其耐药谱主要为来源于天然的抗癌药物，如蒽环类、长春碱类、鬼臼毒素类、紫杉醇类等。
理论上，克服多药耐药有两种途径，一是开发对MDR细胞不具有抗药性的新抗癌药物；二是寻找MDR逆转剂与抗癌药物合用，恢复MDR细胞对抗癌药物的敏感性。后者是一种较为有前景的想法。P-gp并不是肿瘤细胞特有的，在正常组织细胞如肝、肾、肠等也表达MDR，其生理功能与解毒和分泌有关。近几年，有人同时去除小鼠的多药耐药基因mdr1a和mdr1b，结果小鼠仍然可以健康存活，这表明P-gp并不是动物基本生理功能所必须的成分。已有报道P-gp的抑制剂与抗癌药物合用能抑制多药耐药基因的表达和降低对阿霉素抗药性的诱发率。这表明在肿瘤细胞出现抗药性前，逆转剂与抗癌药物合用也有补益。
人们为了寻找有效的逆转剂进行了广泛的研究。1982年钙通道的阻断剂维拉帕米Verapamil(VRP)被发现具有体外逆转MDR的作用，标志着第一代MDR逆转剂产生，但由于其心血管的毒副作用，使其达不到具有逆转MDR作用的血药浓度而不能用于体内逆转MDR。类似的研究还有钙调素的抑制剂、环孢霉素A及多种多样的亲脂性阳离子化合物等。以瑞士Ssdonz公司开发的PSC833为代表的MDR逆转剂的问世，标志着第二代MDR逆转剂产生。第二代逆转剂较第一代逆转剂活性强，毒性低，体内也具有逆转MDR作用，但在临床应用未见光辉前景。由于这类化合物影响着抗癌药物的血药动力学，为了降低抗癌药物的副作用至可耐受程度，这类逆转剂与抗癌药物合用，必须减少抗癌药物的给药量至常规用量以下，这也就限制了抗癌药物本身的抗癌效果。
新一代的逆转剂，除了必须高效低毒外，还必须考虑逆转剂对抗癌药物吸收、代谢、排泄的影响。新近，有报道化合物OC144-93具有强的逆转活性，其作用机理主要是与P-gp结合，从而影响P-gp的药泵功能。这种化合物不影响抗癌药物的药代动力学，因此，抗癌药物与这类化合物合用时，抗癌药不需减量，这标志着第三代MDR逆转剂的出现。
曲美替尼(Trametinib)是激酶MEK1和MEK2的小分子抑制剂，2013年被美国FDA批准用于治疗黑色素瘤，作为一种单药口服片剂，适用于携带原癌基因BRAF V600E或V600K突变的手术不可切除性黑色素瘤或转移性黑色素瘤成人患者的治疗，已在临床广泛应用，但现有技术中并未研究曲美替尼的逆转肿瘤多药耐药的作用。
发明内容
为了解决上述现有技术的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种曲美替尼在制备逆转肿瘤多药耐药性药物中的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
曲美替尼在制备逆转肿瘤多药耐药性药物中的应用。Trametinib能够逆转多药耐药细胞的抗药性，即Trametinib能够恢复P-gp介导的MDR细胞对传统抗癌药物的敏感性，为耐药肿瘤治疗的药物开发开辟一条崭新的途径。
所述的逆转肿瘤多药耐药性药物含有抗癌药物成分。
上述逆转肿瘤多药耐药性药物还包括载体和助剂。
上述逆转肿瘤多药耐药性药物的剂型包括片剂、颗粒、胶囊、口服液或注射液。
所述的抗癌药物是指含有长春碱类、蒽环类、紫杉醇类、喜树碱类、鬼臼毒素类抗癌药物中的一种或两种以上的药物。
所述的长春碱类化合物优选硫酸长春地辛、硫酸长春新碱或长春新碱；蒽环类化合物优选米托蒽醌或阿霉素；紫杉醇类化合物优选紫杉醇或多西他赛；喜树碱类化合物优选拓扑替康；鬼臼毒素类化合物优选依托泊苷或替尼泊苷。
所述载体优选自乳糖、淀粉、明胶、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和水中的一种或两种以上。
所述的助剂包括崩解剂、润滑剂和助溶剂中的一种或两种以上。
所述的崩解剂优选微晶纤维素；润滑剂优选滑石粉、胶体硅胶、硬脂酸甘油酯、硬脂酸钙或镁粉；助溶剂优选甲磺酸、富马酸、甘露醇、山梨醇单月桂酸酯、单硬脂酸酯或单油酸酯。
本发明通过耐药细胞株进行体外和体内实验，从功能、细胞、蛋白等多个水平进行实验，发现曲美替尼能够特异性的有效逆转P-gp介导的肿瘤多药耐药，从而得出曲美替尼能够恢复MDR细胞对P-gp耐药谱，如长春碱类、蒽环类、紫杉醇类、喜树碱类、鬼臼毒素类抗癌药物的敏感性。
将曲美替尼与抗癌药物共同作用于P-gp高表达的耐药细胞(KBV200)株及其亲本细胞(KB)株上，从功能、细胞、蛋白等多个层次评价曲美替尼逆转肿瘤MDR的效果。应用MTT比色法检测曲美替尼对耐药细胞(KBV200)和亲本细胞(KB)的细胞毒性；将曲美替尼与抗癌药物共同作用，检测其恢复耐药细胞对抗癌药物敏感性的效果；检测曲美替尼在P-gp耐药细胞中介导的细胞周期阻滞及凋亡；应用Western Blot检测曲美替尼对耐药细胞中蛋白表达水平的影响；应用激酶反应检测曲美替尼对P-gp的ATP酶活性的影响；应用体外移植瘤实验探究曲美替尼体内逆转P-gp介导的耐药细胞的耐药性。
本发明的应用具有如下优点及有益效果：
(1)曲美替尼能够显著逆转耐药细胞的多药耐药性，显著恢复耐药细胞对抗癌药物的敏感性；
(2)曲美替尼与抗癌药物合用可以诱导耐药细胞的G2/M期阻滞进而引起显著的耐药细胞凋亡；
(3)在体内试验中，曲美替尼可以显著增加抗癌药物对耐药细胞移植瘤的生长抑制作用。
附图说明
图1～2分别为曲美替尼配合抗癌药物长春新碱对KB和KBV200细胞生存率影响曲线；
图3为曲美替尼对KB和KBV200细胞生存率影响曲线；
图4～5分别为曲美替尼配合抗癌药物长春新碱相比单独情况下和空白对照组，KB和KBV200细胞的周期分布情况和细胞周期分布情况柱状图；
图6～8分别为曲美替尼配合抗癌药物长春新碱相比单独情况下和空白对照组，KB和KBV200细胞的早期和晚期凋亡情况、早期和晚期细胞凋亡情况柱状图和相关蛋白表达情况；
图9～11分别为曲美替尼配合抗癌药物长春新碱相比单独情况下和空白对照组，实验小鼠肿瘤大小对照图、肿瘤体积变化图和瘤重对比图；
图12为曲美替尼配合抗癌药物长春新碱相比单独情况下和空白对照组，实验小鼠体重变化图；
图13～14分别为曲美替尼配合抗癌药物阿霉素对KB和KBV200细胞生存率影响曲线；
图15为曲美替尼对P-gp的ATP酶活性影响曲线；
图16为不同时间下曲美替尼对KB和KBV200细胞中P-gp表达情况的影响。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例中所用亲本细胞(KB)为人口腔表皮样癌细胞(中国科学院细胞资源中心，3111C0001CCC000163)；P-gp高表达细胞(KBV200)是以KB细胞为亲本，通过诱变剂甲基磺酸乙酯刺激，然后在培养液中加入浓度递增的长春新碱诱导而得，在长春新碱浓度为200nM时生长良好，较KB细胞对长春新碱耐药约100倍。
实施例1
(a)曲美替尼能够显著恢复耐药细胞对抗癌药物长春新碱的敏感性
分别将亲本细胞(KB)和P-gp高表达细胞(KBV200)种于96孔板中(5000个/孔)，4小时细胞贴壁完全以后，将长春新碱分浓度梯度加入相应孔中，加药体积差异用磷酸盐缓冲液(PBS)补齐，72小时后，每孔加入0.5mg/ml的噻唑蓝(MTT)10μL，37℃孵育4小时后，吸去培养液，晾干后每孔加入50μL的二甲基亚砜(DMSO)溶解结晶，酶标仪570nm处测量OD值；将不同浓度(1μM、3μM和10μM)的曲美替尼与梯度浓度的长春新碱组合后，重复上述过程，并设置10μM维拉帕米与长春新碱组合的对照，计算各组IC50，结果如表1所示。由表1结果可以看出，曲美替尼可以显著逆转耐药细胞对长春新碱的多药耐药性，在10μM的浓度下，曲美替尼的逆转效果接近传统逆转剂维拉帕米的2倍。
记录以上各组细胞的生存率，研究各组条件对KB和KBV200细胞生存率影响，结果分别如图1和图2所示。单独的曲美替尼在不同浓度下对KB和KBV200细胞生存率影响如图3所示。由图中结果可以看出，曲美替尼与长春新碱的组合相比空白组和对照组对亲本细胞的生存率影响并不明显，但耐药细胞的生存率在加入曲美替尼或逆转剂维拉帕米后显著降低，而单独使用曲美替尼时，其对KB和KBV200细胞生存率影响并无明显差别，这说明曲美替尼显著提高了耐药细胞对长春新碱抗癌药物的敏感性，从而显著提高了长春新碱对耐药细胞的杀灭效果。
表1曲美替尼逆转耐药细胞对长春新碱的多药耐药性效果比较
(b)曲美替尼可增敏耐药细胞中长春新碱引起的G2/M期阻滞
分别将KB和KBV200细胞种于6孔板中(3×105个/孔)，加入10μM的曲美替尼与抗癌药物长春新碱(KB，0.03μM；KBV200，0.3μM)，48小时以后收集细胞，DMEM培养液(含10％FBS)洗一次，PBS洗两次，70％乙醇冰上固定两个小时。离心收集细胞，冰预冷的PBS洗两次，300μL碘化丙啶(20μg/ml)避光室温孵育30分钟，200目尼龙网过滤后流式细胞仪检测各组细胞周期分布情况，并设置空白组、长春新碱组和曲美替尼组作为对照，结果如图4和图5所示，图4为各组流式细胞仪分析周期分布情况；图5为每组细胞周期分布情况柱状图。由图中结果可看出，曲美替尼与抗癌药物长春新碱合用组在KBV200细胞中可以引起明显的G2/M期阻滞，而对KB和各对照组则无明显变化，细胞被阻滞在G2/M期后，会诱导凋亡，这从细胞生长方面证明了曲美替尼可以显著增加抗癌药物长春新碱诱导的KBV200细胞凋亡。
(c)曲美替尼在耐药细胞中可增敏长春新碱诱导细胞凋亡
分别将KB和KBV200细胞种于6孔板中(3×105/孔)，加入10μM的曲美替尼与抗癌药物长春新碱(KB，0.03μM；KBV200，0.3μM)，48小时以后收集细胞，PBS洗一次，1×binding Buffer洗一次后，195μL的1×binding Buffer重悬细胞后加入5μl Annexin V-FITC，室温避光孵育10分钟，然后1×bindingBuffer洗一次后190μL重悬，加入10μL碘化丙啶，轻柔混匀后200目尼龙网过滤，流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况；应用Western Blot技术检测P-糖蛋白(P-gp)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(pERK)及凋亡相关蛋白表达情况，并设置空白组、长春新碱组和曲美替尼组作为对照，结果如图6～8所示。图6为流式细胞仪检测KB和KBV200细胞株各组细胞的早期和晚期凋亡情况；图7为各组早期和晚期细胞凋亡情况柱状图；图8为Western Blot检测P-糖蛋白(P-gp)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(pERK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、细胞凋亡抑制蛋白XIAP和聚(腺苷二磷酸-核糖)多聚酶(PARP)的表达情况。由图6和图7可看出，曲美替尼在KBV200细胞中可增敏长春新碱的作用而引起明显的细胞凋亡；图8中曲美替尼与长春新碱合用组相比其他组出现了明显的细胞凋亡抑制蛋白XIAP的下调和聚(腺苷二磷酸-核糖)多聚酶(PARP)裂解条带(C-PARP)，这从蛋白层次证实了该组出现了明显的细胞凋亡，而曲美替尼与长春新碱合用组相比其他组在P-糖蛋白表达量上并未有明显区别，这说明曲美替尼是通过抑制P-糖蛋白的功能而不是改变其表达而引起细胞凋亡。
(d)曲美替尼和长春新碱对KBV200细胞移植瘤生长抑制作用的动物体内实验
将KBV200细胞用DMEM培养液将细胞浓度调整至3×107/ml，在Balb/c雌性裸鼠的腋下皮下注射100μL，当移植瘤长至直径约为0.5cm时，随机分为四组：对照组，长春新碱组(0.1mg/kg，每两天一次，注射)，曲美替尼组(3mg/kg，每两天一次，口服)，长春新碱加曲美替尼组。给药期间，每两天称量体重和测量肿瘤体积并记录，给药21天后，安乐处死小鼠，称量每只小鼠的瘤重并记录。肿瘤体积的计算公式为：V＝π/6(A+B)3/2(A为肿瘤长边，B为肿瘤宽边)，结果如表2和图9～11所示。由以上结果可以看出，在KBV200细胞移植瘤模型鼠中，曲美替尼可增敏长春新碱的作用而显著抑制移植瘤的生长，小鼠体重变化如图12所示，由图中可看出各组小鼠体重并无明显差异，表明曲美替尼并无明显的体内毒副作用。因此，曲美替尼可作为一种安全有效的多药耐药逆转剂。
表2曲美替尼对KBV200移植瘤生长的抑制作用
实施例2
曲美替尼能够显著恢复耐药细胞对抗癌药物阿霉素的敏感性
分别将亲本细胞(KB)和P-gp高表达细胞(KBV200)种于96孔板中(5000个/孔)，4小时细胞贴壁完全以后，将阿霉素分浓度梯度加入相应孔中，加药体积差异用磷酸盐缓冲液(PBS)补齐，72小时后，每孔加入0.5mg/ml的噻唑蓝(MTT)10μL，37℃孵育4小时后，吸去培养液，晾干后每孔加入50μL的二甲基亚砜(DMSO)溶解结晶，酶标仪570nm处测量OD值；将不同浓度(1μM、3μM和10μM)的曲美替尼与梯度浓度的阿霉素组合后，重复上述过程，并设置10μM维拉帕米与阿霉素组合的对照，计算各组IC50，结果如表3所示。由表3结果可以看出，曲美替尼可以显著逆转耐药细胞对阿霉素的多药耐药性，在10μM的浓度下，曲美替尼的逆转效果达到传统逆转剂维拉帕米的2倍以上。
记录以上各组细胞的生存率，研究各组条件对KB和KBV200细胞生存率影响，结果分别如图13和图14所示。由图中结果可以看出，曲美替尼与阿霉素的组合相比空白组和对照组对亲本细胞的生存率影响并不明显，但耐药细胞的生存率在加入曲美替尼或逆转剂维拉帕米后显著降低，而单独使用曲美替尼时，其对KB和KBV200细胞生存率影响并无明显差别，这说明曲美替尼显著提高了耐药细胞对阿霉素抗癌药物的敏感性，从而显著提高了阿霉素对耐药细胞的杀灭效果。
表3曲美替尼逆转耐药细胞对阿霉素的多药耐药性效果比较
实施例3
曲美替尼对P-gp的ATP水解酶活性影响
P-gp的转运依赖于ATP的水解驱动。逆转剂与P-gp相互作用会影响ATP水解酶活性，应用P-gp分析系统(Promega，CAT：V3601)进行检测，P-gp首先与底物共同孵育，再添加入一定量的ATP随后终止P-gp的ATP水解反应，剩余未被水解酶代谢的ATP通过荧光素酶反应体系被检测出来。与无底物组相比，荧光信号减弱越多代表被P-gp消耗的ATP越多，因此信号降低的越多，P-gp活性越高；反之，信号的增强表明ATP水解活性被抑制。在本实验中，以不同浓度的曲美替尼为底物实验组，实验步骤如下：
(1)用分析缓冲液分别稀释曲美替尼(浓度分别为0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30μM)，同时将P-gp稀释至1.25mg/ml，均放于冰上待用；
(2)取96孔板，标号加入相应底物和P-gp，置于冰上，各组有三个复孔，37℃孵育5分钟；
(3)96孔板取出，置于冰上，每孔加10μL三磷酸腺苷镁Mg ATP(25mM)，37℃孵育40分钟；
(4)取出96孔板，每孔加入50μL ATP检测试剂，室温反应20分钟让荧光信号生成，多功能酶标仪检测发光强度，结果如图15所示。
由图15可以看出，曲美替尼的加入可以显著抑制ATP水解酶活性，这证明了曲美替尼是通过抑制P-gp的转运功能恢复耐药细胞对抗癌药物的敏感性。将KB和KBV200细胞分别种于六孔板中(3×105个/孔)，分别在培养的1、6、24、48和72小时加入10μM曲美替尼，收取细胞，蛋白裂解液裂解得到蛋白，应用Western Blot技术检测P-gp表达情况，结果如图16所示。由图中结果可以看出，经过曲美替尼处理的细胞P-糖蛋白表达量并无明显变化，这再一次证明了曲美替尼是抑制P-糖蛋白的功能而不是改变其表达量，通过抑制P-糖蛋白的功能使抗癌药物恢复对耐药细胞的敏感性，恢复抗癌药物对耐药细胞的治疗效果。
通过该实施例可得到的结果是，曲美替尼可逆转P-糖蛋白介导的肿瘤多药耐药，恢复MDR细胞对P-gp耐药谱，如长春碱类、蒽环类、紫杉醇类、喜树碱类和鬼臼毒素类抗癌药物的敏感性。
实施例4
本实施例的一种逆转肿瘤多药耐药性药物的制备，具体制备步骤如下：
按质量份计，将曲美替尼12份、抗癌药物长春新碱14份与载体明胶60份以及崩解剂微晶纤维素20份混合均匀，加水30份润湿，然后在制粒机中进行颗粒化并进行干燥，干燥颗粒随后再加入崩解剂微晶纤维素15份和润滑剂硬脂酸钙0.8份进行混合均匀压片，压片以每片100mg进行分装，得到片剂逆转肿瘤多药耐药性药物。
实施例5
本实施例的一种逆转肿瘤多药耐药性药物的制备，具体制备步骤如下：
按质量份计，将曲美替尼10份、抗癌药物阿霉素8份和助溶剂甘露醇50份加入100份水中溶解均匀，过滤后灭菌灌装，得到逆转肿瘤多药耐药性药物的注射溶液。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.曲美替尼在制备逆转肿瘤多药耐药性药物中的应用，其特征在于：所述的逆转肿瘤多药耐药性药物包含抗癌药物成分；所述的抗癌药物是指含有长春碱类、蒽环类、紫杉醇类、喜树碱类、鬼臼毒素类药物中的一种或两种以上的药物。
2.根据权利要求1所述的曲美替尼在制备逆转肿瘤多药耐药性药物中的应用，其特征在于：所述的逆转肿瘤多药耐药性药物还包括载体和助剂。
3.根据权利要求1所述的曲美替尼在制备逆转肿瘤多药耐药性药物中的应用，其特征在于：所述的逆转肿瘤多药耐药性药物的剂型为片剂、颗粒、胶囊、口服液或注射液。
4.根据权利要求1所述的曲美替尼在制备逆转肿瘤多药耐药性药物中的应用，其特征在于：所述的长春碱类药物是指硫酸长春地辛、硫酸长春新碱或长春新碱；所述的蒽环类药物是指米托蒽醌或阿霉素；所述的紫杉醇类药物是指紫杉醇或多西他赛；所述的喜树碱类药物是指拓扑替康；所述的鬼臼毒素类药物是指依托泊苷或替尼泊苷。
5.根据权利要求2所述的曲美替尼在制备逆转肿瘤多药耐药性药物中的应用，其特征在于：所述的载体是指乳糖、淀粉、明胶、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和水中的一种或两种以上。
6.根据权利要求2所述的曲美替尼在制备逆转肿瘤多药耐药性药物中的应用，其特征在于：所述的助剂包括崩解剂、润滑剂和助溶剂中的一种或两种以上。
7.根据权利要求6所述的曲美替尼在制备逆转肿瘤多药耐药性药物中的应用，其特征在于：所述的崩解剂是指微晶纤维素；所述的润滑剂是指滑石粉、胶体硅胶、硬脂酸甘油酯、硬脂酸钙或镁粉；所述的助溶剂是指甲磺酸、富马酸、甘露醇、山梨醇单月桂酸酯、单硬脂酸酯或单油酸酯。
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