CN104427975A - 用于治疗神经变性的,神经炎症的和神经肿瘤学的疾病的mtor抑制剂的鞘内给药 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及mTOR激酶(雷帕霉素的哺乳动物靶标)酶类抑制剂在治疗神经肿瘤学疾病，尤其是结节性硬化症，神经变性疾病，尤其是阿尔茨海默尔疾病以及神经炎症的疾病，尤其是多发性硬化和原发进行性失语中的用途，经由鞘内或优选心室内给予所述抑制剂。

Description

用于治疗神经变性的,神经炎症的和神经肿瘤学的疾病的MTOR抑制剂的鞘内给药
发明领域
本发明涉及在治疗结节性硬化症，阿尔茨海默尔疾病以及原发进行性失语中的mTOR激酶(雷帕霉素的哺乳动物靶标)酶类抑制剂通过鞘内给药的用途，优选心室内给药这些抑制剂。
发明背景
mTOR抑制剂家族的最初药物，雷帕霉素或西罗莫司最初被提出作为大环内酯家族的抗生素和抗真菌药物。后来其被发现具有强大的免疫抑制性能。这成为该药物的主要用途。mTOR在使细胞功能适应环境条件中起到关键作用。在能量底物，营养素和氨基酸存在下mTOR被激活和促进，例如蛋白合成和有丝分裂，然而在禁食期间即当缺乏这些物质时被抑制。在这种情况下被促进的是自体吞噬，即包括属于细胞自身(氨基酸和能量的来源)的元素的底物的分解过程。mTOR抑制剂因此促进能量储存。mTOR是2个分子复合物mTORC1和mTORC2的催化亚基。mTORC1整合来自营养素，生长因子，能量和应激的4个信号，且2个对雷帕霉素更敏感。mTORC2对胰岛素，生长因子，血清和营养素敏感，且仅间接对雷帕霉素敏感。该级联高度进化保守，具有维持能量平衡和使细胞功能对其适应的目的。
mTOR抑制剂(雷帕霉素的哺乳动物靶标)的有效性已经在治疗为数众多的涉及中枢神经系统(CNS)的病理学疾病中被充分证实。
这对于多数神经变性的，神经肿瘤学和神经炎症性疾病是真实的。许多临床研究已经或正在开展以评估mTOR抑制剂在治疗一种遗传性肿瘤综合症、结节性硬化症(TS)中的益处。自从2006年以来(FranzDN等人，Ann.Neurol.)，我们已经知晓mTOR抑制剂对诱导这种疾病典型的星形细胞瘤(室管膜下巨细胞星形细胞瘤，SEGAs)对诱导的退行是有效的。在2008年，Ehninger等人(Nat Med 2008)发现在TS小鼠模型给药mTOR抑制剂后学习能力缺失的反转，虽然在发展已经停止后治疗才开始。TS与大脑细胞构筑内的极重度改性相关，且这被认为是癫痫现象(通常是不可治疗的)和严重认知和行为障碍的原因，在通常被分类在自闭症范围之内的患有TS的儿童中常见。
所有这些导致Ehninger和Silva(Trends in Mol.Med.，2011)假设在孤独癖谱群疾病中使用mTOR抑制剂治疗的益处。
SEGAs与肾脏瘤(血管肌脂瘤，囊肿和恶性肾肿瘤有肾细胞癌)是最常见的TS死亡原因(Shepherd等人，Mayo Clin.Proc.，1991)。
因此，在TS患者中给药mTOR抑制剂具有有益的效果，不仅在诱导SEGAs的退行——通过利用抗有丝分裂效应——而且——尽管机理不同——在患者的学习，记忆，发作和行为中也有益。
mTOR抑制剂也已经被用于阿尔茨海默尔病(AD)的动物模型。
在2012年1月，S.Oddo总结了近年来给药mTOR抑制剂(雷帕霉素，也被称为西罗莫司)对阿尔茨海默尔病鼠模型的效果的结果(Front.Biosci.(Schol Ed.))。
在2010年，他的团队(Caccamo等人，Biol Chem)发表口服mTOR抑制剂对阿尔茨海默尔病小鼠模型((3xTg-AD小鼠)的效果；他们观察到在大脑中Tau神经原纤维和淀粉样蛋白-β两者积聚的改善(以及神经元的损失，阿尔茨海默尔病的关键病理解剖学特征)，以及学习和记忆的改善。该效果看起来似乎是诱导被mTOR抑制剂介导的自体吞噬的缘故。向自体吞噬的推动力诱导了在阿尔茨海默尔病中的蛋白的病理性积聚物的胞内降解。这与在阿尔茨海默尔病中所观察到的有益的认知效果两者之间的联系尚未完全知晓。
在另一篇由他的团队发表的文章中(Majumder等人，PLoS One2011)，mTOR抑制剂被提出作为有效的治疗疗法，如果在疾病发展的开始给药的话。
mTOR抑制剂也能被用于神经炎症性疾病的治疗。RobertoFurlan的团队(Esposito M.等人，J neuroimmunology 2010)已经证实用mTOR抑制剂的治疗在神经炎症性疾病例如实验性变应性脑炎(EAE)的动物模型，多发性硬化(MS)动物模型中的有效性。
被治疗模型中的一个，通过用肽(氨基酸139-151)，髓磷脂蛋白脂质蛋白质(PLP)部分免疫SJL小鼠而创造，比其他模型更好地表现人体疾病，因为其表达了如同在患者中的临床形态，其特征在于在闭区间(close interval)发生的发作和缓和，残疾逐步恶化。在疾病显示其自身之前给药雷帕霉素是非常有效的，因为其实质上抑制自身开始和持续复发。在第一次发作后给药降低了后续发作的严重性和次数。试验也证明当药物被中止时，疾病重新开始其病程，如同在未治疗的个体中。
在炎症方面看似重要的一种痴呆形式是原发性进行性失语症(PPA)。
在1980年代后期最初由M.Mesulam所描述的，额颞叶痴呆的这种形式长久已与自身免疫病理性机理相关。已被观察到在经历过输精管切除术的患者中的高发病率；抗精子抗体在男性患者中通常被发现。它们也通常在女性患者中被发现，原因不明。
Decker和Heilman(Arch Neurol 2008)已经报告在PPA的一个病例中通过给药固醇类所获得的显著益处。
由Kertesz等人(Brain，2005)发表的在额颞叶痴呆的60个病例中所实施的尸体解剖的结果的综述中，大部分PPA验尸显示阿尔茨海默尔(AD)的病理性特征，表明AD样的退化非常常见地代表了PPA的自然进化。
因此，既考虑最初炎症性发病机理(mTOR抑制剂是最强力的免疫抑制剂)，又考虑最终AD类似的进化，给药强力免疫抑制剂药物如mTOR抑制剂看似代表了高度感兴趣的选择。
显然不存在进行性失语症的动物模型。
上述描述的临床状况仅是疾病的例子，其中给药mTOR抑制剂的有效性已经被临床(TS)或临床前证明(AD和MS)，或只是可能地被证明(PPA)。这些应用能明显偏于mTOR抑制剂所使用的主要领域：移植免疫学。在多发性硬化的应用依旧不明朗，但是在结节性硬化症的应用利用了抗有丝分裂效应，而在阿尔茨海默尔病中利用了自体吞噬的提高。
新用途已经引发了大量投资和临床试验，例如在结节性硬化症的情况中。在所有开展的研究中，全身用药导致风险效益比率中不确定的平衡，尤其由于药物主要的免疫抑制作用和随之不被希望的传染性类型的副作用。在2010年N Eng J Med中，Krueger DA报告了评估依维莫司(mTOR抑制剂)在星形细胞瘤(SEGAs)相关的TS的全身用药效果的II期临床研究的结果。在28名被TS影响的患者中开展的研究达到了终点(SEGAs体积减少)，但是存在大量具有严重级别1-3的副反应，它们的大部分是传染性源的。
与mTOR抑制剂全身用药相连的副作用问题在现有技术中被大量感受到，且尤其是将必须接受全身性药物且长期忍受相关继发效果的患者，如果非终身给药的话。这是以支持长期治疗耐受性为目标的大量出版物的原因(例如Krueger DA，Neurology 2013)。
发明概述
本发明能通过提供一种适用于减少全身用药中通常发生的副作用的给药mTOR抑制剂的方法克服该问题。
附图简述
本发明将在下文且也参考所附的附图被详细描述，其中：
-附图1显示：a)对照小鼠(CTRL)和用依维莫司(Ever)治疗的小鼠在脑、肝和脾中p70S6K(总体)，磷酸基-p70S6K(pThr389)以及肌动蛋白的水平，通过免疫印迹分析确定；附图显示蛋白质印迹代表三个不同的试验；b)p70S6K，总体和pThr389的密度计分析，针对肌动蛋白进行标准化(P<0.01(用依维莫司治疗的小鼠对比CTRL小鼠)，对独立样品使用双尾学生t检验)；
-附图2显示对照小鼠(CTRL)和用依维莫司(Ever)治疗的小鼠在脑、肝和脾的mTOR酶活性(P<0.01(用依维莫司治疗的小鼠对比CTRL小鼠)，对独立样品使用双尾学生t检验)；
-附图3显示治疗的EAE小鼠和对照小鼠的体重；
-附图4显示用依维莫司治疗的EAE小鼠对比对照小鼠的临床过程；
-附图5显示相同性别和年龄的6个月大的3xTg-AD小鼠和对照小鼠的记忆表现；对照小鼠在大约8天学会在场地寻找食物，而AD小鼠在15天的时间期限内学习适当路径却有困难。
发明详述
因此，本发明涉及mTOR抑制剂在治疗神经变性疾病，神经炎症疾病(神经炎症性疾病)和神经肿瘤学疾病中的用途，其中所述抑制剂是鞘内给药。优选的，鞘内给药在侧脑室内(心室内给药)进行。
根据本发明的鞘内给药可以是脉冲式的，优选采用规则间隔，否则是连续的。
鞘内给药优选通过机械或机电设备进行，更优选通过机电输液泵进行。该泵可由例如塑料设备(所谓“通道(ports)”)或机械设备(输液泵)组成。与泵连接的是导管，其被插入到鞘内空间或到达心室空间。
优选的是，能被mTOR抑制剂鞘内给药治疗的病理学疾病是阿尔茨海默尔疾病，结节性硬化症，多发性硬化以及原发进行性失语。尤其的是，在采用mTOR抑制剂的结节性硬化症情况下，目前是全身给药的，其神经病学表现被所提出的系统进行治疗。
因此，根据本发明，mTOR抑制剂通过鞘内给药，优选心室内(给药)被用于治疗神经变性疾病，神经炎症疾病以及神经肿瘤学疾病。
优选鞘内给药中使用——优选在侧脑室内——用于治疗上述病理学疾病的mTOR抑制剂选自：依维莫司，雷帕霉素(西罗莫司)，PF-04691502，地磷莫司和坦西莫司。
药物的鞘内给药是一种已在不同病理学病况中广泛应用且具有限制全身性副作用优势的技术。
止痛剂或镇痉药的鞘内(IT)给药是一种自从1980年代就开展的良好确定的临床实践，其时输液设备达到适当成本以及降低尺寸以及成为充分可靠。迄今为止，用于该给药方法的只有少数分子已经被FDA批准。其中，我们应该提及：
-巴氯芬(镇痉药，亲水分子)
-吗啡(止痛剂，亲水分子)
-布比卡因(止痛剂和麻醉剂，亲脂分子)
-可乐定(抗高压剂和止痛剂，亲脂分子)
-齐考诺肽(止痛剂，仅批准用于IT，亲水分子)
除了巴氯芬这种镇痉药，其他均被用于麻醉和疼痛管理。齐考诺肽是唯一被允许专用于鞘内给药的药物。尝试雷帕霉素鞘内给药也同样从出版物中被知晓：Geranton等人Neurobiology of Disease，2009以及Xu等人The Journal of Neuroscience，2011。
这两份文章描述了雷帕霉素对小鼠的鞘内非心室内给药，目标是了解神经性疼痛的发病机理。
还没有已知出版物论述用于治疗本发明所涉及病理学疾病的mTOR抑制剂鞘内给药的可能性，更不用说心室内给药。
mTOR抑制剂鞘内给药通过需要简单和绝对良好确定的手术操作的系统而进行。该给药系统优选鞘内泵，可在一些空间持续若干年，而具有最低的维护费用和护理。设备的可靠性完全令人满意，因为其重量和大小。设备的槽能包含相当大量的药物，因此再填充程序可以合理的长时间间隔进行。
最佳耐受鞘内给药的药物是亲水性的。一旦在脑脊髓液(CSF)中，它们是均匀扩散到鞘内空间，渗入薄壁组织和到达靶细胞。它们部分被大脑的实质内静脉系统所阻断，而它们部分返回进入CSF。然后，CSF在蛛网膜下腔中被凸出到静脉窦且运送CSF进入血液的帕基奥尼蛛网膜颗粒所捕获。
因此，CSF及其溶质在新分配容量中被稀释，遵循常规分解代谢和半衰期。然而在CSF中，药物浓度将依赖其分配容量，给药速度和CSF周转；一旦在血液中，其与新分配容量相关连，且对于过滤器官(mTOR抑制剂主要被肝降解)的解毒作用，分解代谢机理，且根据FDA雷帕霉素的半衰期是62个小时。(http://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/99/slides/3529s1e/sld002.htm)。
另一方面，亲脂药物(如几乎所有mTOR抑制剂)倾向于扩散到周围组织和进入血液(参见，例如Castro和Eisenah，Anesthesiology1989)。同时，亲脂药物能容易地到达在关注的病理学病病中枢神经系统(CNS)内的靶位，尤其是如果心室内给药。在这种情况下，脉冲式或间歇性给药能获得药理学效果，虽然限制血浆浓度提高。
脑脊髓液(CSF)主要由心室内系统的脉络丛生成。它在其中流动-以脉冲式模式和与心跳同步-从侧脑室到第四脑室，然后经由Luschka孔和马让迪孔离开脑室系统，并主要流入蛛网膜下腔以到达帕基奥尼蛛网膜颗粒，其位于头盖骨的上部且凸出进入静脉窦；它们阻断CSF并转移其进入矢状窦的静脉血。
它也流经围绕脊髓的蛛网膜下腔，且在中央椎管中非常微少地流动。
CSF能被认为是血浆超滤液：在生理条件下它包含离子，几乎很少的蛋白以及非常少的细胞。
它的体积在135至150ml之间变化，但是其以500ml/天的速度持续性产生。因此，其完全替换每天约3.5次。
如果希望维持在脑脊髓液中的分子浓度(大约150ml)，因此在中枢神经系统(大约1400ml)，有必要规则给药使其进入脑脊髓液。为了维持在CSF中药物的治疗浓度，数量必需达到在500mlCSF的浓度，且其分配容量(CSF和CNS)必须在24小时内规则给药进入液体。
每天相同数量会逐渐排出进入到血液中，在此处其扩散到更大的分配容量。因此，分子的全身浓度将依赖其半衰期和分配容量。
如果鞘内药物是在约1550ml(CNS+CSF)中以治疗浓度均匀分配，相同数量将逐渐被转移到身体其他部分且因此稀释30-60倍，视个体体重而定。
该日剂量因个人必需达到任一全身性药理学效果而非常不同，因此也有更小的引起副作用的可能性。
大部分mTOR抑制剂并非很能在水中溶解。它们在水环境的给药也许需要微乳剂(例如Bespinar等人，J Ocul Pharmacol Ther 2008)或胶囊化尤其是PLGA纳米粒(例如Tosi等人，J Neural Transm2011)。
在制剂中所选择药物的化学特性，已被其他作者描述了，能够例如使其通过比希望更大的分配容量快速分散。该扩散能被直接心室内和/或脉冲式给药所减速。获得局部治疗效果(CNS)的目标会在任何情况下实现，而维持绝对可耐受的全身性浓度。
方法-总体部分1药品检定的设置，试验剂量和动物外科手术的选择
药物：鉴于其临床证实的效力和相对短暂的半衰期(28-32h，相比之下，多于雷帕霉素时间的两倍)，为证实药物在这种新制剂和给药方法也有效力，我们测定了mTOR抑制剂依维莫司在小鼠中的效果(http://www.selleckchem.com/products/Everolimus(RAD001).html)。
心室内注射：在氯胺酮/赛拉嗪获得的全身麻醉下，Alzet渗透泵(http://www.alzet.com/products/guide_to_use/pump_selection.html)在背部被植入皮下；导管从泵到达颅顶，在此处其被连接到连接器(Brain Kit 3，Alzet)脑功能区定位地植入到头盖，直到到达侧脑室。这些泵能在1-4周里以等速注射它们的容量。
由LC-MS的依维莫司的测定
在血液和组织样品中的依维莫司的定量分析以同位素稀释法使用LC-MS技术进行。色谱系统如下：安捷伦1290Infinity HPLC，其装有二元泵和HiP自动样品模型G4226A。注射容量是2μL，使用的分析柱是Phenomenex动力学PFP UHPLC柱(Phenomenex，米兰，意大利)5.0×2.1mm，1.7μm，温度控制在55℃。进行梯度洗脱，使用作为溶剂A的：含5mM甲酸铵的水，作为溶剂B的：含0.1％甲酸的甲醇。洗脱概况如下：在0.25mL/min的流速下溶剂A30％/溶剂B 70％持续3分钟，溶剂A 1％/溶剂B99％从3分钟到6分钟。该设置能使洗脱时间为2.5分钟。每次注射之前用甲醇循环清洗注射器系统。
质谱法使用装有二元AJS ESI(电喷射离子化界面)系统的Q-TOFMS检测器模型G6540A(安捷伦，德国)进行实施。仪器参数如下：鞘气流：7.5mL/min，鞘气温：300℃，气流：6L/min，气体温度：300℃，喷雾器压力：35psi，离子喷雾电压：5500V。
依维莫司和同位素内部标准两者在阳离子模式下作为铵加成化合物被测定。
样品制备和方法确认
从全血样品中提取
为能沉淀大部分血清蛋白，依维莫司从全血中在包含10％醋酸铵的1mL甲醇溶液中提取。
使用的内部标准是同位素的4d-2C13-依维莫司，其以200ng/mL浓度加入到提取溶液。
血液样品被冷冻干燥并随后提取。提取过程在大约10分钟超声浴中进行，确保完全溶血和从细胞物质中释放药物。样品被离心(10分钟，4000rpm，10℃)，且上清液随后被从片状沉淀物中移除。
因此获得的溶液随后借助1ml总容量-磷脂固相提取柱(Sigma Aldrich，米兰)进行纯化，以消除潜在出现的过量的脂物质。对于在溶液和在基质中的依维莫司以及内部标准两者，该过程被初步确定，提供产量>98％w/v。
从(脑)组织样品中提取
从脑样品提取的过程，被分为右和左半球，其与全血提取相似。组织样品被称重且随后冷冻干燥。在冷冻干燥后，样品被细微剁碎以便于后续提取。1mL甲醇溶液随后被以200ng/mL的内部标准加入1％v/v甲酸铵。样品随后受到10分钟超声和漩涡处理以确保药物的完全提取。随后离心(10分钟，4000rpm，10℃)且上清液从片状沉淀物中分离。如前所述，溶液随后借助总容量1ml的-磷脂固相提取柱(Sigma Aldrich，米兰)进行纯化，以消除过量的脂物质。样品随后立刻经历LC-MS分析。
确认
提取方法和分析方法两者均在下列方式中进行确认：
a)提取：从组织和血液的提取通过确定依维莫司产量和既在溶液又在生物基质中的相同条件下的内部标准产量进行确认。这些产量通过来自不以100ng/mL浓度依维莫司治疗的动物的污染样品进行测定，而内部标准维持在200ng/mL。提取和纯化过程随后被模拟且数量被测定并和理论数量进行比较。
b)分析：分析方法受到检验，以确定在存在或缺乏生物基质的反应中LOD和LOQ和线性。检验校准在1-200ng/mL依维莫司范围内进行，以确定维持在200ng/mL浓度的内标准时是否有任何对基质的显著干扰。
生物化学-蛋白质印迹：蛋白提取和蛋白质印迹分析
冷冻的小鼠组织在包含蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich)混合物和磷酸酶抑制剂(Sigma-Aldrich)混合物的T-PER溶液(Pierce)中被均质。均质的样品使用MSE超声波匀浆器150近距离声波定位器(Sanyo)在4℃被超声处理3次共15秒(10微米振幅)，且随后在4℃以16000g离心30分钟。上清液被回收且使用BSA作为标准借助Bradford测定法进行蛋白定量。
对于蛋白质印迹分析，根据Laemmli的方法蛋白在还原条件下借助SDS-PAGE分离。随后，蛋白被转移到PVDF膜(Biorad)，其在采用下述第一抗体的情况下进行孵化：抗-磷酸基-p70S6K(T389)，抗-磷酸基-p70S6K(S371)，抗-p70S6K(细胞信号传导)和抗-肌动蛋白(Sigma-Aldrich)。在用TBS-吐温(50mM Tris，pH 7.5，NaCl150nM和0.1％吐温20)清洗后，膜在采用下述任一第二抗体的情况中进行孵化：偶联HRP的抗-兔子IgG(GE Healthcare)以及HRP偶联抗-鼠IgG(GE Healthcare)。膜借助ECL prime(GE Healthcare)进行显像。
mTOR活性
mTOR活性用K-LISATMmTOR活性试剂盒按照厂家方案进行测定。试剂盒基于ELISA活性测定，该测定使用融合蛋白GST-p70S6K作为特定的mTOR底物。mTOR底物首先被结合到固体支撑物，且包含mTOR的样品在谷胱甘肽包被的96孔板的孔中与ATP一起孵化。在样品中出现的活性mTOR在Thr389磷酸化了结合到平板的蛋白p70S6K。磷酸化的底物直接使用第一抗-p70S6K-T389抗体进行测定，随后用偶联HRP的第二抗体且加入TMB底物进行检测。相关活性在波长450和595nm通过读取吸光度被确定。
结果部分1-总体
通过质谱法寻找合适的剂量
通过在一周内以3个不同剂量在脑实质内给药所获得的依维莫司脑浓度被验证。它们基于发表在动物实验的最高剂量(A＝2.5mg/Kg)进行选择，在小鼠中最常用的剂量(B＝1.25mg/Kg)，而理论上充足剂量(C＝0，6125mg/Kg)。
如在表1所示，我们获得不同的脑浓度：
脑浓度1:11.5mg/Kg
脑浓度2:25mg/Kg
脑浓度3:41.7mg/Kg
表1-用渐进剂量的依维莫司(Ev)在一周中进行腹膜治疗的3组小鼠的血液和脑浓度
*该数值是以半球重量(0.25g)进行标准化。
在任何情况下，药物不会达到血液中的可测定水平。基于体重、自发能动性，姿势和皮毛的评价，所有剂量表现为耐受非常良好。
随后我们决定通过依维莫司心室内给药在10倍高于那些在表1所示的浓度中寻找最大耐受剂量：A＝25mg/Kg，B＝12.5mg/Kg，C＝6.125mg/Kg。
用剂量A治疗的小鼠在3天治疗后，证实自发能动性降低且非常微小的体重降低(在姿势或皮毛中绝没有减弱)。因此，那个剂量被排除且小鼠被处死。其他2个剂量呈现良好耐受。对于随后在不同动物模型的治疗效果评估中，剂量B(12.5mg/Kg)被选中。
表2显示所发现的脑和血液浓度。尽管它们不能被定量化，来源于药物转化的代谢产物的存在已经在表中被注明。
表2：以3个不同浓度的大脑内给药一周后测定的血液和脑浓度
mTOR抑制剂的核实：我们通过WB分析了mTOR的真实抑制作用。mTOR是一种有多重底物的激酶，其中之一是p70-S6激酶。后者的磷酸化被一致认为是mTOR活性的度量。在所选的剂量，所达到的脑浓度的确事实上抑制了酶的复合物，如被附图1所证实：正如被希望的，p70-S6激酶-通常在脑中被大量磷酸化-是比对照更少磷酸化的形式。平行地，p70-S6激酶通常在脾和肝中磷酸化。
借助LC-MS的依维莫司血液测定已经显示腹膜内给药进行治疗的小鼠在治疗范围的血液浓度，然而其仅在已经接受依维莫司鞘内治疗的小鼠的血液中以痕量(<1mg/Kg)被检测到。这符合mTOR局部抑制，而非全身，如WB所示，这确定p70-S6激酶的磷酸化状态，与mTOR活性成比例。
这致使mTOR抑制剂任何脑外的药理学效果绝对不可能。
部分2-特别的：在小鼠模型中的效果核实
我们在小鼠模型中开展实验以举例说明3个神经性疾病的家族：
-EAE(实验性的自身免疫变应性脑炎(Encephalomyelite)，神经炎症性疾病模型)：SJL/j小鼠用两次皮下注射蛋白脂质蛋白质(PLP139-151)，弗罗因德佐剂和灭活的结核分枝杆菌进行免疫，分开7天进行。疾病严重性用临床分值进行定级：0＝健康；1＝尾部虚弱；2＝后肢共济失调和/或轻瘫；3＝后肢麻痹和前肢麻痹；4＝四肢麻痹；5＝剧痛或死亡的状态
-AD(阿尔茨海默尔病，神经变性疾病模型)：由杰克逊实验室提供的AD三倍转基因小鼠(3xTg-AD)(http://jaxmice.jax.org/strain/004807.html)。它们的记忆使用被动回避和放射迷宫测试进行评价。
-TSC(复合型结节性硬化病，神经肿瘤学模型)：由杰克逊实验室提供的在flox箱(弹夹，cassette)中有TSC1基因的TSC1小鼠(http://jaxmice.jax.org/strain/005680.html)
EAE
30只SJL/j小鼠被免疫且在11天后开始发展病情。随着它们发展神经性缺乏症并到达分值1，它们被实施手术且包含依维莫司或赋形剂的Alzet 1004泵被放置。该目的是呈现患者在首次发作的时候就医的正常临床状态。通常而言，诊断被进行和高剂量甾类激素治疗被应用，且症状退行良好，但是在绝大部分病例中其他发作的情形将发生且它们之后是持继增加的更少令人满意的退行，和残疾的逐步提高。
在我们的试验设置中，受影响的小鼠的体重和临床分值被每天监测。
我们能够观察在首次发作中严重性的降低，然而其之后是另外2次并不比对照温和太多的严重性的发作。然而，当对照持续呈现提高的更大的残疾的复发，在第三次发作后被治疗小鼠不再呈现发作且完全恢复它们的运动能力(分值0)和体重。
附图3显示SJL小鼠在体重中的趋势。最初，体重随着疾病进展而降低，但随后倾向于在第一次，更多的剧烈发作后恢复。此外，在其身上的植入手术在若干天后引起体重下降。
附图4显示在临床分值中的趋势。在第3次发作后，被药物治疗的小鼠没有呈现任何其他发作，然而被赋形剂治疗的小鼠持续有发作。
在第4周的末期，小鼠被处死且进行生化和免疫病理分析。
这证实依维莫司鞘内给药具有强大局部免疫抑制效果。该方法涉及一定程度的侵入性和绝对不是一种病原学治疗法，尽管这些是真实的，但是临床效力是整体上可与全身性给药相当的，而没有全身性免疫抑制效果，且这使得该方法是主要临床兴趣的治疗选择。
AD(阿尔茨海默尔病)
所选的小鼠模型被认为是那些最能呈现人体情况的其中之一。从6个月年龄开始，事实上其表现了胞内和胞外淀粉样蛋白-β，神经原纤维缠结和神经元损失的发展性积聚，如同在人类中。这些神经病理学特征与发展性认识损害相关，尤其是可观察到记忆表现的并行损害。
记忆缺陷，也是AD的关键征兆，用不同测试进行测量。其中，普遍接受的、我们自己所用的测试是被动回避和放射迷宫以及水迷宫测试。
被动回避：被动回避设备包含用拉门分隔的两个隔间。更小的隔间是亮光的，更大的保持黑暗且电休克能够从地板传递(2×0.4mA，50Hz，2s，在5s间隔)。在训练日，每只小鼠被放置在光亮隔间，远离黑暗隔间。当小鼠转身时拉门被打开，当小鼠所有四只脚踏进黑暗隔间足休克会被传递。24个小时后记忆被测试且跨越潜伏期被记录(时间期限为180s)。
放射迷宫：通过喂食它们提前测定数量的食品，小鼠被降低体重且体重维持在平常体重的85％。迷宫有8个相同的37厘米(centimer)长臂从7×8cm平台中分叉开来。动物每天进行一次测试，且当它们学习了右侧选择(最多多达15个选择)或15min已经过去时，它们的训练结束。如果所有4只脚位于迷宫的一个臂中，选择被确定。
附图5显示当经受放射迷宫测试，AD小鼠与健康对照在6个月的表现。在涉及每日多次的训练过程中，这项测试测定在认知固定路径的错误次数。然而在8天后健康小鼠显示仅有少数偶尔错误，该结果在15天后被AD模型所达到。
我们应用脑室内导管以及依维莫司-分泌型渗透泵(它们同时植入到12只AD小鼠的背部)，持续4周。我们把赋形剂注入到相同数量的小鼠中。我们把依维莫司注射到10只健康小鼠，最后赋形剂注入另外10只。在4周以后放置合适的泵，且在另外4周泵被保持在该位置。随后记忆表现被测试。
然而，在EAE小鼠中，依维莫司局部应用显示有效的局部免疫抑制活性，在这种情况下，采用相同剂量，观察到相对新的mTOR抑制剂的药理学活性，其直到几年之前还没有被考虑：提高自体吞噬。
这些被S.Oddo(例如Caccamo JBC 2010)团队彻底分析。我们愿意在此指出，即使AD具有全身性累及，这肯定决不曾被证实有任何临床相关性。然而，采用mTOR抑制剂的治疗方法具有继发于免疫抑制效果的副作用(参见，例如Krueger DA，NEJM 2010)，这是老人受试者发现难以耐受的。
尽管此处所提出的方法是侵入性和非病原学的，此处所提出的方法显示了与如此受到限制的风险相关的如此的效力，我们感到权衡费用/效益比例时，所述费用/效益显著地显示有利于分母。
TS(结节性硬化症)
没有可获得的能复制人类TSC，室管膜下巨细胞星形细胞瘤(SEGA)的主要神经学特征的动物模型。这些代表了在患者中死亡的主导原因，且通过口服给药mTOR抑制剂降低它们的容量是关于这个课题的临床试验首个终结点。
然而我们知道，该给药途径的副作用非常严重。
从总体部分呈现的证据，我们知道我们能够到达局部，在颅壳内抑制剂浓度大于通过全身性给药在相同区域所到达的浓度(表2)。从那里我们也知道此处呈现的抑制剂能抑制mTOR信号传导路径(附图1和2)。我们已经发现该浓度能实现局部免疫抑制作用(附图4)，而以无法测量的水平留在血液中(表2)，且在外周器官中不影响mTOR的正常活性(附图1和2)。

Claims (11)

1.一种通过鞘内给药在治疗病理学疾病中使用的mTOR抑制剂，所述病理学疾病选自：神经变性疾病，神经炎症性疾病和涉及神经学的肿瘤疾病。
2.根据权利要求1的抑制剂，其中所述鞘内给药是在侧脑室内的心室内给药。
3.根据权利要求1或2的抑制剂，其中所述鞘内给药是脉冲式给药，优选采用规则间隔，或者连续给药。
4.根据权利要求1至3任一项的抑制剂，其中所述抑制剂被配制成微乳剂。
5.根据权利要求1至3任一项的抑制剂，其中所述抑制剂是被聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的纳米颗粒所胶囊化，优选以能够跨越血脑屏障的方式被修饰。
6.根据权利要求1至5任一项的抑制剂，其中所述抑制剂是选自：依维莫司，雷帕霉素，PF-04691502，地磷莫司和坦西莫司。
7.根据权利要求1至6任一项的抑制剂，其中所述神经肿瘤学疾病是结节性硬化症。
8.根据权利要求1至6任一项的抑制剂，其中所述神经变性疾病是阿尔茨海默尔病。
9.根据权利要求1至6任一项的抑制剂，其中所述神经炎症是原发进行性失语或多发性硬化。
10.根据权利要求1至9任一项的抑制剂，其中机械的或机电的设备，优选机电输液泵，其用于所述鞘内给药。
11.根据权利要求10的抑制剂，其中所述机械的或机电的设备是可再充填的。
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