KR20230037647A - 타우병증 또는 아밀로이드성 질환을 검출하기 위한 혈액-기반 검정 - Google Patents
타우병증 또는 아밀로이드성 질환을 검출하기 위한 혈액-기반 검정 Download PDFInfo
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Abstract
높은 감도, 정확도, 및 정밀도로 대상체로부터의 혈액-기반 샘플 내의 p217+타우를 검출하기 위한 방법. 검정은 샘플을 p217+타우 에피토프에 대해 지향된 포획 항체와 접촉시켜 포획 항체를 혈장 중의 p217+타우 펩티드에 결합시켜 항체-펩티드 복합체를 형성하는 단계, 및 별도로 항체-펩티드 복합체를 검출 항체와 접촉시켜 검출 항체를 항체-펩티드 복합체에 결합시키는 단계를 포함한다. p217+타우의 양은 검출 항체를 검출함으로써 결정된다. 검출된 p217+타우의 양을 사용하여, p217+타우 펩티드의 양이 사전결정된 역치 값을 초과하는 경우에 대상체가 타우병증을 갖거나 타우병증의 발생 위험이 있는지 여부, 또는 대상체가 아밀로이드성 질환을 갖거나 아밀로이드성 질환의 발생 위험이 있는지 여부를 결정한다. 사전결정된 역치 값이 검정의 정량 하한 및/또는 검출 하한을 초과하도록, 본 방법은 개선된 감도를 갖는다.
Description
서열 목록
본 출원은 ASCII 서식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 2021년 6월 30일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 JAB7064WOPCT_SL.txt이며, 크기가 20,602 바이트이다.
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2020년 7월 14일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/705,759호 및 2021년 3월 4일자로 출원된 미국 가특허 출원 제63/200,399호에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 내용이 본 명세서에 참고로 포함된다.
기술분야
본 출원은 타우병증 및/또는 아밀로이드성 질환을 검출하기 위한 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 혈액-기반 샘플에서 단일- 또는 다중-인산화된 p217+타우 단백질 종의 양을 측정하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
임상적으로 알츠하이머병(AD)은 점진적으로 극심한 정신 황폐(mental deterioration) 및 궁극적으로 사망으로 이어지는 기억, 인지, 사고, 판단, 및 감정적 안정성의 진행성 손실을 특징으로 하는 퇴행성 뇌 장애이다. AD는 고령의 인간에서 진행성 정신 부전(치매)의 매우 일반적인 원인이다. 미국에서 5백만명 초과의 사람들이 AD를 앓으며 살고 있으며, 그 수는 인구 고령화에 따라 증가 중이다. 실제로, 65세 초과의 사람들 중 10%가 AD를 가지며, 이는 이러한 집단에서 5위의 사망 원인이다. 전체적으로 AD는 미국에서 6위의 사망 원인이며(AD 또는 다른 치매로 인해 3명 중 1명의 고령자가 사망함), 이는 2020년에 3050억 US 달러의 비용으로 추정된다. AD는 또한 전세계의 인종군에서 관찰되었고, 현재 및 미래의 공중 보건상의 주요 문제를 제시한다.
AD를 가진 개체의 뇌에는 노인성(또는 아밀로이드) 플라크, 아밀로이드 혈관병증(혈관 내 아밀로이드 침착) 및 신경섬유 매듭(neurofibrillary tangle)으로 명명되는 특징적인 병변이 나타난다. 다수의 이들 병변, 특히 쌍 나선형 필라멘트의 신경섬유 매듭 및 아밀로이드 플라크가 일반적으로 AD를 가진 환자의 기억 및 인지 기능에 중요한 인간 뇌의 여러 영역에서 발견된다.
신경섬유 매듭은 주로 과인산화된 타우 단백질의 응집체로 구성된다. 타우의 주요 생리학적 기능은 미세소관 중합 및 안정화이다. 미세소관에 대한 타우의 결합은 타우의 미세소관 결합 영역 내의 양전하와 미세소관 격자 상의 음전하 사이의 이온 상호작용에 의해 일어난다(문헌[Butner and Kirschner, J Cell Biol. 115(3):717-30, 1991]). 타우 단백질은 85개의 가능한 인산화 부위를 함유하며, 이들 부위 중 다수에서의 인산화는 타우의 주요 기능을 방해한다. 축삭 미세소관 격자에 결합된 타우는 저인산화 상태인 반면에, AD에서 응집된 타우는 과인산화되어 생리학적으로 활성인 타우 풀(pool)과 구별되는 특유의 에피토프를 제공한다(문헌[Iqbal et al., Curr Alzheimer Res. 7(8): 656-664, 2010]).
AD 뇌에서의 타우병증의 진행은 특유의 확산 패턴을 따른다. 인간 뇌에서의 타우병증 진행의 브라크 병기(Braak stage) 및 전임상 타우 모델에서의 타우 응집체 주사 후의 타우병증 확산에 기반하여 타우병증 전파 및 확산 가설이 설명되었다(문헌[Frost et al., J Biol Chem. 284:12845-52, 2009]; 문헌[Clavaguera et al., Nat Cell Biol. 11:909-13, 2009]). 타우병증은 하나의 뇌 영역으로부터 다음 뇌 영역으로 프리온-유사 방식으로 확산될 수 있는 것으로 여겨진다. 이러한 확산 과정은 근처 뉴런에 의해 흡수될 수 있는 타우 시드의 외재화를 수반하여 추가의 타우병증을 유도할 것이다.
증상의 발병으로부터 최대 20년 전에 다수의 생화학적 변화가 검출될 수 있다. 국립 노화 연구소 및 알츠하이머 협회(NIA-AA: National Institute on Aging and Alzheimer's Association) 연구 프레임워크는 기저 병리학적 과정, ß-아밀로이드(A), 병리학적 타우(T), 및 신경퇴행(N)과 관련된 측정에 기반하는 알츠하이머병(AD)의 진단을 위한 기전을 제공한다. 타우-특이적 방사선 트레이서를 사용하는 양전자 방출 단층 촬영(타우 PET)은 환자에서 타우 신경섬유 매듭(NFT) 병리를 측정하기 위해 사용되어 왔다. 그러나, 타우 PET는 비용이 많이 들고 번거로운 절차이며, 타우-특이적 방사선 트레이서의 이용가능성이 제한될 수 있다.
신경섬유 매듭에서 타우 단백질의 단편은 뇌척수액(CSF) 으로 이동하며, 여기서 이들이 수확되고 민감한 검정에 의해 측정될 수 있다. 따라서, CSF에서 타우 단백질-유래 단편을 인식하는 검정을 사용하여 신경학적 질환의 존재를 검출할 수 있다. 그러나, CSF의 인출은 의사가 척추관 내로 바늘을 삽입하여 검정에 사용하기 위한 CSF의 샘플을 수집하는 단계를 포함하는 침습성 요추 천자 시술을 환자가 받는 것을 필요로 한다. 그러한 절차는 불편하고 부담이 있으므로, 빈번하게 반복하기에 바람직하지 않고 환자에서 질환 상태의 정기적인 모니터링에 적합하지 않다.
본 출원의 예시적인 일 실시 형태는 대상체에서 p217+타우 펩티드를 검출하는 검정 방법에 관한 것이다. 본 방법은 혈장 샘플을 p217+타우 에피토프에 대해 지향된 포획 항체와 접촉시켜 포획 항체를 혈장 중의 p217+타우 펩티드에 결합시켜 항체-펩티드 복합체를 형성하는 단계, 및 항체-펩티드 복합체를 세척하는 단계를 포함한다. 이어서 본 방법은 항체-펩티드 복합체를 검출 항체와 접촉시켜 검출 항체를 항체-펩티드 복합체에 결합시키는 단계로 진행한다. 이어서 본 방법은 검출 항체를 검출하여 혈장 샘플 내의 p217+타우 펩티드의 양을 결정한다.
대상체에서 타우병증을 검출하는 방법이 또한 제공된다. 본 방법은 대상체로부터 혈장 샘플을 얻는 단계 및 검정을 사용하여 혈장 샘플 내에 존재하는 p217+타우 펩티드의 양을 검출하는 단계를 포함한다. 검정은 p217+타우 에피토프에 대해 지향된 포획 항체를 사용하여 포획 항체를 혈장 중의 p217+타우 펩티드에 결합시켜 항체-펩티드 복합체를 형성하고 검출 항체를 사용하여 검출 항체를 항체-펩티드 복합체에 결합시킨다. 본 방법은 p217+타우 펩티드의 양이 사전결정된 역치 값 초과인 경우에 대상체가 타우병증을 갖거나 타우병증의 발생 위험이 있는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 사전결정된 역치 값은 검정의 정량 하한(LLOQ: Lower Limit of Quantification) 초과이다.
대상체에서 아밀로이드성 질환을 검출하는 방법이 또한 제공된다. 본 방법은 대상체로부터 혈장 샘플을 얻는 단계 및 검정을 사용하여 혈장 샘플 내에 존재하는 p217+타우 펩티드의 양을 검출하는 단계를 포함한다. 검정은 p217+타우 에피토프에 대해 지향된 포획 항체를 사용하여 포획 항체를 혈장 중의 p217+타우 펩티드에 결합시켜 항체-펩티드 복합체를 형성하고 검출 항체를 사용하여 검출 항체를 항체-펩티드 복합체에 결합시킨다. 본 방법은 p217+타우 펩티드의 양이 사전결정된 역치 값 초과인 경우에 대상체가 아밀로이드성 질환을 갖거나 아밀로이드성 질환의 발생 위험이 있는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 사전결정된 역치 값은 검정의 정량 하한(LLOQ) 초과이다.
본 출원의 다른 태양에는, 대상체에서 타우병증을 검출하거나 예측하기 위한 방법이 제공된다. 본 방법은 혈장 샘플을 p217+타우 에피토프에 대해 지향된 포획 항체와 접촉시켜 포획 항체를 혈장 중의 p217+타우 펩티드에 결합시켜 항체-펩티드 복합체를 형성하는 단계, 및 별도로 항체-펩티드 복합체를 검출 항체와 접촉시켜 검출 항체를 항체-펩티드 복합체에 결합시키는 단계, 및 검출된 p217+타우 펩티드의 양에 상응하는 타우 데이터를 생성하는 단계에 의해 혈장 샘플 내의 p217+타우 펩티드의 양을 검출하는 단계를 포함한다. 본 방법은 또한 환자로부터 검출된 하나 이상의 바이오마커에 상응하는 바이오마커 데이터를 얻는 단계를 포함하며, 여기서 바이오마커는 NFL, 아디포넥틴, 및 렙틴을 포함하는 군으로부터 선택된다. 본 방법은 기계 학습 모듈을 사용하여 타우 데이터 및 추가의 바이오마커 데이터를 참조 데이터 세트에 비교하여 대상체가 타우병증을 갖거나 타우병증의 발생 위험이 있는지 여부를 결정하거나 예측하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 이들 및 다른 태양은 도면 및 첨부된 청구범위를 비롯한 본 발명의 하기의 상세한 설명을 읽은 후에 당업자에게 명백해질 것이다.
도 1a는 이전에 개시된 검정에 따라 얻어진 1:4 희석에서 혈장으로부터 검출된 p217+타우에 대한 데이터를 나타낸다.
도 1b는 이전에 개시된 검정에 따라 얻어진 1:16 희석에서 혈장으로부터 검출된 p217+타우에 대한 데이터를 나타낸다.
도 1c는 이전에 개시된 검정에 따라 얻어진 반-변성 혈장 샘플로부터 검출된 p217+타우에 대한 데이터를 나타낸다.
도 1d는 이전에 개시된 검정에 따라 얻어진 면역침전 혈장 샘플로부터 검출된 p217+타우에 대한 데이터를 나타낸다.
도 2a는 이전에 개시된 검정에 따라 얻어진 CSF로부터의 p217+타우 측정치와 본 출원의 예시적인 검정에 따라 얻어진 CSF로부터의 p217+타우 측정치 사이의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 2b는 이전에 개시된 검정에 따라 얻어진 혈청에서 검출된 p217+타우 수준과 본 출원의 예시적인 검정에 따라 얻어진 혈청에서 검출된 p217+타우 수준을 비교하는 데이터를 나타낸다.
도 3a는 본 출원의 예시적인 실시 형태에 따른 2개의 상이한 검출 항체를 사용하여 얻어진 CSF로부터의 p217+타우 측정치 사이의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 3b는 본 출원의 예시적인 실시 형태에 따른 2개의 상이한 검출 항체를 사용하여 얻어진 혈청으로부터의 p217+타우 측정치 사이의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 3c는 본 출원의 예시적인 실시 형태에 따른 2개의 상이한 검출 항체를 사용하여 얻어진 혈장으로부터의 p217+타우 측정치 사이의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 4a는 본 출원의 예시적인 실시 형태에서 비드 클럼핑에 대한 상이한 샘플 희석제의 효과를 비교하는 데이터를 나타낸다.
도 4b는 본 출원의 예시적인 실시 형태에 의해 검출된 p217+타우 수준에 대한 상이한 샘플 희석제의 효과를 비교하는 데이터를 나타낸다.
도 5a는 본 출원의 예시적인 실시 형태에 따라 얻어진 혈청으로부터 검출된 p217+타우에 대한 데이터를 나타낸다.
도 5b는 본 출원의 예시적인 실시 형태에 따라 얻어진 혈장으로부터 검출된 p217+타우에 대한 데이터를 나타낸다.
도 5c는 도 5b에 나타낸 바와 같은 혈청으로부터 검출된 p217+타우와 도 5c에 나타낸 바와 같은 혈장으로부터 검출된 p217+타우 사이의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 5d는 도 5c에 나타낸 바와 같은 혈장으로부터 검출된 p217+타우와 도 5b에 나타낸 바와 같은 혈청으로부터 검출된 p217+타우 사이의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 6a는 본 출원의 검정의 예시적인 실시 형태에 대해 보정물질 펩티드를 사용하여 생성한 대표적인 보정 곡선을 나타낸다.
도 6b는 혈청 및 혈장에서의 본 출원의 예시적인 검정의 희석 직선성을 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 7a는 혈장에서의 본 출원의 예시적인 검정의 시험내 정밀도(intra-test precision)를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 7b는 혈장에서의 본 출원의 예시적인 검정의 시험간 정밀도(inter-test precision)를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 7c는 혈장에서의 본 출원의 예시적인 검정의 시험내 정밀도를 입증하는 추가의 데이터를 나타낸다.
도 8a는 AD 대상체에서 본 출원의 예시적인 검정을 사용하여 혈장에서 검출된 p217+타우에 대한, CSF에서 검출된 p217+타우의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 8b는 AD 대상체에서 본 출원의 예시적인 검정을 사용하여 혈장에서 검출된 p217+타우에 대한, CSF에서 검출된 p217+타우의 상관관계를 입증하는 추가의 데이터를 나타낸다.
도 9a는 검증 코호트에서 본 출원의 예시적인 검정을 사용하여 혈장에서 검출된 p217+타우에 대한, CSF에서 검출된 p217+타우의 상관관계를 입증하는 추가의 데이터를 나타낸다.
도 9b는 타우병증의 뇌 병리를 구별함에 있어서 본 출원의 예시적인 검정에 따라 얻어진 혈장 측정치의 감도를 나타내는 도 7b의 데이터의 수용자-반응 특성(ROC: Receiver-Operating Characteristic) 곡선을 나타낸다.
도 10a는 양전자 방출 단층 촬영(PET) 영상화에 의해 검출된 뇌 조직 내의 타우 축적에 대한, CSF에서 검출된 p217+타우의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 10b는 타우병증의 뇌 병리를 구별함에 있어서 CSF에서의 p217+타우 측정치의 감도를 나타내는 도 7b의 데이터의 ROC 곡선을 나타낸다.
도 11a는 검증 코호트에서 본 출원의 예시적인 검정을 사용하여 혈장에서 검출된 p217+타우에 대한, CSF에서 검출된 p217+타우의 상관관계를 입증하는 추가의 데이터를 나타낸다.
도 11b는 0.089 이하의 CSF Aβ42/40 비를 갖는 아밀로이드 양성 환자에 대한 도 11a의 데이터 서브세트를 나타낸다.
도 11c는 0.089 초과의 CSF Aβ42/40 비를 갖는 아밀로이드 음성 환자에 대한 도 11a의 데이터 서브세트를 나타낸다.
도 12a는 본 출원의 예시적인 검정을 사용하여 혈장에서 검출된 p217+타우에 대한, CSF에서 검출된 p181타우의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 12b는 CSF p217+타우 수준을 구별함에 있어서 혈장에서의 p217+타우 측정치의 감도를 나타내는 도 12c의 데이터의 ROC 곡선을 나타낸다.
도 12c는 타우병증의 발생 위험이 없는 환자로부터 타우병증을 갖거나 타우병증의 발생 위험이 있는 환자를 구별하기 위한 혈장 p217+타우 및 CSF p217+타우에 대한 역치 값과 함께 도 11a의 데이터를 나타낸다.
도 12d는 CSF p217+타우 수준을 구별함에 있어서 혈장에서의 p217+타우 측정치의 감도를 나타내는 도 12e의 데이터의 ROC 곡선을 나타낸다.
도 12e는 인지 정상 대상체에 대한 도 12c의 데이터 서브세트를 나타낸다.
도 12f는 CSF p217+타우 수준을 구별함에 있어서 혈장에서의 p217+타우 측정치의 감도를 나타내는 도 12g의 데이터의 ROC 곡선을 나타낸다.
도 12g는 경증 내지 중등도 치매 대상체에 대한 도 12c의 데이터 서브세트를 나타낸다.
도 13a는 CSF에서의 Aβ42/40 비를 구별함에 있어서 혈장에서의 p217+타우 측정치의 감도를 나타내는 도 13b의 데이터의 ROC 곡선을 나타낸다.
도 13b는 본 출원의 예시적인 검정을 사용하여 혈장에서 검출된 p217+타우에 대한, CSF에서의 Aβ42/40 비의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 13c는 CSF에서의 Aβ42/40 비를 구별함에 있어서 혈장에서의 p217+타우 측정치의 감도를 나타내는 도 13d의 데이터의 ROC 곡선을 나타낸다.
도 13d는 인지 정상 대상체에 대한 도 13a의 데이터 서브세트를 나타낸다.
도 13e는 CSF에서의 비 Aβ42/40 비를 구별함에 있어서 혈장에서의 p217+타우 측정치의 감도를 나타내는 도 13f의 데이터의 ROC 곡선을 나타낸다.
도 13f는 경증 내지 중등도 치매 대상체에 대한 도 13a의 데이터 서브세트를 나타낸다.
도 14a는 본 출원의 예시적인 검정을 사용하여 비정제 혈장에서 검출된 p217+타우에 대한, CSF에서 검출된 p217+타우의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 14b는 본 출원의 예시적인 검정을 사용하여 화학적으로 추출된 혈장에서 검출된 p217+타우에 대한, CSF에서 검출된 p217+타우의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 14c는 본 출원의 예시적인 검정을 사용하여 반-변성 혈장에서 검출된 p217+타우에 대한, CSF에서 검출된 p217+타우의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 15a는 본 출원의 검정의 예시적인 실시 형태에 따라 얻어진 반-변성 혈장 샘플로부터 검출된 p217+타우에 대한 데이터를 나타낸다.
도 15b는 본 출원의 검정의 다른 예시적인 실시 형태에 대해 보정물질 펩티드를 사용하여 생성한 대표적인 보정 곡선을 나타내며, 여기서 샘플은 측정 전에 반-변성된다.
도 15c는 도 9b의 예시적인 검정의 시험내 정밀도를 입증하는 데이터를 나타내며, 여기서 샘플은 측정 전에 반-변성된다.
도 16a는 본 출원의 예시적인 실시 형태에 따라 바이오마커 특징으로서 혈청 p217+타우 수준을 사용하여 타우병증의 뇌 병리를 구별하기 위한 기계 학습 방법에 대한 ROC 곡선을 나타낸다.
도 16b는 본 출원의 예시적인 실시 형태에 따라 바이오마커 특징으로서 혈청 p217+타우 수준 및 신경필라멘트 경쇄(NFL)에 대한 데이터를 사용하여 타우병증의 뇌 병리를 구별하기 위한 기계 학습 방법에 대한 ROC 곡선을 나타낸다.
도 16c는 본 출원의 예시적인 실시 형태에 따라 바이오마커 특징으로서 혈청 p217+타우 수준 및 NFL 및 아디포넥틴에 대한 데이터를 사용하여 타우병증의 뇌 병리를 구별하기 위한 기계 학습 방법에 대한 ROC 곡선을 나타낸다.
도 16d는 본 출원의 예시적인 실시 형태에 따라 바이오마커 특징으로서 혈청 p217+타우 수준 및 NFL, 아디포넥틴, 및 렙틴에 대한 데이터를 사용하여 타우병증의 뇌 병리를 구별하기 위한 기계 학습 방법에 대한 ROC 곡선을 나타낸다.
도 16e는 본 출원의 예시적인 실시 형태에 따라 바이오마커 특징으로서 NFL, 아디포넥틴, 및 렙틴에 대한 데이터를 사용하여 타우병증의 뇌 병리를 구별하기 위한 기계 학습 방법에 대한 ROC 곡선을 나타낸다.
도 1b는 이전에 개시된 검정에 따라 얻어진 1:16 희석에서 혈장으로부터 검출된 p217+타우에 대한 데이터를 나타낸다.
도 1c는 이전에 개시된 검정에 따라 얻어진 반-변성 혈장 샘플로부터 검출된 p217+타우에 대한 데이터를 나타낸다.
도 1d는 이전에 개시된 검정에 따라 얻어진 면역침전 혈장 샘플로부터 검출된 p217+타우에 대한 데이터를 나타낸다.
도 2a는 이전에 개시된 검정에 따라 얻어진 CSF로부터의 p217+타우 측정치와 본 출원의 예시적인 검정에 따라 얻어진 CSF로부터의 p217+타우 측정치 사이의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 2b는 이전에 개시된 검정에 따라 얻어진 혈청에서 검출된 p217+타우 수준과 본 출원의 예시적인 검정에 따라 얻어진 혈청에서 검출된 p217+타우 수준을 비교하는 데이터를 나타낸다.
도 3a는 본 출원의 예시적인 실시 형태에 따른 2개의 상이한 검출 항체를 사용하여 얻어진 CSF로부터의 p217+타우 측정치 사이의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 3b는 본 출원의 예시적인 실시 형태에 따른 2개의 상이한 검출 항체를 사용하여 얻어진 혈청으로부터의 p217+타우 측정치 사이의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 3c는 본 출원의 예시적인 실시 형태에 따른 2개의 상이한 검출 항체를 사용하여 얻어진 혈장으로부터의 p217+타우 측정치 사이의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 4a는 본 출원의 예시적인 실시 형태에서 비드 클럼핑에 대한 상이한 샘플 희석제의 효과를 비교하는 데이터를 나타낸다.
도 4b는 본 출원의 예시적인 실시 형태에 의해 검출된 p217+타우 수준에 대한 상이한 샘플 희석제의 효과를 비교하는 데이터를 나타낸다.
도 5a는 본 출원의 예시적인 실시 형태에 따라 얻어진 혈청으로부터 검출된 p217+타우에 대한 데이터를 나타낸다.
도 5b는 본 출원의 예시적인 실시 형태에 따라 얻어진 혈장으로부터 검출된 p217+타우에 대한 데이터를 나타낸다.
도 5c는 도 5b에 나타낸 바와 같은 혈청으로부터 검출된 p217+타우와 도 5c에 나타낸 바와 같은 혈장으로부터 검출된 p217+타우 사이의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 5d는 도 5c에 나타낸 바와 같은 혈장으로부터 검출된 p217+타우와 도 5b에 나타낸 바와 같은 혈청으로부터 검출된 p217+타우 사이의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 6a는 본 출원의 검정의 예시적인 실시 형태에 대해 보정물질 펩티드를 사용하여 생성한 대표적인 보정 곡선을 나타낸다.
도 6b는 혈청 및 혈장에서의 본 출원의 예시적인 검정의 희석 직선성을 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 7a는 혈장에서의 본 출원의 예시적인 검정의 시험내 정밀도(intra-test precision)를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 7b는 혈장에서의 본 출원의 예시적인 검정의 시험간 정밀도(inter-test precision)를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 7c는 혈장에서의 본 출원의 예시적인 검정의 시험내 정밀도를 입증하는 추가의 데이터를 나타낸다.
도 8a는 AD 대상체에서 본 출원의 예시적인 검정을 사용하여 혈장에서 검출된 p217+타우에 대한, CSF에서 검출된 p217+타우의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 8b는 AD 대상체에서 본 출원의 예시적인 검정을 사용하여 혈장에서 검출된 p217+타우에 대한, CSF에서 검출된 p217+타우의 상관관계를 입증하는 추가의 데이터를 나타낸다.
도 9a는 검증 코호트에서 본 출원의 예시적인 검정을 사용하여 혈장에서 검출된 p217+타우에 대한, CSF에서 검출된 p217+타우의 상관관계를 입증하는 추가의 데이터를 나타낸다.
도 9b는 타우병증의 뇌 병리를 구별함에 있어서 본 출원의 예시적인 검정에 따라 얻어진 혈장 측정치의 감도를 나타내는 도 7b의 데이터의 수용자-반응 특성(ROC: Receiver-Operating Characteristic) 곡선을 나타낸다.
도 10a는 양전자 방출 단층 촬영(PET) 영상화에 의해 검출된 뇌 조직 내의 타우 축적에 대한, CSF에서 검출된 p217+타우의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 10b는 타우병증의 뇌 병리를 구별함에 있어서 CSF에서의 p217+타우 측정치의 감도를 나타내는 도 7b의 데이터의 ROC 곡선을 나타낸다.
도 11a는 검증 코호트에서 본 출원의 예시적인 검정을 사용하여 혈장에서 검출된 p217+타우에 대한, CSF에서 검출된 p217+타우의 상관관계를 입증하는 추가의 데이터를 나타낸다.
도 11b는 0.089 이하의 CSF Aβ42/40 비를 갖는 아밀로이드 양성 환자에 대한 도 11a의 데이터 서브세트를 나타낸다.
도 11c는 0.089 초과의 CSF Aβ42/40 비를 갖는 아밀로이드 음성 환자에 대한 도 11a의 데이터 서브세트를 나타낸다.
도 12a는 본 출원의 예시적인 검정을 사용하여 혈장에서 검출된 p217+타우에 대한, CSF에서 검출된 p181타우의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 12b는 CSF p217+타우 수준을 구별함에 있어서 혈장에서의 p217+타우 측정치의 감도를 나타내는 도 12c의 데이터의 ROC 곡선을 나타낸다.
도 12c는 타우병증의 발생 위험이 없는 환자로부터 타우병증을 갖거나 타우병증의 발생 위험이 있는 환자를 구별하기 위한 혈장 p217+타우 및 CSF p217+타우에 대한 역치 값과 함께 도 11a의 데이터를 나타낸다.
도 12d는 CSF p217+타우 수준을 구별함에 있어서 혈장에서의 p217+타우 측정치의 감도를 나타내는 도 12e의 데이터의 ROC 곡선을 나타낸다.
도 12e는 인지 정상 대상체에 대한 도 12c의 데이터 서브세트를 나타낸다.
도 12f는 CSF p217+타우 수준을 구별함에 있어서 혈장에서의 p217+타우 측정치의 감도를 나타내는 도 12g의 데이터의 ROC 곡선을 나타낸다.
도 12g는 경증 내지 중등도 치매 대상체에 대한 도 12c의 데이터 서브세트를 나타낸다.
도 13a는 CSF에서의 Aβ42/40 비를 구별함에 있어서 혈장에서의 p217+타우 측정치의 감도를 나타내는 도 13b의 데이터의 ROC 곡선을 나타낸다.
도 13b는 본 출원의 예시적인 검정을 사용하여 혈장에서 검출된 p217+타우에 대한, CSF에서의 Aβ42/40 비의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 13c는 CSF에서의 Aβ42/40 비를 구별함에 있어서 혈장에서의 p217+타우 측정치의 감도를 나타내는 도 13d의 데이터의 ROC 곡선을 나타낸다.
도 13d는 인지 정상 대상체에 대한 도 13a의 데이터 서브세트를 나타낸다.
도 13e는 CSF에서의 비 Aβ42/40 비를 구별함에 있어서 혈장에서의 p217+타우 측정치의 감도를 나타내는 도 13f의 데이터의 ROC 곡선을 나타낸다.
도 13f는 경증 내지 중등도 치매 대상체에 대한 도 13a의 데이터 서브세트를 나타낸다.
도 14a는 본 출원의 예시적인 검정을 사용하여 비정제 혈장에서 검출된 p217+타우에 대한, CSF에서 검출된 p217+타우의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 14b는 본 출원의 예시적인 검정을 사용하여 화학적으로 추출된 혈장에서 검출된 p217+타우에 대한, CSF에서 검출된 p217+타우의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 14c는 본 출원의 예시적인 검정을 사용하여 반-변성 혈장에서 검출된 p217+타우에 대한, CSF에서 검출된 p217+타우의 상관관계를 입증하는 데이터를 나타낸다.
도 15a는 본 출원의 검정의 예시적인 실시 형태에 따라 얻어진 반-변성 혈장 샘플로부터 검출된 p217+타우에 대한 데이터를 나타낸다.
도 15b는 본 출원의 검정의 다른 예시적인 실시 형태에 대해 보정물질 펩티드를 사용하여 생성한 대표적인 보정 곡선을 나타내며, 여기서 샘플은 측정 전에 반-변성된다.
도 15c는 도 9b의 예시적인 검정의 시험내 정밀도를 입증하는 데이터를 나타내며, 여기서 샘플은 측정 전에 반-변성된다.
도 16a는 본 출원의 예시적인 실시 형태에 따라 바이오마커 특징으로서 혈청 p217+타우 수준을 사용하여 타우병증의 뇌 병리를 구별하기 위한 기계 학습 방법에 대한 ROC 곡선을 나타낸다.
도 16b는 본 출원의 예시적인 실시 형태에 따라 바이오마커 특징으로서 혈청 p217+타우 수준 및 신경필라멘트 경쇄(NFL)에 대한 데이터를 사용하여 타우병증의 뇌 병리를 구별하기 위한 기계 학습 방법에 대한 ROC 곡선을 나타낸다.
도 16c는 본 출원의 예시적인 실시 형태에 따라 바이오마커 특징으로서 혈청 p217+타우 수준 및 NFL 및 아디포넥틴에 대한 데이터를 사용하여 타우병증의 뇌 병리를 구별하기 위한 기계 학습 방법에 대한 ROC 곡선을 나타낸다.
도 16d는 본 출원의 예시적인 실시 형태에 따라 바이오마커 특징으로서 혈청 p217+타우 수준 및 NFL, 아디포넥틴, 및 렙틴에 대한 데이터를 사용하여 타우병증의 뇌 병리를 구별하기 위한 기계 학습 방법에 대한 ROC 곡선을 나타낸다.
도 16e는 본 출원의 예시적인 실시 형태에 따라 바이오마커 특징으로서 NFL, 아디포넥틴, 및 렙틴에 대한 데이터를 사용하여 타우병증의 뇌 병리를 구별하기 위한 기계 학습 방법에 대한 ROC 곡선을 나타낸다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그렇지 않으면, 본 명세서에 사용되는 소정의 용어는 본 명세서에 기재된 바와 같은 의미를 갖는다. 본 명세서에 인용된 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 간행물은 마치 본 명세서에 완전히 기재되어 있는 것처럼 참고로 포함된다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수 형태(부정 관사 및 정관사)는, 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다는 것에 유의한다.
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에 기재된 농도 또는 농도 범위와 같은 임의의 수치 값은 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 수치 값은 전형적으로 인용된 값의 ±10%를 포함한다. 예를 들어, 1 mg/mL의 농도는 0.9 mg/mL 내지 1.1 mg/mL를 포함한다. 마찬가지로, 1% 내지 10% (w/v)의 농도 범위는 0.9% (w/v) 내지 11% (w/v)를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한, 수치 범위의 사용은 모든 가능한 하위범위, 그 범위 내의 모든 개별 수치 값, 예를 들어 그러한 범위 내의 정수 및 값의 분율을 명시적으로 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체" 또는 "면역글로불린"은 항원 또는 이의 부분에 결합할 수 있는 특이적 단백질을 지칭한다. 이들 용어는 본 명세서에서 넓은 의미로 사용되며, 다중클론 항체, 단일클론 항체(뮤린(murine), 인간, 인간-적응화, 인간화, 및 키메라 단일클론 항체를 포함함) 및 항체 단편을 포함하는 면역글로불린 또는 항체 분자를 포함한다.
일반적으로, 항체는 특정 항원에 대하여 결합 특이성을 나타내는 단백질 또는 펩티드 사슬이다. 항체 구조는 잘 알려져 있다. 면역글로불린은 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 따라, 5개의 주요 분류, 즉, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 정해질 수 있다. IgA 및 IgG는 동종형 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 추가로 하위분류된다. 따라서, 본 출원의 항체는 5개의 주요 부류 또는 상응하는 하위-부류 중 임의의 것일 수 있다. 바람직하게는, 본 출원의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4이다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 2개의 명확하게 구별되는 유형, 즉 카파 및 람다 중 하나로 정해질 수 있다. 따라서, 본 출원의 항체는 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인을 함유할 수 있다. 특정 실시 형태에 따라, 본 출원의 항체는 마우스 항체 또는 인간 항체로부터의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 더하여, 항체는 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 함유한다. 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은 "항원-결합 부위"가 개재된 "프레임워크" 영역으로 이루어진다. 항원-결합 부위는 하기와 같이 다양한 용어 및 넘버링 체계를 사용하여 정의된다:
(i)
카바트(Kabat): "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 서열 가변성에 기반한다(문헌[Wu and Kabat, J Exp Med. 132:211-50, 1970]). 일반적으로, 항원-결합 부위는 각각의 가변 영역 내에 3개의 CDR을 가짐(예를 들어, 중쇄 가변 영역(VH) 내의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 경쇄 가변 영역(VL) 내의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3);
(ii)
초티아(Chothia): 용어 "초가변 영역", "HVR"은 초티아 및 레스크(Lesk)에 의해 정의되는 바와 같이 구조에 있어서 초가변성인 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다(문헌[Chothia and Lesk, J Mol Biol. 196:901-17, 1987]). 일반적으로, 항원-결합 부위는 각각의 VH(H1, H2, H3) 및 VL(L1, L2, L3) 내에 3개의 초가변 영역을 갖는다. 넘버링 체계뿐만 아니라 CDR 및 HVR의 주석이 아히난단(Abhinandan) 및 마틴(Martin)에 의해 개정되었다(문헌[Abhinandan and Martin, Mol Immunol. 45:3832-9, 2008]);
(iii)
IMGT: 항원-결합 부위를 형성하는 영역의 다른 정의가 T-세포 수용체 및 면역글로불린으로부터의 V 도메인의 비교에 기반하여 레프란크(Lefranc)에 의해 제안되었다(문헌[Lefranc et al., Dev Comp Immunol . 27:55-77, 2003]). International ImMunoGeneTics(IMGT) 데이터베이스(http:_//www_imgt_org)는 이들 영역의 표준화된 넘버링 및 정의를 제공한다. CDR, HVR, 및 IMGT 기술 사이의 상응성은 문헌[Lefranc et al., 2003, 상동]에 기재되어 있다;
(iv)
항원-결합 부위는 또한 "특이성 결정 잔기 사용"(SDRU)에 기반하여 기술될 수 있으며(문헌[Almagro, Mol Recognit . 17:132-43, 2004]), 여기서 SDR은 항원 접촉에 직접 관여하는 면역글로불린의 아미노산 잔기를 지칭한다.
"프레임워크" 또는 "프레임워크 서열"은 항원-결합 부위 서열인 것으로 정의된 것들 외에 항체의 가변 영역 내에 남아 있는 서열이다. 항원-결합 부위의 정확한 정의는 상기와 같이 다양한 기술에 의해 결정될 수 있으므로, 정확한 프레임워크 서열은 항원-결합 부위의 정의에 따라 달라진다. 프레임워크 영역(FR)은 가변 도메인의 더 고도로 보존된 부분이다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR(각각 FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 포함하며, 이들은 일반적으로 3개의 초가변 루프에 의해 연결된 베타-시트 구성을 채택한다. 각각의 사슬 내의 초가변 루프들은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되며, 이때 다른 사슬로부터의 초가변 루프들은 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. 항체의 구조 분석은 상보성 결정 영역에 의해 형성된 결합 부위의 서열과 형상 사이의 관계를 규명하였다(문헌[Chothia et al., J. ol . Biol. 227: 799-817, 1992]; 문헌[Tramontano et al., J. Mol . Biol. 215:175-182, 1990]). 높은 서열 가변성에도 불구하고, 6개의 루프 중 5개가 "표준 구조"라고 불리는 주쇄 입체구조의 작은 레퍼토리(repertoire)만을 채택한다. 이들 입체구조는 무엇보다 먼저 루프의 길이에 의해 결정되고, 둘째로, 팩킹(packing), 수소 결합 또는 통상적이지 않은 주쇄 입체구조를 추정하는 능력을 통해 입체구조를 결정하는, 루프 내의 그리고 프레임워크 영역 내의 소정의 위치에서의 주요 잔기의 존재에 의해 결정된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항원-결합 단편"은 항체 단편, 예컨대 다이아바디(diabody), Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 이황화물 안정화된 Fv 단편(dsFv), (dsFv)2, 이중특이성 dsFv(dsFv-dsFv'), 이황화물 안정화된 다이아바디(ds 다이아바디), 단일쇄 항체 분자(scFv), 단일 도메인 항체(sdab), scFv 이량체(2가 다이아바디), 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체의 일부로부터 형성된 이중특이성 또는 다중특이성 항체, 낙타화(camelized) 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체, 2가 도메인 항체, 또는 항원에 결합하지만 완전한 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 단편을 지칭한다. 항원-결합 단편은 모 항체 또는 모 항체 단편이 결합하는 것과 동일한 항원에 결합할 수 있다. 특정 실시 형태에 따르면, 항원-결합 단편은 경쇄 가변 영역, 경쇄 불변 영역, 및 중쇄의 불변 영역의 Fd 세그먼트를 포함한다. 다른 특정 실시 형태에 따르면, 항원-결합 단편은 Fab 및 F(ab')을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "에피토프"는 면역글로불린, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 연속 아미노산으로부터 또는 단백질의 3차 접힘에 의해 병치된 불연속 아미노산으로부터 이들 둘 모두로부터 형성될 수 있다. 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 대한 노출 시에 보유되는 반면, 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 의한 처리 시에 상실된다. 에피토프는 전형적으로 특유의 공간 입체구조로 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간 입체구조를 결정하는 방법은, 예를 들어 X-선 결정구조해석 및 2차원 핵자기 공명을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)]을 참조한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "타우" 또는 "타우 단백질"은 다수의 아이소형을 갖는 풍부한 중추 및 말초 신경계 단백질을 지칭한다. 인간 중추 신경계(CNS)에는, 대안적 스플라이싱으로 인해 크기가 352 내지 441개 아미노산 길이의 범위인 6개의 주요 타우 아이소형이 존재한다(문헌[Hanger et al., Trends Mol Med. 15:112-9, 2009]). 아이소형은, 0 내지 2개의 N-말단 삽입체, 및 3 또는 4개의 직렬로 배열된 미세소관-결합 반복체의 조절된 포함에 의해 서로 상이하며, 0N3R, 1N3R, 2N3R, 0N4R, 1N4R, 및 2N4R로 지칭된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대조군 타우"는 인산화 및 다른 번역후 변형이 없는 서열 번호 1의 타우 아이소형을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "타우"는 돌연변이, 예를 들어, 전장 야생형 타우의 점 돌연변이, 단편, 삽입, 결실, 및 스플라이스 변이체를 포함하는 단백질을 포함한다. 용어 "타우"는 또한, 타우 아미노산 서열의 번역후 변형을 포함한다. 번역후 변형은 인산화를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
달리 지시되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 타우 단백질 또는 이의 단편 내의 아미노산의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 참조한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "p217+타우 펩티드", "p217+타우", 또는 "p217+타우 단백질"은 타우 단백질의 잔기 217에서 인산화되고(pT217) 부가적인 잔기, 예를 들어, 타우 단백질의 잔기 212에서 추가로 인산화되거나(pT212) 인산화되지 않을 수 있는 인간 타우 단백질 또는 타우 단편을 의미하며, 여기서 위치의 넘버링은 서열 번호 1에서의 넘버링에 따른다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "p217+타우 에피토프"는 인산화된 T217 및 인산화된 T212 중 하나 이상을 함유하는 타우 에피토프를 지칭하며, 여기서 위치의 넘버링은 서열 번호 1에서의 넘버링에 따른다. p217+타우 에피토프의 예는, 예를 들어, pT3 에피토프를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "pT3 에피토프"는 잔기 217에서 인산화되고 부가적인 잔기, 예를 들어, 잔기 212에서 추가로 인산화되거나 인산화되지 않을 수 있는 인간 타우 단백질의 아미노산 210 내지 220을 함유하는 에피토프를 지칭하며, 여기서 위치의 넘버링은 서열 번호 1에서의 넘버링에 따른다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 각각의 용어 "긴 p217+타우 펩티드", "긴 p217+타우", "긴 형태의 p217+타우 펩티드", 또는 "긴 p217+타우 펩티드 단편"은 동일한 의미를 가지며, p217+타우 에피토프 및 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프를 포함하는 p217+타우 펩티드를 지칭한다. 본 출원의 실시 형태에 따른 "긴 p217+타우 펩티드"는 상이한 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, "긴 p217+타우 펩티드 단편"의 아미노-말단은 타우 단백질의 아미노산 잔기 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 수 있다. 일례에서, "긴 p217+ 타우 펩티드"는 p217+타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 220을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 각각의 용어 "짧은 p217+타우 펩티드", "짧은 p217+타우", "짧은 형태의 p217+타우 펩티드", 또는 "짧은 p217+타우 펩티드 단편"은 동일한 의미를 가지며, p217+타우 에피토프 및 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프를 포함하지만 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프는 함유하지 않는 p217+타우 펩티드를 지칭한다. 본 출원의 실시 형태에 따른 "짧은 p217+타우 펩티드"는 상이한 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, "짧은 p217+타우 펩티드"의 아미노-말단은 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프와 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프 사이에 있는 아미노산 잔기 중 임의의 것일 수 있다. 일례에서, "짧은 p217+ 타우 펩티드"는 p217+타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 220을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 각각의 용어 "긴 타우 펩티드", "긴 타우", "긴 형태의 타우 펩티드", 또는 "긴 타우 펩티드 단편"은 동일한 의미를 가지며, 인산화-독립적 포획 항체에 의해 인식되는 타우 에피토프 및 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프를 포함하는 타우 펩티드를 지칭한다. 본 출원의 실시 형태에 따른 "긴 타우 펩티드 단편"은 상이한 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, "긴 타우 펩티드 단편"의 아미노-말단은 타우 단백질의 아미노산 잔기 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 각각의 용어 "짧은 타우 펩티드", "짧은 타우", "짧은 형태의 타우 펩티드", 또는 "짧은 타우 펩티드 단편"은 동일한 의미를 가지며, 인산화-독립적 포획 항체에 의해 인식되는 타우 에피토프 및 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프를 포함하지만 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프는 함유하지 않는 타우 펩티드를 지칭한다. 본 출원의 실시 형태에 따른 "짧은 타우 펩티드 단편"은 상이한 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, "짧은 타우 펩티드"의 아미노-말단은 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프와 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프 사이에 있는 아미노산 잔기 중 임의의 것일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포획 항체"는 관심 항원에 결합하고 고체 지지체에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 항체를 지칭한다. 고체 지지체의 예는 미세입자 또는 비드, 예컨대 자성 비드 또는 상자성 비드를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 포획 항체의 예는 p217+타우 에피토프에 결합하는 단일클론 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본 출원의 실시 형태에 따라, 포획 항체는 각각 서열 번호 23, 24, 및 25의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3, 및 서열 번호 26, 27, 및 28의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 단일클론 항체일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 포획 항체는 pT3이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "pT3"은 p217+타우 펩티드에 결합하고 서열 번호 19의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 번호 20의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 항체를 지칭한다. 일 실시 형태에서, pT3 단일클론 항체는 마우스-하이브리도마에 의해 발현된다. 다른 실시 형태에서, 포획 항체는 서열 번호 21의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 번호 22의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체이다.
본 출원의 다른 실시 형태에 따라, 포획 항체는 타우 단백질의 아미노산 150 내지 250, 바람직하게는 인간 타우 단백질의 아미노산 211 내지 221 또는 아미노산 159 내지 163의 에피토프에 인산화-독립적 방식으로 결합하는 단일클론 항체일 수 있으며, 위치의 넘버링은 서열 번호 1에서의 넘버링에 따른다. 특정 실시 형태에서, 포획 항체는 hT7이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "hT7"은 인간 타우 단백질의 아미노산 159 내지 163을 포함하는 에피토프에 결합하는 공개적으로 이용가능한 단일클론 항체를 지칭하며, 여기서 위치의 넘버링은 서열 번호 1에서의 넘버링에 따른다. hT7 단일클론 항체는, 예를 들어, ThermoFisher(예를 들어, 카탈로그 번호: MN1000)로부터 구매가능하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "검출 항체"는 관심 항원에 결합하며 검출가능한 표지를 갖거나 2차 검출 시스템에 연결된 항체를 지칭한다. 검출가능한 표지의 예는 다양한 효소, 보결 분자단, 형광 재료, 발광 재료, 생물발광 재료, 및 방사성 재료를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 검출 항체의 예는 타우 단백질, 바람직하게는 인간 타우 단백질의 아미노산 7 내지 20 또는 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 결합하는 단일클론 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않으며, 여기서 위치의 넘버링은 서열 번호 1에서의 넘버링에 따른다. 아미노산 7 내지 20을 포함하는 에피토프에서 타우 단백질에 결합하는 단일클론 항체가 포획된 p217+타우 펩티드에 대한 검출 항체로 사용될 경우, 긴 타우 단편이 검출된다. 아미노산 116 내지 127을 포함하는 에피토프에서 타우 단백질에 결합하는 단일클론 항체가 포획된 p217+타우 펩티드에 대한 검출 항체로 사용될 경우, 짧은 타우 단편 및 긴 타우 단편 둘 모두가 검출된다.
본 출원의 실시 형태에 따라, 검출 항체는 각각 서열 번호 10, 11, 및 12의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3, 및 서열 번호 13, 14, 및 15의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 단일클론 항체일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 검출 항체는 hT43이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "hT43"은 인간 타우 단백질의 아미노산 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 결합하는 단일클론 항체를 지칭하며, 여기서 위치의 넘버링은 서열 번호 1에서의 넘버링에 따르고, 항체는 서열 번호 16의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 번호 17의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는다.
다른 실시 형태에서, 검출 항체는 각각 서열 번호 2, 3, 및 4의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3, 및 서열 번호 5, 6, 및 7의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 단일클론 항체일 수 있다. 다른 특정 실시 형태에서, 검출 항체는 pT82이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "pT82"은 인간 타우 단백질의 아미노산 119 내지 126, 바람직하게는 117 내지 127을 포함하는 에피토프에 결합하는 단일클론 항체를 지칭하며, 여기서 위치의 넘버링은 서열 번호 1에서의 넘버링에 따르고, 항체는 서열 번호 8의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 번호 9의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "pT3-기반 검정"은 pT3 항체가 포획 항체로 사용되는 검정을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "pT3xhT43"은 pT3 항체가 포획 항체로 사용되고 hT43 항체가 검출 항체로 사용되는 검정을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "pT3xpT82"는 pT3 항체가 포획 항체로 사용되고 pT82 항체가 검출 항체로 사용되는 검정을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "hT7-기반 검정"은 hT7 항체가 포획 항체로 사용되는 검정을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "hT7xpT82"는 hT7 항체가 포획 항체로 사용되고 pT82 항체가 검출 항체로 사용되는 검정을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 동물, 바람직하게는 포유류를 지칭한다. 특정 실시 형태에 따라, 대상체는 비-영장류(예를 들어, 낙타, 당나귀, 얼룩말, 소, 돼지, 말, 염소, 양, 고양이, 개, 래트, 토끼, 기니 피그, 마모셋, 또는 마우스) 또는 영장류(예를 들어, 원숭이, 침팬지, 또는 인간)를 포함하는 포유류이다. 특정 실시 형태에서, 대상체는 인간이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "타우병증"은 뇌 내에 타우의 병리학적 응집을 수반하는 임의의 신경퇴행성 질병을 포함한다. 가족성 및 산발성 AD에 더하여, 다른 예시적인 타우병증은 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반하는 전측두엽 치매(FTDP-17), 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 픽병, 진행성 피질하 신경교증, 농축체 단독 치매, 석회화를 동반하는 광범위 신경섬유 매듭, 은친화성 과립성 치매, 근위축성 측삭 경화증 파킨슨증-치매 복합군, 다운 증후군, 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커병, 할러포르텐-스파츠병, 봉입체 근염, 크로이츠펠트-야콥병, 다계통 위축증, C형 니만-픽병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아급성 경화성 범뇌염, 근긴장성 이영양증, 신경섬유 매듭을 동반하는 비-괌 운동 신경세포병, 뇌염후 파킨슨증, 및 만성 외상성 뇌병증, 예컨대 권투선수 치매(복싱병)이다(문헌[Morris et al., Neuron, 70:410-26, 2011]).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "아밀로이드성 질환"은 불용성 아밀로이드 피브릴의 형성 또는 침착과 관련된(또는 이에 의해 야기되는) 임의의 질환을 포함한다. 예시적인 아밀로이드성 질환은 전신 아밀로이드증, 알츠하이머병, 성인 발병 당뇨병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 전두-측두엽 치매, 및 프리온-관련 전염성 해면양뇌증(인간에서의 쿠루병 및 크로이츠펠트-야콥병 및 각각 양 및 소에서의 스크래피 및 BSE)을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 상이한 아밀로이드성 질환은 침착된 피브릴의 폴리펩티드 성분의 성질에 의해 정의되거나 특성화된다. 예를 들어, 알츠하이머병을 갖는 대상체 또는 환자에서, β-아밀로이드 단백질(예를 들어, 야생형, 변이체, 또는 절단된 β-아밀로이드 단백질)은 아밀로이드 침착물의 특징적인 폴리펩티드 성분이다. 따라서, 알츠하이머병은, 예를 들어, 대상체 또는 환자의 뇌에서의 "Aβ의 침착을 특징으로 하는 질환" 또는 "Aβ의 침착과 관련된 질환"의 예이다. 용어 "β-아밀로이드 단백질", "β-아밀로이드 펩티드", "β-아밀로이드", "Aβ", 및 "Aβ 펩티드"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "결정", "측정", "평가", 및 "검정"은 상호교환적으로 사용되며 정량적 및 정성적 결정 둘 모두를 포함한다. 이들 용어는 임의의 측정 형태를 지칭하며, 특성, 속성, 또는 특징이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 평가는 상대적이거나 절대적일 수 있다. "~의 존재를 평가하는 단계"는 존재하는 무언가의 양을 결정하는 단계뿐만 아니라, 그것이 존재하는지 또는 부재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "진단"은 질환 또는 장애를 검출하는 단계 또는 질환 또는 장애, 예컨대 타우병증 또는 아밀로이드성 질환의 병기 또는 정도를 결정하는 단계를 의미한다. 일반적으로, 질환 또는 장애의 진단은 질환을 나타내는 하나 이상의 인자 및/또는 증상의 평가에 기반한다. 진단은 질환 또는 병태의 존재 또는 부재를 나타내는 인자, 예를 들어, p217+타우의 존재, 부재, 또는 양에 기반하여 이루어질 수 있다. 특정 질환의 진단을 나타내는 것으로 간주되는 각각의 인자 또는 증상은 배타적으로 특정 질환에 관한 것일 필요가 없으며, 즉, 진단 인자 또는 증상으로부터 추론될 수 있는 감별 진단이 있을 수 있다. 마찬가지로, 특정 질환을 나타내는 인자 또는 증상이 특정 질환을 갖지 않는 개체에 존재하는 경우가 있을 수 있다. 용어 "진단"은 약물 요법, 예를 들어, 항-p217+타우 항체 요법의 치료 효과를 결정하는 단계, 또는 약물 요법, 예를 들어, 항-p217+타우 항체 요법에 대한 반응의 패턴을 예측하는 단계를 또한 포함한다. 진단 방법은 특정 질환 또는 장애, 예를 들어, 알츠하이머병에 대해 의학 분야에 알려진 다른 진단 및/또는 병기 결정 방법과 독립적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "증가" 및 "감소"는 대조군 또는 참조 수준에 비교한 샘플 내의 특정 바이오마커의 양의 차이를 지칭한다. 예를 들어, 특정 펩티드의 양은 참조 수준에 비교하여 질환을 갖는 환자의 샘플 내에 상승된 양 또는 감소된 양으로 존재할 수 있다. 일 실시 형태에서, "수준의 증가" 또는 수준의 감소"는, 약 1% 이상, 약 2% 이상, 약 3% 이상, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상의, 대조군에 비교하여 샘플 내에 존재하는 바이오마커의 수준 사이의 차이일 수 있다. 일 실시 형태에서, "수준의 증가" 또는 "수준의 감소"는 대조군에 비교하여 샘플 내에 존재하는 바이오마커의 수준 사이의 통계적으로 유의한 차이일 수 있다. 예를 들어, 바이오마커의 측정된 수준이 임의의 대조군 또는 참조군의 평균의 약 1.0 표준 편차, 약 1.5 표준 편차, 약 2.0 표준 편차, 또는 약 2.5 표준 편차를 벗어난다면, 차이는 통계적으로 유의할 수 있다. 참조군 또는 대조군은, 예를 들어, 건강한 개체로부터의 샘플, 또는 이전 시점, 예컨대 치료제의 투여 전의 시점 또는 치료 계획 중의 이전 시점에 동일한 개체로부터 채취된 샘플일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된"은 생물학적 성분(예컨대 핵산, 펩티드, 또는 단백질)이, 그 성분이 천연 발생하는 유기체의 다른 생물학적 성분들, 즉, 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 및 단백질로부터 실질적으로 분리되거나, 따로 생성되거나, 정제되었음을 의미한다. 따라서, "단리된" 핵산, 펩티드 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질을 포함한다. "단리된" 핵산, 펩티드 및 단백질은 조성물의 일부일 수 있고, 그러한 조성물이 핵산, 펩티드, 또는 단백질의 천연 환경의 일부가 아닌 경우 여전히 단리될 수 있다. 이 용어는 또한 숙주 세포에서의 재조합 발현에 의해 제조된 핵산, 펩티드 및 단백질뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산도 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "타우 단백질에 결합하는 단리된 항체" 또는 "단리된 항-타우 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 타우 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다(예를 들어, 단리된 항-타우 검출 항체에는 타우 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, 단리된 항-타우 검출 항체는, 예를 들어 다른 종으로부터의 다른 관련 항원(예컨대 타우 종 상동체)에 대한 교차-반응성을 가질 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적 결합"은 본 출원의 항-타우 항체가 약 1x10-6 M 이하, 예를 들어, 약 1x10-7 M 이하, 약 1x10-8 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 약 1x10-12 M 이하, 또는 약 1x10-13 M 이하의 해리 상수(KD)로 사전결정된 표적에 결합하는 능력을 지칭한다. KD는 Kd 대 Ka의 비(즉, Kd/Ka)로부터 얻어지며, 몰농도(M)로 표현된다. 항체에 대한 KD 값은 본 발명을 고려하여 당업계의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 항-타우 항체의 KD 값은 표면 플라즈몬 공명을 사용함으로써, 예컨대 바이오센서 시스템, 예를 들어, Biacore® 시스템, ProteOn 기기(BioRad), KinExA 기기(Sapidyne), 당업자에게 알려진 ELISA 또는 경쟁적 결합 검정을 사용함으로써 결정될 수 있다. 전형적으로, 항-타우 항체는, 예를 들어, Proteon 기기(BioRad)를 사용하는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정될 때 비특이적 표적에 대한 그의 KD보다 10배 이상 더 작은 KD로 사전결정된 표적(즉, 타우)에 결합한다. 그러나, 타우에 특이적으로 결합하는 항-타우 항체는 다른 관련 표적에 대해, 예를 들어, 마우스, 래트, 마모셋, 개, 또는 돼지와 같은 다른 종으로부터의 동일한 사전결정된 표적(상동체)에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 동의어로서 "핵산 분자", "뉴클레오티드", 또는 "핵산"으로 지칭되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭하며, 이는 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있다. "폴리뉴클레오티드"는, 제한 없이, 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일-가닥, 또는 더 전형적으로는 이중-가닥일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하거나 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물을 포함하는 하이브리드 분자를 포함한다. 게다가, "폴리뉴클레오티드"는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘 모두를 포함하는 삼중-가닥 영역을 지칭한다. 용어 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA 또는 RNA, 및 안정성 또는 다른 이유로 골격이 변형된 DNA 또는 RNA를 포함한다. "변형된" 염기는, 예를 들어 트리틸화(tritylated) 염기 및 통상이 아닌 염기, 예컨대 이노신을 포함한다. DNA 및 RNA에 대해 다양한 변형이 실행될 수 있으며; 따라서, "폴리뉴클레오티드"는 천연에서 전형적으로 발견되는 바와 같은 폴리뉴클레오티드의 화학적으로, 효소적으로, 또는 대사적으로 변형된 형태뿐만 아니라, 바이러스 및 세포에 특징적인 DNA 및 RNA의 화학적 형태도 포함한다. "폴리뉴클레오티드"는, 종종 올리고뉴클레오티드로 지칭되는 비교적 짧은 핵산 사슬을 또한 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "조절하거나, 개선하거나, 치료하는 단계" 또는 "치료"는, 신체적 및/또는 정신적 병태의 예방, 또는 일단 그것이 확립되었으면 발생된 신체적 및/또는 정신적 병태의 개선 또는 제거, 또는 그러한 병태의 특징적인 증상의 경감을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "정확도"는 검정의 참값에 대한 값의 근접도를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "정밀도"는 검정의 동일한 균질한 샘플의 다수의 샘플링으로부터 얻어진 일련의 측정치들 사이의 일치 근접도(closeness of agreement)를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "감도"는 검정에서 허용가능한 정확도 및 정밀도로 측정할 수 있는 샘플 내의 최저 분석물 농도를 지칭한다.
본 출원은 혈액-기반 샘플, 특히 혈장에서 단일- 또는 다중-인산화된 p217+타우 펩티드를 검출하기 위한 검정 및 방법을 제공한다. 혈액 샘플의 수집은 빠르고 수행하기 용이하며, CSF의 수집에 사용되는 요추 천자에 비교하여 감염 또는 다른 합병증의 감소된 위험을 제공한다. 본 출원의 검정 및 방법은 충분한 감도, 정밀도, 및 정확도를 갖는 혈액-기반 샘플 내의 p217+타우 펩티드를 측정한다. 따라서, 본 출원은 대상체에 대한 샘플 수집의 부담을 최소화하고 이에 의해 p217+타우 수준의 변화의 더 빈번한 검정 및 모니터링을 가능하게 함으로써, CSF-기반 검정에 비교하여 대상체에서 p217+타우 수준을 측정하고/하거나 모니터링하기 위한 개선된 방식을 제공하며, 이는 치료에 대한 반응을 모니터링하고 평가하기 위해 특히 요구된다. 본 출원의 검정 및 방법에 사용되는 샘플은 혈액, 혈청, 또는 혈장 샘플일 수 있다. 바람직하게는, 샘플은 혈장 샘플이다. 더욱 바람직하게는, 혈장 샘플은 그 안에 함유된 p217+타우 펩티드를 농축하기 위해 면역침전되지 않았다. 특정 실시 형태에서, 샘플은 비정제 혈장 샘플이다.
본 출원의 검정 및 방법은 샘플 내의 p217+타우 펩티드에 결합하는 포획 항체를 사용함에 의한 혈액-기반 샘플 내의 p217+타우 펩티드의 측정에 관한 것이다. 포획 항체가 샘플 내에 존재하는 p217+타우 펩티드에 선택적으로 결합하고 이를 고체상에 고정시키도록, 포획 항체는 바람직하게는 고체상에 고정된다. 별도의 단계에서, 포획된 p217+타우 펩티드는 항-타우 검출 항체와 접촉되며, 이는 포획된 p217+타우 종의 검출을 허용하는 리포터 요소로 표지된다. 본 명세서에 기재된 검정 및 방법은 다양한 진단 목적을 위해, 예를 들어, 대상체에서 AD, 다른 타우병증, Aβ의 침착을 특징으로 하는 다른 질환, 또는 다른 아밀로이드성 질환을 진단하기 위해, 치료의 유효성을 모니터링하기 위해, 항-p217+타우 치료에 적합한 대상체를 식별하기 위해, AD, 다른 타우병증, Aβ의 침착을 특징으로 하는 다른 질환, 또는 다른 아밀로이드성 질환의 추가의 검출을 위한 PET 영상화 및/ CSF 검정에 대해 대상체를 사전-스크리닝하기 위해, AD, 다른 타우병증, Aβ의 침착을 특징으로 하는 다른 질환, 또는 다른 아밀로이드성 질환 등에 관련된 임상 시험에서의 등록을 위한 대상체의 식별을 위해 사용될 수 있다.
예시적인 일 실시 형태에서, 본 출원의 검정 및 방법은 혈액-기반 샘플을 p217+타우 에피토프에 대해 지향된 포획 항체와 접촉시켜 포획 항체를 샘플 내의 p217+타우 펩티드에 결합시켜 항체-펩티드 복합체를 생성하는 단계, 및 이어서 항체-펩티드 복합체를 세척하는 단계를 포함한다. 항체-펩티드 복합체는, 예를 들어, 완충 용액(예를 들어, 포스페이트-완충 식염(PBS) 용액)과 같은, 검정을 방해하지 않는 임의의 적합한 용액으로 세척할 수 있다. 이어서, 세척된 항체-펩티드 복합체를 검출 항체와 접촉시켜 검출 항체를 항체-펩티드 복합체에 결합시킬 수 있다. 이어서, 검출 항체를 검출하여 샘플 내의 p217+타우 펩티드의 양을 결정한다.
본 명세서에 전체적으로 참고로 포함되는, 콜브(Kolb) 등에 의한 미국 특허 제10,591,492호(이하 "콜브 '492 특허")에는 생물학적 샘플 내의 p217+타우 펩티드를 측정하기 위한 검정이 개시된다. 생물학적 샘플은 뇌척수액(CSF), 혈액, 또는 뇌 균질물을 포함할 수 있다. 콜브 '492 특허에서는, 비정제 혈청 또는 혈장에서의 타우 측정이 이상적인 진단 성능을 나타내지 않으며, 감도 및 매트릭스 간섭 장애에 의해 방해될 수 있다는 것이 관찰되었다. 하기 입증된 바와 같이, 비정제 혈청에서의 측정은 콜브 '492 특허에 기재된 검정이 충분한 감도를 제공할 수 없었음을 나타냈으며, 이는 대부분의 측정치가 허용가능한 정밀도 및 정확도로 정량적으로 결정될 수 있는 분석물의 최저량을 지칭하는 그의 검정의 정량 하한(LLOQ) 미만이었고, 샘플을 면역침전시킨 후에 용리액을 열 변성시킨 후에만 검출가능한 것으로 나타났기 때문이다. 하기 제공된 실시예 3은, 동일한 혼합물 내에서 단일 단계로 샘플을 포획 항체 및 검출 항체 둘 모두와 조합하는 콜브 '492 특허에 기재된 pT3xpT82 검정이, 혈장 중의 p217+타우 펩티드를 측정하기 위해 사용되는 경우에 감도 및 희석 직선성이 결여됨을 입증한다.
반면에, p217+타우 펩티드의 수준은 CSF에 비교하여 혈액-기반 샘플에서 유의하게 더 낮지만, 본 출원의 검정 및 방법은 의외로 측정 전에 먼저 면역침전에 의해 샘플 내의 p217+타우 펩티드를 농축시키지 않으면서 개선된 감도로 인간 혈청 및/또는 혈장 샘플로부터 p217+타우 펩티드를 측정할 수 있다. 면역침전은 번거롭고 비정밀한 과정이다. 따라서, 본 출원은 측정 전에 샘플을 면역침전시키는 부담이 있는 전처리 없이 p217+타우 펩티드를 측정하기 위한 감도를 개선하는 개선된 검정 및 방법을 제공한다. 특히, (1) 포획 항체를 혈청 및/또는 혈장 샘플 내에 존재하는 p217+타우 펩티드에 결합시켜 항체-펩티드 복합체를 형성하고, (2) 항체-펩티드 복합체를 검출 항체에 결합시키는 별도의 단계들은, 검정이 혈청 및/또는 혈장 내의 p217+타우 펩티드를 검출하기에 충분히 민감하도록, 샘플 내의 다른 성분(예를 들어, 내인성으로 생성되거나 외인성으로 투여된 간섭 항체)으로부터의 간섭을 성공적으로 감소시킬 수 있다는 것이 의외로 확인되었다. 일 실시 형태에서, 샘플을 먼저 포획 항체와 접촉시켜 포획 항체를 샘플 내의 p217+타우 펩티드에 결합시킨 후, 검정을 방해할 수 있는 임의의 결합되지 않은 성분을 제거하기 위해 세척할 수 있다. 세척 후에, 포획된 p217+타우 펩티드를 이어서 검출 항체와 접촉시켜 검출 항체를 포획된 p217+타우 펩티드에 결합시킨다. 하기 제공된 실시예 4는, 동일한 혼합물 내에서 단일 단계로 샘플을 포획 항체 및 검출 항체 둘 모두와 조합하는 콜브 '492 특허에 기재된 검정을 사용하여 혈청 중의 p217+타우 펩티드를 측정하는 경우, CSF에서는 관찰되지 않은 간섭 성분에 상응하는 아티팩트 신호가 관찰된다는 것을 추가로 입증한다. 그러나, 본 출원에 기재된 바와 같이 포획 항체 및 검출 항체를 p217+타우 펩티드에 결합시키는 별도의 단계를 포함하는 예시적인 방법을 사용하여 얻어진 p217+타우 측정치의 경우에는 이러한 아티팩트 신호가 존재하지 않는다.
또한, 실시예 7에서 하기 추가로 나타낸 바와 같이, 본 출원의 검정 및 방법은 혈장에서 검출가능한 p217+타우의 의외로 증가된 수준으로 인해 인간 혈청 샘플에 비교하여 인간 혈장 샘플로부터 p217+타우 펩티드를 측정할 경우에 의외로 더 민감하다는 것이 또한 의외로 확인되었다. 본 출원의 검정 및 방법은, 건강한 대상체 및 타우병증, 더욱 구체적으로 AD를 갖거나 발생 위험이 있는 대상체 둘 모두에 대해 p217+타우 펩티드를 측정하고 정확하고 정밀한 정량적 결과를 제공할 수 있다. 본 출원의 검정 및 방법은 또한, 건강한 대상체 및 아밀로이드성 질환을 갖거나 발생 위험이 있는 대상체에 대해, 특히 치매(예를 들어, 경증 내지 중등도 치매)를 갖는 대상체에서, p217+타우 펩티드를 측정하고 정확하고 정밀한 정량적 결과를 제공할 수 있다. 구체적으로, 본 검정 및 방법은 본 출원의 검정의 LLOQ를 초과하는 둘 모두의 군의 대상체의 혈장 샘플로부터 p217+타우 펩티드를 측정할 수 있으며, 이는 허용가능하고 신뢰성 있는 감도 수준을 나타낸다. 검정의 LLOQ는 검정의 변동 계수(CV: coefficient of variation)의 15% 내지 25% 이내, CV의 15% 내지 20% 이내, 또는 바람직하게는 CV의 20% 이내일 수 있다. 추가로, 건강한 대상체의 혈장 샘플로부터 본 출원의 검정 및 방법에 따라 얻어진 p217+타우 측정치는 AD 대상체로부터의 측정치로부터 수치적으로 분리가능하다. 따라서, 본 출원의 검정 및 방법은 AD 대상체로부터 건강한 대상체를 식별하기 위해 사용될 수 있는 정확하고 정밀한 측정치를 제공한다.
일 실시 형태에서, 본 출원의 검정 및 방법은 대상체로부터의 혈장 샘플로부터 p217+타우를 측정하고, 혈장 샘플로부터 측정된 p217+타우의 양이 사전결정된 역치 값 초과인 경우에 대상체가 타우병증 및/또는 아밀로이드성 질환을 갖거나 발생 위험이 있다고 후속적으로 결정한다. 사전결정된 역치 값은 건강하고 타우병증 및/또는 아밀로이드성 질환의 발생 위험이 없는 대상체에 비교하여 타우병증 및/또는 아밀로이드성 질환을 갖거나 발생 위험이 있는 대상체를 구별하기 위한 임의의 적합한 역치 값일 수 있다. 사전결정된 역치 값은, PET 영상화에 의해 측정되는 바와 같이 뇌 또는 뇌의 영역에서 타우의 소정 수준을 초과하는 환자와 그 미만인 환자를 구별하고; CSF에서 타우(예를 들어, p181 또는 p217+타우와 같은 인산화된 타우)의 소정 수준을 초과하는 환자와 그 미만인 환자를 구별하고; 예컨대 CSF 또는 혈장에서 β-아밀로이드(예를 들어, Aβ40 또는 Aβ42)의 소정 수준을 초과하는 환자를 구별하고; 예컨대 CSF 또는 혈장에서 Aβ40에 대한 Aβ42의 소정의 비를 초과하는 환자와 그 미만인 환자를 구별하고; 인지 정상인 환자와 치매를 갖는 환자를 구별하기 위한 혈장 p217+타우 농도로서 결정될 수 있다. 인간 혈장에서 본 출원의 검정 및 방법의 의외로 더 높은 감도로 인해, 사전결정된 역치 값은 검정의 LLOQ 초과이고, 이에 의해, 건강한 대상체로부터 분리하여 타우병증 및/또는 아밀로이드성을 갖거나 발생 위험이 있는 대상체를 식별하기 위한 민감하고 정량가능한 역치 수준을 제공한다. 특히, 사전결정된 역치 값은 검정의 LLOQ 및/또는 검출 하한(LLOD) 초과이며, 이는 신뢰성 있게 검출될 수 있는 분석물의 최저량이다. 예를 들어, 사전결정된 역치 값은 검정의 LLOQ의 3, 4, 5, 7, 또는 10배 이상 및/또는 검정의 LLOD의 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 또는 120배 이상일 수 있다.
타우병증 및/또는 아밀로이드성 질환을 갖거나 발생 위험이 있는 것으로 식별된 대상체는, 이러한 대상체의 뇌 병리를 추가로 평가하기 위해, 예를 들어, CSF 수집 및/또는 PET 영상화와 같은 추가의 임상 시험을 얻도록 유도될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 타우병증 및/또는 아밀로이드성 질환을 갖거나 발생 위험이 있는 것으로 식별된 대상체는 인지 감퇴 또는 타우병증 및/또는 아밀로이드성 질환, 예를 들어, AD를 치료하기 위한 활성 제제를 투여받을 수 있다. 타우병증을 치료하기 위한 활성 제제는 항-타우 항체, 항-p217+타우 항체, 인간 타우에 대한 작은 간섭 RNA(siRNA), p217+타우에 대한 siRNA, 콜린에스테라제 억제제, N-메틸 D-아스파르테이트(NMDA) 길항제 등을 포함할 수 있다. 아밀로이드성 질환에 대한 활성 제제는 항-아밀로이드 항체, 베타 세크레타제 억제제, 감마 세크레타제 억제제, 인간 β-아밀로이드에 대한 작은 간섭 RNA(siRNA), 콜린에스테라제 억제제, N-메틸 D-아스파르테이트(NMDA) 길항제 등을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 사전결정된 역치 값은 기준선 값 또는 기준선 값보다 유의하게 더 높은 값에 상응할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유의하게 더 높은"은 단지 우연으로 인한 것이 아니라 통계적으로 유의한 더 높은 값을 지칭하며, 이는 0.05 이하의 p-값을 갖는다. "유의하게 더 높은"은, 0.05, 0.04, 0.03, 0.01, 0.005, 0.001 등 미만의 p-값으로, 건강한 지원자에서 발견되는 것보다 약 1%, 2%, 5%, 또는 10% 이상 더 높을 수 있다. 기준선 값은 건강한 개체의 집단에서의 평균 수준에 상응할 수 있다. 기준선 값은 또한 동일한 대상체에서 결정된 이전 수준의 평균 값에 상응할 수 있다.
일 실시 형태에서, 포획 항체는 p217+타우 에피토프에 대해 지향된 단일클론 항체이고, 검출 항체는 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 지향된 단일클론 항체이다. 다른 실시 형태에서, 포획 항체는 p217+타우 에피토프에 대해 지향된 단일클론 항체이고, 검출 항체는 인간 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126, 바람직하게는 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 대해 지향된 단일클론 항체이다. 예시적인 일 실시 형태에서, 포획 항체는 각각 서열 번호 23, 24, 및 25의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3, 및 서열 번호 26, 27, 및 28의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 단일클론 항체이고, 검출 항체는 각각 서열 번호 10, 11, 및 12의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3, 및 서열 번호 13, 14, 및 15의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 단일클론 항체이다. 더욱 특히, 포획 항체는 pT3이고/이거나 검출 항체는 hT43이다.
본 출원의 일 실시 형태에 따라, 관심 샘플 내의 p217+타우 펩티드는 p217+타우 에피토프에 대해 지향된 포획 항체로 포획된다. 포획된 p217+타우 펩티드는, 모두 p217+타우 에피토프를 함유하지만, 상이한 길이를 가질 수 있으며, 이는 상이한 에피토프에 결합하는 검출 항체에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 지향된 검출 항체는 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 여전히 함유하는 포획된 p217+타우 펩티드 또는 이의 단편("긴 p217+타우 펩티드")만을 검출할 수 있는 반면에, 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프에 대해 지향된 검출 항체는 긴 p217+타우 펩티드뿐만 아니라 짧은 p217+타우 펩티드 또한 검출할 수 있다. 포획된 p217+타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20 또는 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 대해 지향된 검출 항체와 접촉시킴으로써 샘플에서 긴 p217+타우 펩티드 또는 p217+타우 펩티드(긴 p217+타우 펩티드 및 짧은 p217+타우 펩티드)를 검출하고 그의 양을 측정할 수 있다. 샘플 내의 짧은 p217+타우 펩티드의 양은 p217+타우 펩티드의 양으로부터 긴 p217+타우 펩티드의 양을 감산함으로써 계산된다.
혈장에서 본 출원의 검정 및 방법을 사용하여 p217+타우 펩티드를 검출함에 있어서 관찰된 의외로 개선된 감도를 고려하여, 개선된 감도는 상기 기재된 짧은 p217+타우 펩티드 및/또는 긴 p217+타우 펩티드의 검출에 동일하게 적용가능하다고 여겨진다. 따라서, 본 출원의 다른 실시 형태에서, 본 출원의 검정 및 방법은 혈청 및/또는 혈장 샘플로부터 짧은 p217+타우 및/또는 긴 p217+타우 펩티드를 측정하는 단계를 포함한다. 특히, 본 출원의 검정 및 방법은 증가된 감도로 인간 혈장으로부터 짧은 p217+타우 및/또는 긴 p217+타우를 측정할 수 있다. 추가의 실시 형태에서, 본 출원의 검정 및 방법은 대상체로부터의 혈장 샘플로부터 짧은 p217+타우 및/또는 긴 p217+타우를 측정하고, 혈장 샘플로부터 측정된 짧은 p217+타우 및/또는 긴 p217+타우 펩티드의 양이 사전결정된 역치(들) 초과인 경우에 대상체가 타우병증을 갖거나 발생 위험이 있다고 후속적으로 결정한다. 사전결정된 역치(들)는 검정의 LLOQ 초과이다.
본 출원의 다른 실시 형태에 따라, 샘플 내의 p217+타우 펩티드를 포획하고 그의 양을 측정하는 단계에 더하여, 타우 단백질의 아미노산 150 내지 250의 에피토프, 바람직하게는 타우 단백질의 아미노산 159 내지 163을 포함하는 에피토프에 대해 지향된 항체와 같은 인산화-독립적 포획 항체로 샘플 내의 총 타우 펩티드를 포획한다. 포획된 총 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20 또는 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 대해 지향된 검출 항체와 접촉시킴으로써 샘플 내의 총 긴 타우 펩티드 또는 총 타우 펩티드(긴 타우 펩티드 단편 및 짧은 타우 펩티드 단편)를 검출하고 그의 양을 측정할 수 있다. 샘플 내의 짧은 총 타우 펩티드의 양은 총 타우 펩티드의 양으로부터 긴 총 타우 펩티드의 양을 감산함으로써 계산된다.
본 출원의 실시 형태에 따라, 샘플 내의 p217+타우 펩티드에 관련된 값, 예컨대 p217+타우 펩티드의 양 및 긴 p217+타우 펩티드의 양, 임의로 샘플 내의 총 타우 펩티드의 양 및 총 긴 타우 단편의 양뿐만 아니라, 측정 양에 기반하는 정보, 예컨대 계산된 짧은 p217+타우 펩티드 및 짧은 총 타우 펩티드, 또는 p217+타우 펩티드에 관련된 비, 예컨대 긴 타우 펩티드 단편의 양에 대한 짧은 타우 펩티드 단편의 양의 비, 짧은 타우 단편의 총량에 대한 짧은 p217+타우 펩티드의 양의 비, 긴 타우 단편의 총량에 대한 긴 p217+타우 펩티드의 양의 비 등을 하나 이상의 진단 목적으로 사용할 수 있다. 일 실시 형태에서, p217+타우 펩티드에 관련된 비, 예를 들어, 긴 p217+타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+타우 펩티드의 양의 비가 상응하는 기준선 비보다 유의하게 더 높고, 측정된 p217+타우, 짧은 p217+타우, 및/또는 긴 p217+타우의 양이 검정의 LLOQ 초과인 경우에 대상체는 타우병증을 앓고 있는 것으로 결정된다.
일 실시 형태에서, 본 출원의 방법은 (i) 혈액-기반 샘플, 바람직하게는 혈장 샘플을, 인산화된 p217+타우를 포함하는 에피토프에 대해 지향된 포획 항체와 접촉시켜 샘플 내의 p217+타우 펩티드를 포획하는 단계, (ii) 포획된 p217+타우 펩티드를, 바람직하게는 포획된 p217+타우 펩티드를 세척한 후에, 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 지향된 검출 항체와 별도로 접촉시킴으로써, 긴 p217+타우 펩티드의 양을 측정하고/하거나, 바람직하게는 포획된 p217+타우 펩티드를 세척한 후에, 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프에 대해 지향된 검출 항체와 별도로 접촉시킴으로써, 샘플 내의 긴 p217+타우 펩티드 및 짧은 p217+타우 펩티드의 양을 측정하는 단계, 및 (iii) p217+타우 펩티드의 양 또는 긴 p217+타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+타우 펩티드의 양의 비에 기반하여 대상체가 타우병증을 앓고 있거나 타우병증의 발생 위험이 있는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 대상체로부터의 샘플 내의 p217+타우 펩티드의 양 또는 농도를 상응하는 사전결정된 역치 수준에 비교함으로써 진단이 수행될 수 있다. 진단은 또한 대상체로부터의 샘플 내의 긴 p217+타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+타우 펩티드의 양의 비를 상응하는 기준선 비에 비교함으로써 수행될 수 있으며, 여기서 짧은 p217+타우 펩티드 및 긴 p217+타우 펩티드의 양은 이들 각각의 검정의 LLOQ 초과이다.
다른 실시 형태에서, 본 출원의 방법은 (i) 혈액-기반 샘플, 바람직하게는 혈장 샘플을, p217+타우 에피토프에 대해 지향된 포획 항체와 접촉시켜 샘플 내의 p217+타우 펩티드를 포획하고/하거나, 타우 단백질의 아미노산 150 내지 250의 타우 에피토프에 대해 지향된 인산화-독립적 포획 항체와 접촉시켜 샘플 내의 총 타우 펩티드를 포획하는 단계, (ii) 포획된 p217+타우 펩티드, 또는 포획된 총 타우 펩티드를, 바람직하게는 포획된 p217+타우 펩티드 또는 포획된 총 타우 펩티드를 세척한 후에, 타우 단백질의 아미노산 잔기 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 대해 지향된 검출 항체와 별도로 접촉시킴으로써, 샘플 내의 긴 p217+타우 펩티드 및 짧은 p217+타우 펩티드의 양, 또는 총 짧은 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계, 및 (iii) 샘플 내의 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+타우 펩티드의 양의 비에 기반하여 대상체가 타우병증을 앓고 있거나 타우병증의 발생 위험이 있는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 대상체로부터의 샘플에서 pT3 항체에 의해 인식되는 것과 동일한 타우 단백질의 영역, 즉, 타우의 아미노산 211 내지 221을 포함하는 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+타우 펩티드의 양의 비를 상응하는 기준선 값에 비교함으로써 진단이 수행될 수 있으며, 여기서 짧은 p217+타우 펩티드의 양은 검정의 LLOQ 초과이다.
다른 실시 형태에서, 본 출원의 방법은 (i) 혈액-기반 샘플, 바람직하게는 혈장 샘플을, p217+타우 에피토프에 대해 지향된 포획 항체와 접촉시켜 샘플 내의 p217+타우 펩티드를 포획하는 단계, (ii) 포획된 p217+타우 펩티드를, 바람직하게는 포획된 p217+타우 펩티드를 세척한 후에, 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 지향된 검출 항체와 별도로 접촉시킴으로써, 긴 p217+타우 펩티드의 양을 측정하고/하거나, 바람직하게는 포획된 p217+타우 펩티드를 세척한 후에, 타우 단백질의 아미노산 잔기 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 대해 지향된 검출 항체와 별도로 접촉시킴으로써, 샘플 내의 긴 p217+타우 펩티드 및 짧은 p217+타우 펩티드의 양을 측정하는 단계, 및 (iii) p217+타우 펩티드의 양 또는 긴 p217+타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+타우 펩티드의 양의 비에 기반하여 대상체에서 치료의 유효성을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 측정된 p217+타우 펩티드, 짧은 p217+타우 펩티드, 및/또는 긴 p217+타우 펩티드의 양(들)은 각각의 검정의 LLOQ 초과이다.
또 다른 실시 형태에서, 본 출원의 방법은 (i) 혈액-기반 샘플, 바람직하게는 혈장 샘플을, p217+타우 에피토프에 대해 지향된 포획 항체와 접촉시켜 샘플 내의 p217+타우 펩티드를 포획하고/하거나, 타우 단백질의 아미노산 150 내지 250의 타우 에피토프에 대해 지향된 인산화-독립적 포획 항체와 접촉시켜 샘플 내의 총 타우 펩티드를 포획하는 단계, (ii) 포획된 p217+타우 펩티드, 또는 포획된 총 타우 펩티드를, 바람직하게는 포획된 p217+타우 펩티드 또는 포획된 총 타우 펩티드를 세척한 후에, 타우 단백질의 아미노산 잔기 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 대해 지향된 검출 항체와 별도로 접촉시킴으로써, 샘플 내의 긴 p217+타우 펩티드 및 짧은 p217+타우 펩티드의 양, 또는 총 짧은 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계, 및 (iii) 생물학적 샘플 내의 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+타우 펩티드의 양의 비의 양에 기반하여 대상체에서 치료의 유효성을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 측정된 짧은 p217+타우의 양은 검정의 LLOQ 초과이다.
또 다른 실시 형태에서는, 치료 전, 치료 중, 또는 치료 후에, p217+타우 펩티드의 양, 긴 p217+타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+타우 펩티드의 양의 비, 또는 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+타우 펩티드의 양의 비를 모니터링함으로써 대상체에서 치료의 유효성을 결정하며, 여기서 p217+타우 펩티드, 짧은 p217+타우 펩티드, 및/또는 긴 p217+타우 펩티드의 양은 이들 각각의 검정의 LLOQ 초과이다. 기저선과 대비하여 값의 감소는 치료에 대한 양성 반응을 의미한다. 순환에서 병리학적 타우의 반감기가 증가되고/되거나 병리학적 타우가 뇌로부터 제거됨에 따라, 생물학적 유체에서 값이 또한 일시적으로 증가할 수 있다.
특정 태양에 따라, 타우병증은 알츠하이머병(가족성 알츠하이머병 및 산발성 알츠하이머병을 포함함), 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반하는 전측두엽 치매(FTDP-17), 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 픽병, 진행성 피질하 신경교증, 농축체 단독 치매, 석회화를 동반하는 광범위 신경섬유 매듭, 은친화성 과립성 치매, 근위축성 측삭 경화증 파킨슨증-치매 복합군, 다운 증후군, 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커병, 할러포르텐-스파츠병, 봉입체 근염, 크로이츠펠트-야콥병, 다계통 위축증, C형 니만-픽병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아급성 경화성 범뇌염, 근긴장성 이영양증, 신경섬유 매듭을 동반하는 비-괌 운동 신경세포병, 뇌염후 파킨슨증, 만성 외상성 뇌병증, 및 권투선수 치매(복싱병)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
바람직하게는, 타우병증은 알츠하이머병(가족성 알츠하이머병 및 산발성 알츠하이머병을 포함함), FTDP-17, 또는 진행성 핵상 마비이다.
가장 바람직하게는, 타우병증은 알츠하이머병(가족성 알츠하이머병 및 산발성 알츠하이머병을 포함함)이다.
일 실시 형태에 따라, 본 출원의 방법은 (i) 혈액-기반 샘플, 바람직하게는 혈장 샘플을, p217+타우 에피토프에 대해 지향된 포획 항체와 접촉시켜 샘플 내의 p217+타우 펩티드를 포획하는 단계, (ii) 포획된 p217+타우 펩티드를, 바람직하게는 포획된 p217+타우 펩티드를 세척한 후에, 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 지향된 검출 항체와 별도로 접촉시킴으로써, 긴 p217+타우 펩티드의 양을 측정하고/하거나, 바람직하게는 포획된 p217+타우 펩티드를 세척한 후에, 타우 단백질의 아미노산 잔기 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 대해 지향된 검출 항체와 별도로 접촉시킴으로써, 샘플 내의 긴 p217+타우 펩티드 및 짧은 p217+타우 펩티드의 양을 측정하는 단계, 및 (iii) p217+타우 펩티드의 양 또는 긴 p217+타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+타우 펩티드의 양의 비에 기반하여 대상체가 항-p217+타우 항체 요법에 적합한지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 p217+타우 펩티드, 짧은 p217+타우, 및/또는 긴 p217+타우의 양은 각각의 검정의 LLOQ 초과이다.
특정 태양에 따라, 혈액-기반 샘플, 특히 혈장 샘플 내의 p217+타우 펩티드의 양, 또는 혈액-기반 샘플 또는 혈장 샘플 내의 긴 p217+타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+타우 펩티드의 양의 비가 상응하는 기준선 값보다 유의하게 더 높은 경우에 대상체는 항-p217+타우 항체 요법에 적합한 것으로 결정되며, 여기서 상응하는 기준선 값은 p217+타우 펩티드, 짧은 p217+타우 펩티드, 및/또는 긴 p217+타우 펩티드를 측정하는 검정의 LLOQ 초과이거나, p217+타우 펩티드, 짧은 p217+타우 펩티드, 및/또는 긴 p217+타우의 양은 이들 각각의 검정의 LLOQ 초과이다.
다른 특정 태양에 따라, 본 출원의 방법은 (i) 혈액-기반 샘플, 바람직하게는 혈장 샘플을, p217+타우 에피토프에 대해 지향된 포획 항체와 접촉시켜 샘플 내의 p217+타우 펩티드를 포획하거나, 타우 단백질의 아미노산 150 내지 250의 타우 에피토프에 대해 지향된 인산화-독립적 포획 항체와 접촉시켜 샘플 내의 총 타우 펩티드를 포획하는 단계, (ii) 포획된 p217+타우 펩티드, 또는 포획된 총 타우 펩티드를, 바람직하게는 포획된 p217+타우 펩티드 또는 포획된 총 타우 펩티드를 세척한 후에, 타우 단백질의 아미노산 잔기 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 대해 지향된 검출 항체와 별도로 접촉시킴으로써, 샘플 내의 긴 p217+타우 펩티드 및 짧은 p217+타우 펩티드의 양, 또는 총 짧은 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계, 및 (iii) 생물학적 샘플 내의 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+타우 펩티드의 양의 비에 기반하여 대상체가 항-p217+타우 항체 요법에 적합한지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 짧은 p217+타우 펩티드의 양은 검정의 LLOQ 초과이다.
일 실시 형태에 따라, 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+타우 펩티드의 양의 비가 상응하는 기준선 값보다 유의하게 더 높은 경우에 대상체는 항-p217+타우 항체 요법에 적합한 것으로 결정되며, 여기서 짧은 p217+타우 펩티드의 양은 검정의 LLOQ 초과이다.
일 실시 형태에서, 본 출원의 방법은 (i) 혈액-기반 샘플, 바람직하게는 혈장 샘플을, 인산화된 p217+타우를 포함하는 에피토프에 대해 지향된 포획 항체와 접촉시켜 샘플 내의 p217+타우 펩티드를 포획하는 단계, (ii) 포획된 p217+타우 펩티드를, 바람직하게는 포획된 p217+타우 펩티드를 세척한 후에, 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 지향된 검출 항체와 별도로 접촉시킴으로써, 긴 p217+타우 펩티드의 양을 측정하고/하거나, 바람직하게는 포획된 p217+타우 펩티드를 세척한 후에, 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프에 대해 지향된 검출 항체와 별도로 접촉시킴으로써, 샘플 내의 긴 p217+타우 펩티드 및 짧은 p217+타우 펩티드의 양을 측정하는 단계, 및 (iii) p217+타우 펩티드의 양에 기반하여 대상체가 아밀로이드성 질환을 앓고 있거나 아밀로이드성 질환의 발생 위험이 있는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 대상체로부터의 샘플 내의 p217+타우 펩티드의 양 또는 농도를 상응하는 사전결정된 역치 수준에 비교함으로써 진단이 수행될 수 있으며, 여기서 p217+타우 펩티드의 양 또는 농도는 단계 (i) 및 (ii)의 검정의 LLOQ 초과이다.
본 출원은 또한 혈액-기반 샘플, 특히 혈장에서 항체와 복합체를 이루는 p217+타우뿐만 아니라, 항체-결합되지 않은 샘플 내의 유리 p217+타우를 측정하는 단계에 관한 것이다. 일 실시 형태에서는, 친화도 기술을 사용하여 총 항체를 포획한 후, 무질서화제(chaotroph), 열-비활성화, 또는 다른 단백질 붕괴 기술을 포함하는 변성 조건이 이어진다. p217+타우는 rpHPLC를 사용하여 항체로부터 분리되며, 항체-결합된 p217+타우의 정량화를 허용하는 본 출원의 방법을 사용하여 측정된다.
일반적 태양에 따라, 본 발명은 대상체에서 항-p217+타우 항체를 이용한 치료를 모니터링하는 방법에 관한 것이며, 본 방법은 하기를 포함한다: 본 출원은 대상체에서 항-p217+타우 항체를 이용한 치료를 모니터링하는 방법으로서, (i) 대상체로부터 혈액-기반 샘플, 특히 혈장 샘플을 얻는 단계, (ii) 총 p217+타우를 함유하는 혈액-기반 샘플로부터 반-변성 샘플을 얻는 단계, (iii) 반-변성 샘플을 p217+타우 에피토프에 대해 지향된 포획 항체와 접촉시켜 반-변성 샘플 내의 p217+타우 펩티드를 포획하는 단계, 및 (iv) 포획된 p217+타우 펩티드를, 바람직하게는 포획된 p217+타우 펩티드를 세척한 후에, 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 지향된 검출 항체와 별도로 접촉시킴으로써, 긴 p217+타우 펩티드의 양을 측정하고/하거나, 바람직하게는 포획된 p217+타우 펩티드를 세척한 후에, 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프에 대해 지향된 검출 항체와 별도로 접촉시킴으로써, 반-변성 샘플 내의 긴 p217+타우 펩티드 및 짧은 p217+타우 펩티드의 양을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 p217+타우 펩티드, 짧은 p217+타우 펩티드, 및/또는 긴 p217+타우 펩티드의 양은 이들 각각의 검정의 LLOQ 초과로 측정되는, 방법에 관한 것이다.
혈액-기반 샘플 내에 존재하는 p217+타우 펩티드를 분해하지 않으면서, p217+타우 펩티드에 대한 포획 항체 및/또는 검출 항체의 결합을 방해하거나 p217+타우 펩티드에 결합된 검출 항체의 검출을 방해하는 항체 및/또는 다른 혈액 성분을 분해하는 단계에 의해, p217+타우 펩티드를 함유하는 혈액-기반 샘플로부터 반-변성 샘플이 제조된다. 일 실시 형태에서, 반-변성 샘플은 항체를 변성시키는 사전결정된 온도에서 사전결정된 양의 시간 동안 혈액-기반 샘플을 가열하는 단계에 의해 제조된다. 사전결정된 온도는 75℃ 내지 100℃, 80℃ 내지 90℃, 또는 85℃일 수 있다. 사전결정된 양의 시간은 0.1 내지 30 분, 1 내지 15 분, 2 내지 10 분, 3 내지 9 분, 또는 7 분일 수 있다. 열 변성 후에, p217+타우 펩티드가 적합하게 안정한 온도(예를 들어, 4℃ 이하)로 샘플을 임의로 냉각시켜, 반-변성 샘플 내의 단백질의 추가의 분해를 중지시킬 수 있다. 예시적인 일 실시 형태에서, 반-변성 샘플은 혈액-기반 샘플을 85℃로 7 분 동안 가열하고 이어서 4℃ 얼음조 내에서 10 분 동안 냉각시키는 단계에 의해 제조된다.
다른 일반적 태양에 따라, 본 출원은 대상체에서 항-p217+타우 항체를 이용한 치료를 모니터링하는 방법으로서, (i) 대상체로부터 혈액-기반 샘플, 특히 혈장 샘플을 얻는 단계, (ii) 반-변성 샘플을 가열하여 샘플 내의 항체를 변성시키는, 총 p217+타우를 함유하는 혈액-기반 샘플로부터 반-변성 샘플을 얻는 단계, (iii) 반-변성 샘플을 p217+타우 에피토프에 대해 지향된 포획 항체와 접촉시켜 반-변성 샘플 내의 p217+타우 펩티드를 포획하는 단계, (iv) 포획된 p217+타우 펩티드를, 바람직하게는 포획된 p217+타우 펩티드를 세척한 후에, 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 지향된 검출 항체와 별도로 접촉시킴으로써, 긴 p217+타우 펩티드의 양을 측정하거나, 바람직하게는 포획된 p217+타우 펩티드를 세척한 후에, 타우 단백질의 아미노산 잔기 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 대해 지향된 검출 항체와 별도로 접촉시킴으로써, 반-변성 샘플 내의 긴 p217+타우 펩티드 및 짧은 p217+타우 펩티드의 양을 측정하는 단계, (v) 총 p217+타우의 양으로부터 무-항체 p217+타우의 양을 감산함으로써 샘플 내의 항체-결합된 p217+타우의 양을 계산하는 단계, (vi) 무-항체 p217+타우에 대한 항체-결합된 p217+타우의 비를 계산하는 단계, 및 (vii) 계산된 비에 기반하여 대상체에서 항-p217+타우 항체를 이용한 치료를 모니터링하는 단계를 포함하며, 여기서 p217+타우 펩티드, 짧은 p217+타우 펩티드, 및/또는 긴 p217+타우 펩티드의 양은 이들 각각의 검정의 LLOQ 초과로 측정되는, 방법에 관한 것이다.
특정 태양에 따라, 대상체에서 치료의 유효성은 치료 전, 치료 중, 또는 치료 후에 항체-결합된 p217+타우 펩티드 및 무-항체 p217+타우 펩티드의 양을 모니터링하는 단계에 의해 결정된다. 기준선에 대비하여 무-항체 p217+타우의 값의 감소, 또는 기준선에 대비하여 항체-결합된 p217+타우의 값의 증가, 및 따라서 기준선에 대비하여 무-항체 p217+타우에 대한 항체-결합된 p217+타우의 비의 증가는, 치료에 대한 양성 반응을 시사한다. 순환에서 병리학적 타우의 반감기가 증가되고/되거나 병리학적 타우가 뇌로부터 제거됨에 따라, 혈장과 같은 혈액-기반 유체에서 무-항체 p217+타우의 값이 또한 일시적으로 증가할 수 있다.
본 출원의 추가의 태양에서는, 외인성 항-타우 항체, 더욱 구체적으로, 항-p217+타우 항체의 투여를 포함하지만 이로 제한되지 않는, 타우병증에 대한 임의의 치료, 또는 아밀로이드성 질환에 대한 임의의 치료를 받는 환자에서 p217+타우 수준을 모니터링하기 위해 검정 및 방법을 사용할 수 있다. 혈액-기반 샘플, 특히 혈장 샘플 내의 p217+타우의 수준의 검출은, 효과적이거나 안전한 약물 수준의 달성 또는 유지를 보장하기 위해 치료의 용량 수준 또는 투여 간격을 증가시키거나 감소시켜야 하는지를 결정하기 위한 결정 수단으로서의 용도; 최소 pK 수준의 달성의 증거를 제공함으로써 항-타우 약물 요법의 개시를 위한 보조로서의 용도; 및 환자가 임상 시험으로부터 배제되거나 포함되어야 한다는 지표로서의, 그리고 임상 시험 투약 요건에 대한 준수의 후속 모니터링을 위한 보조로서의 용도를 포함하는 다수의 상이한 목적을 위해 사용될 수 있다.
특정 태양에 따라, 본 출원의 방법의 포획 항체는 샘플과 접촉되기 전에 고체 지지체에 먼저 결합된다. 포획 항체는 고체상에, 예컨대 마이크로타이터 디쉬의 웰에, 또는 자성 비드에 사전-결합된 혈액-기반 샘플(특히 혈장 샘플) 내의 p217+타우를 측정하기 위한 진단 키트 내에 제공될 수 있다. 검출 항체는 임의의 검출가능한 표지(예를 들어, 형광 분자, 비오틴 등)를 함유하거나 이에 부착될 수 있으며, 이는 직접 검출가능하거나 2차 반응(예를 들어, 스트렙타비딘과의 반응)을 통해 검출가능하다. 대안적으로, 검출가능한 표지를 함유하는 2차 시약이 사용될 수 있으며, 여기서 2차 시약은 1차 항체에 대한 결합 특이성을 갖는다. 특정 실시 형태에서, 검출 항체는 비오틴화된다.
특정 태양에 따라, 본 출원의 방법에서 측정된 p217+타우 펩티드의 양은 ELISA 및 단일 분자 어레이 플랫폼을 포함하는 당업계에 알려진 임의의 적합한 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 특정 태양에 따라, 본 출원의 방법은 CSF에 비교하여 더 낮은 농도의 p217+타우 펩티드를 갖는 혈액-기반 샘플(구체적으로 혈장 샘플)에서 p217+타우 펩티드의 양을 측정하기 위해 Quanterix Simoa 또는 MSD S-plex와 같은 고감도 어레이 플랫폼을 사용한다.
본 출원의 추가의 태양에서, 본 출원의 검정 및 방법은, 검정 시약에 의해 야기되는 간섭이 감소되고, 따라서 더 정확하고 정밀한, 혈액-기반 샘플(예를 들어, 혈액, 혈청, 및/또는 혈장) 내의 p217+타우 펩티드를 측정하기 위한 비드-기반 검정을 제공한다. 혈액-기반 샘플 내의 p217+타우 펩티드를 측정하기 위해 사용되는 경우에 소정의 검정 시약은 검정에 의해 얻어진 측정치와의 간섭을 생성하는 방식으로 상호작용하는 것으로 확인되었다. 특히, 포획 항체가 혈액-기반 샘플과 접촉되기 전에 자기 비드에 결합되는 비드-기반 검정에서, 혈액-기반 샘플의 제조에 사용되는 샘플 희석제는 혈액-기반 샘플에서 검정의 정확도 및 정밀도를 방해하는 것으로 확인된다. 예를 들어, 하기 실시예 7에 나타낸 바와 같이, Simoa Homebrew Assay Starter Kit, 카탈로그 번호 101351(Quanterix로부터 구매가능함)로부터 얻어진 샘플 희석제는 감소된 비드 카운트를 나타내며, 이는 포획 항체에 대한 기질로 사용되는 자기 비드의 클럼핑에 의해 야기되는 것으로 여겨진다. 그러나, 본 출원의 검정 및 방법은 비드 클럼핑에 의해 야기되는 간섭을 감소시키는 샘플 희석제를 이용한다. 특히, 본 출원의 샘플 희석제는 비이온성 계면활성제를 포함한다. 더욱 구체적으로, 비이온성 계면활성제는 친수성 폴리에틸렌 옥사이드 사슬 및/또는 방향족 탄화수소 친유성 또는 소수성 기를 포함한다. 더욱 특히, 비이온성 계면활성제는 Triton X-100이다. 샘플 희석제는 또한 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스)을 포함할 수 있으며, 이는 검정에 대한 간섭을 추가로 감소시키는 것으로 확인된다. 하기 추가로 기재된 실시예 7은 Triton X-100을 함유하는 샘플 희석제가 관찰되는 간섭을 감소시켰고, 트리스 완충제-기반 샘플 희석제가 포스페이트 완충제-기반 샘플 희석제에 비교하여 간섭의 더 양호한 감소를 제공하였음을 입증한다. 본 출원의 샘플 희석제는, 혈액-기반 샘플 내의 p217+타우의 측정을 방해하지 않는 다른 적합한 성분, 예컨대 NaCl, 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), 이종친화성 차단제, 및/또는 소 혈청 알부민을 추가로 포함할 수 있다.
다른 일반적 태양에서, 본 출원은 혈액-기반 샘플(예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장)로부터 p217+타우를 검출하기 위한 키트로서, (a) p217+타우 에피토프에 대해 지향된 포획 항체, 임의로 타우 단백질의 아미노산 150 내지 250의 타우 에피토프에 대해 지향된 인산화-독립적 포획 항체, (b) 포획 항체를 접합시키기 위한 자성 비드, (c) 비이온성 계면활성제를 포함하는 샘플 희석제, 및 (d) 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20 또는 116 내지 127을 포함하는 타우 단백질 에피토프에 대해 지향된 하나 이상의 검출 항체를 포함하는, 키트에 관한 것이다. 본 키트는 샘플 내의 p217+타우 펩티드의 양, 긴 p217+타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+타우 펩티드의 양의 비, 및/또는 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+타우 펩티드의 양의 비를 측정하기 위해 사용된다.
본 출원의 다른 태양에서, 상기 기재된 검정 및 방법에 따라 혈액-기반 샘플(예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장)로부터 얻어진 p217+타우 측정치를 컴퓨팅 장치에서 추가로 분석하여 대상체에서 타우병증을 검출하고/하거나 예측한다. 특히, 혈액-기반 샘플로부터 얻어진 p217+타우 측정치를 혈액-기반 샘플로부터 또한 검출가능한 다른 바이오마커에 대해 얻어진 측정치에 상응하는 데이터와 조합하여 컴퓨팅 장치에 의해 분석하여 추가로 개선된 대상체에서의 타우병증의 검출 및/또는 예측을 제공한다. 혈액-기반 샘플로부터 적절하게 측정될 수 있는 바이오마커(들)를 사용하여 타우병증, 구체적으로 AD를 검출하고/하거나 예측하는 개선된 능력은 다양한 진단 목적을 위해, 예를 들어, 대상체에서의 AD 또는 다른 타우병증의 진단, 치료의 유효성의 모니터링, 항-타우 또는 항-p217+타우 치료에 적합한 대상체의 식별, AD 또는 다른 타우병증의 추가의 검출을 위한 PET 영상화 및/또는 CSF 검정에 대한 대상체의 사전-스크리닝, AD 또는 다른 타우병증에 관련된 임상 시험에서의 등록을 위한 대상체의 식별 등을 위해 사용될 수 있다.
예시적인 일 실시 형태에는, 대상체에서 타우병증을 검출하거나 예측하기 위한 방법이 제공된다. 본 방법은 검정을 사용하여 혈액-기반 샘플(예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장) 내의 p217+타우 펩티드의 양을 검출하는 단계를 포함한다. 검정은 본 출원에 기재된 예시적인 검정 중 임의의 것일 수 있다. 특히, 검정은 샘플 내의 p217+타우 펩티드에 결합하는 포획 항체와 샘플을 접촉시키고 별도의 단계에서, 포획된 p217+타우 종의 검출을 허용하는 리포터 요소로 표지된 항-타우 검출 항체와 포획된 p217+ 펩티드를 접촉시킴으로써 혈액-기반 샘플, 특히 혈장 내의 p217+타우 펩티드의 양을 측정한다. 더욱 특히, 본 검정은 혈장 샘플을 p217+타우 에피토프에 대해 지향된 포획 항체와 접촉시켜 포획 항체를 혈장 중의 p217+타우 펩티드에 결합시켜 항체-펩티드 복합체를 형성하는 단계, 및 별도로 항체-펩티드 복합체를 검출 항체와 접촉시켜 검출 항체를 항체-펩티드 복합체에 결합시키는 단계에 의해 혈장 샘플 내의 p217+타우 펩티드의 양을 검출한다.
컴퓨팅 장치는 검정에 의해 검출된 p217+타우 측정치를 얻어 p217+타우 펩티드의 양에 상응하는 타우 데이터를 생성한다. 타우 데이터는 검정에 의해 검출된 p217+타우 펩티드의 양을 나타낼 수 있다. 대안적으로, 타우 데이터는 양이 사전결정된 역치 값 초과인지 여부를 나타내는 이진 상태(예/아니오)를 나타낼 수 있다. 사전결정된 역치 값이 검정 방법의 LLOQ 초과이도록, 상기 논의된 바와 같이, 검정은 충분히 민감하다. 컴퓨팅 장치는 또한, 예를 들어, 인구통계학적 정보(예를 들어, 연령, 성별), 의료 이력, 전자 의료 기록(EMR), 환자의 투약 기록에 상응하는 약력 데이터 등과 같은, 대상체의 의료 데이터를 얻을 수 있다. 특히, 컴퓨터 장치는 환자로부터 검출된 하나 이상의 바이오마커에 대한 측정치 또는 이진 상태에 상응하는 바이오마커 데이터를 얻을 수 있다. 바이오마커는 타우병증에 대한 임의의 적합한 바이오마커일 수 있다. 바람직하게는, 바이오마커는 대상체의 혈액-기반 샘플, 특히 혈장 샘플로부터 검출가능하다. 예를 들어, 바이오마커는 아밀로이드-β(Aβ), 신경필라멘트 경쇄(NFL), 아디포넥틴, 렙틴, 및 다른 염증 마커 또는 대사 마커로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 더욱 구체적으로, 바이오마커는 NFL, 아디포넥틴, 및 렙틴으로부터 선택된다. 컴퓨팅 장치는 기계 학습 모듈을 사용하여 타우 데이터 및 바이오마커 데이터를 분석하여 대상체가 타우병증을 앓고 있거나 타우병증의 발생 위험이 있는지 여부를 결정하거나 예측한다. 기계 학습 모듈은 참조 데이터 세트를 사용하여 트레이닝된다. 기계 학습 모듈은 타우 데이터 및 바이오마커 데이터를 참조 데이터 세트에 비교하여 대상체가 타우병증을 갖거나 타우병증의 발생 위험이 있는지 여부를 결정하거나 예측한다. 참조 데이터 세트는, 환자의 참조군에 대해, 타우병증의 뇌 병리에 상응하는 데이터(예를 들어, 질환의 병기, CSF에서 검출된 p217+타우의 양, 뇌 조직 내의 타우의 PET 측정치 등)와 함께, 타우 데이터 및 바이오마커 데이터를 포함한다.
기계 학습 모듈은 지도 및/또는 비지도 기계 학습 모듈일 수 있다. 기계 학습 모듈은 데이터세트가 2개의 카테고리 중 하나에 상응하는 것으로 식별하기 위한 기계 학습 분류기일 수 있다. 기계 학습 모듈은 서포트 벡터 머신(support vector machine), 랜덤 포레스트(random forest), 로지스틱 회귀(logistic regression), 구배 부스팅(gradient boosting) 모듈, 또는 이들의 앙상블 모듈을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 기계 학습 모듈은 서포트 벡터 머신, 랜덤 포레스트, 로지스틱 회귀, 및/또는 구배 부스팅 모듈 중 하나 이상을 포함하는 앙상블 모듈이다.
당업자는 본 명세서에 기재된 예시적인 컴퓨터-구현 실시 형태가 별도의 소프트웨어 모듈로서, 하드웨어와 소프트웨어의 조합으로서 등을 포함하는 임의의 많은 방식으로 구현될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 예시적인 방법은, 비일시적 저장 매체에 저장되며 컴파일될 경우에 하나 이상의 프로세서 코어 또는 별도의 프로세서에 의해 실행될 수 있는 코드의 라인을 포함하는 하나 이상의 프로그램에서의 실시 형태일 수 있다. 일 실시예에 따른 시스템은 복수의 프로세서 코어, 및 복수의 프로세서 코어 상에서 실행되어 상기 논의된 예시적인 방법을 수행하는 한 세트의 명령어를 포함한다. 프로세서 코어 또는 별개의 프로세서는 임의의 적합한 전자 장치, 예를 들어 장치 내의 온보드 처리 배열 또는 장치 외부의 처리 배열, 예컨대 장치의 적어도 일부분과 통신할 수 있는 모바일 컴퓨팅 장치, 스마트폰, 컴퓨팅 태블릿, 컴퓨팅 장치 등에 통합될 수 있거나 그와 통신할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 성질을 추가로 예시하기 위한 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 제한하지 않으며, 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위에 의해 결정됨이 이해되어야 한다.
실시예 1: 혈장에서 p217+타우를 검출하기 위한 고감도 검정
본 출원의 개선된 검정의 예시적인 실시 형태가 실시예 I에 제공된다. 실시예 I의 예시적인 실시 형태는 비드-기반 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)을 이용하여 샘플 내의 p217+타우 펩티드의 존재를 검출하고/하거나 정량화한다. 구체적으로, 실시예 I은 Quanterix Corp.(미국 매사추세츠주 보스턴 소재)로부터 이용가능한 단일 분자 어레이(SiMoA) 비드-기반 디지털 ELISA 시스템을 이용한다. SiMoA 검정은 펨토리터 크기의 반응 챔버의 어레이를 사용하여 개별 면역복합체를 디지털 카운팅한다. 하기 추가로 논의되는 바와 같이, 검정-특이적 시약을 제조하고 SiMoA 분석기에 제공하여 샘플 내의 p217+타우 펩티드와 반응시키고 이를 검출하였다. 검정-특이적 시약은 2.7 μm 직경을 갖는 상자성 포획 비드, Simoa Homebrew Assay Starter Kit, 카탈로그 번호 101351(Quanterix로부터 구매가능함)로부터의 완충제 및 시약, 세척 완충제 1(Quanterix로부터 구매가능함), 자성 비드(Quanterix로부터 Simoa Homebrew Helper Bead Vial(918), 카탈로그 번호 101732로서 구매가능함), 포획 항체, 및 검출 항체를 포함한다. 실시예 1의 포획 항체는 pT3 마우스 단일클론 항체(mAb)이다. 실시예 1의 검출 항체는 hT43 mAb이다.
실시예 I에서 분석되는 각각의 샘플은 샘플 희석제에 희석된다. 실시예 I에 사용되는 예시적인 샘플 희석제는 50 mM 트리스 완충제, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2%(v/v) 소 혈청 알부민, 및 0.5%(v/v) Triton X-100, 이종친화성 차단제 HBR-9(미국 캘리포니아주 샌티 소재의 Scantibodies Laboratory로부터 카탈로그 번호 3KC564로서 구매가능함)를 포함한다. 샘플 희석제는 7.4의 pH를 갖는다.
New England Peptide에 의해 주문 제작된 보정물질 펩티드를 사용하여 실시예 I의 검정을 보정하였다. 보정물질 펩티드는 PEG4 링커에 의해 연결된 hT43 및 pT3 에피토프를 함유하며 4357 g/mol의 분자량을 갖는 펩티드이다. 보정물질 펩티드는 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는다.
시약 제조
제1 단계에서는, Quanterix 매뉴얼에 제공된 프로토콜에 따라, 실시예 I에서 pT3 mAb인 0.3 mg/mL의 포획 항체로 상자성 포획 비드를 코팅하여 포획 항체를 비드에 부착하였다. 코팅된 포획 비드를 Simoa Homebrew Assay Starter Kit로부터의 비드 희석 완충제에 100,000개의 비드/mL로 희석하고, 300,000개의 비드/mL의 헬퍼 비드를 첨가하여 400,000개의 비드/mL의 총 비드 농도를 얻었다.
실시예 I에서 hT43 mAb인 검출 항체를, Quanterix 매뉴얼에 제공된 프로토콜에 따라 60x로 비오틴화하고 상기 기재된 샘플 희석제에 희석하여 0.9 ㎍/mL의 농도의 검출 항체를 갖는 검출 용액을 제조하였다.
스트렙타비딘 β-D-갈락토시다제(SBG) 농축액을 Simoa Homebrew Assay Starter Kit로부터의 SBG 희석제에 200 pM로 희석하였다.
보정물질 펩티드를 0.1% 인산/물 중에 5 mg/mL로 재구성하고, 각각 20 μL의 단위로 분취하여 동결시켰다. 사용할 준비가 되면, 보정물질 펩티드 분취 단위를 해동하여 1:1000 희석하고(예를 들어, 1.5 ul를 1498.5 ul로), 펩티드의 최종 농도가 5000 pg/ml가 되도록 희석액을 샘플 희석제로 1:1000 추가 희석하였다. 변동되는 농도의 보정물질 펩티드로 실시예 I의 검정을 보정하여 하기 농도에 걸쳐 표준 곡선을 형성하였다: 30, 10, 3.33, 1.11, 0.37, 0.186, 0.093, 0.046, 0.023, 0.012, 0.006, 및 0 pg/mL.
실시예 I의 검정에 의해 분석된 혈장 샘플을 샘플 희석제에 1:2 희석하였다.
SiMoA 검정
3-단계 프로토콜을 포함하는 맞춤형 SiMoA 검정을 생성하였다. 이러한 3-단계 프로토콜은 하기 단계들을 포함한다: 분석을 위한 샘플을 상기 제조된 바와 같은 pT3mAb 부착된 포획 비드와, 분석을 위한 샘플과 35 분 동안 접촉시키는 단계, 이어서 포스페이트-완충 식염(PBS) Tween-20 용액, 특히 Simoa HD-1 기기(Quanterix로부터 구매가능함)를 위해 설계된 세척 완충제 1로 포획 비드를 세척하는 단계, 이어서 포획 비드를 검출 항체와 함께 5 분 동안 인큐베이션하는 단계, 이어서 포획 비드를 세척 완충제 1로 두 번째로 세척하는 단계, 포획 비드를 SBG와 함께 5 분 동안 인큐베이션하는 단계, 비드를 PBS-기반 용액, 특히 세척 완충제 1로 다시 세척하는 단계, 및 최종적으로 25 μL의 100 μM 레소루핀-β-D-갈락토피라노시드(RGP)를 첨가한 후에 SiMoA HD-1 기기에 의한 영상화 및 측정을 위해 측정 디스크 내로 로딩하는 단계. 각각의 반응은 Simoa 큐벳 내에서 수행되었으며, 상기 제조된 바와 같은 pT3 mAb 부착된 상자성 비드 및 헬퍼 비드를 포함하는 25 μL의 비드 용액, 172 μL의 희석된 샘플 또는 보정물질, 상기 제조된 바와 같은 검출 비오틴화 검출 항체를 포함하는 100 μL의 검출 용액, 100 μL의 SBG 용액, 및 25 μL의 100 μM RGP를 포함하였다.
SiMoA 분석기는 고해상도 형광 영상화를 이용하여, 형광을 내는 그의 펨토리터 크기의 반응 챔버의 어레이가 하나 이상의 효소와 관련된 비드의 분획에 상응하는 비드의 분획, 및 각각의 반응 챔버의 형광 강도를 검출한다. SiMoA 분석기는 이러한 측정치에 기반하여 비드당 효소의 평균 수(AEB)에 대한 결과를 생성한다.
실시예 2: 혈장 중에 존재하는 검정-경쟁 항체의 검출
부가적인 업스트림 샘플 조작을 이용하여, 심지어 실시예 1의 검정의 시약과 경쟁하는 검정-경쟁 항체, 예를 들어, 대상체 내에서 내인성으로 생성되는 검정-경쟁 항체 또는 대상체에 외인성으로 투여되는 검정-경쟁 항체의 존재 하에 p217+타우의 수준을 측정하기 위해 실시예 1의 고감도가 사용될 수 있다. 실시예 2에서 본 명세서에 기재된 방법을 약력학적 검정으로 사용하여 혈장 중에 존재하는 인간화 pT3 mAb와 같은 치료 항-p217+타우 항체를 연구할 수 있다. 예를 들어, 실시예 2의 방법을 사용하여, 인간 대상체로부터 인출된 혈장 샘플 내에 존재하는 타우의 말초 수준에 대한, 타우병증을 치료하기 위한 활성 제제, 구체적으로 항-p217+타우 단일클론 항체(예를 들어, 인간화 pT3 mAb)의 영향을 측정할 수 있다.
혈장 샘플의 분취액을 먼저 0.1 M NaOAc에 1:3 희석하고, 이어서 85℃에서 7 분 동안 가열한 후, 얼음조(4℃) 내에서 10 분 동안 냉각시켰다. 가열한 후에 냉각시킨 샘플 유체를 14000xg에서 10 분 동안 4℃에서 원심분리하고, 침전으로부터 상청액을 분리하였다. 상청액에 1 M 트리스 염기 용액을 7% 부피로 첨가하여 상청액의 중성 pH를 달성하고, 예시적인 반-변성 샘플을 얻었다. 동시에, 혈장 샘플의 제2 분취액을 반-변성 샘플 유체의 제조의 지속기간 동안 얼음조 내에서 냉각시켰다. 본 명세서의 실시예 2에서 이러한 제2 분취액은 또한 비-변성 샘플 유체로 지칭된다.
반-변성 유체 신호에 대해 SiMoA 분석기에 의해 생성된 결과는 혈장 샘플 내에 존재하는 p217+타우의 총량에 상응하는 반면에, 비-변성 유체에 대해 생성된 결과는 혈장 샘플 내의 유리 p217+타우에 상응한다. 보정물질 펩티드로부터의 표준 곡선에 결과를 상호연관시켜, 각각 혈장 샘플 내에 존재하는 p217+타우의 총량 및 유리 p217+타우의 농도를 얻었다. 전자로부터 후자를 감산하여 혈장 샘플 내에 존재하는 유리 p217+타우의 양의 정량적 측정치를 제공한다.
CSF 및 외인성으로 첨가된 항체를 사용하여, p217+타우 신호 자체는 임의의 영향을 받지 않게 하면서, 검정에서 임의의 간섭 항체가 p217+타우 항체의 결합을 더 이상 간섭하지 않도록, 샘플 내의 임의의 간섭 항체를 비가역적으로 변형시키기에 충분한 가열 시간 및 온도의 조합으로서, 실시예 2에 사용되는 정밀한 가열 시간 및 온도를 결정하였다. 특히, CSF 및 외인성으로 첨가된 항체를 사용하여 얻어진 데이터는, p217+타우 신호는 10 분 이상 동안 85℃ 가열을 견디지만, 항체는 단 2 분의 85℃ 가열 후에 변성됨을 나타냈다. 따라서, 실시예 2의 반-변성 유체 및 비-변성 유체를 사용하여 얻어진 결과는 포획 항체가 p217+타우에 결합되는지 여부의 직접적인 측정을 제공하는 것이 아니라, 오히려 p217+타우를 검출하고 그의 양을 정량화하는 p217+타우 검정의 능력을 방해하는 검정-경쟁 항체가 혈장 중에 존재한다는 것을 입증한다.
실시예 3: 혈장에 대해 사용하기에 적합하지 않은 종래의 p217+타우 검정
상기 논의된 바와 같이, 생물학적 샘플 내의 p217+타우 펩티드를 측정하기 위한 검정이 콜브 '492 특허에 이전에 개시되었다. 그러나, 콜브 '492 특허는 인간 혈청 또는 혈장 중에 존재하는 p217+타우 펩티드의 양을 정량화하는 단계에 대한 임의의 예를 제공하지 않는다. 대신에, 콜브 '492 특허는, 비정제 혈청 또는 혈장 샘플이 간섭으로 인한 난점을 가지며, 샘플을 면역침전시킨 후에 용리액을 열 변성시켰을 때까지는 충분한 감도로 측정하고 정량화할 수 없다는 것을 나타냈다.
실시예 3은 5명의 건강한 지원자(HV) 대조군 대상체 및 알츠하이머병(AD)을 갖는 것으로 알려진 5명의 대상체로부터 얻어진 인간 혈장 샘플 세트를 사용하여 콜브 '492 특허의 실시예 1에 기재된 검정을 평가한다. 본 실시예에서는 pT3 mAb를 포획 항체로 사용하고 pT82 mAb를 검출 항체로 사용한다. SiMoA 분석기에 의해 생성된 바와 같이, 실시예 3에 따라 얻어진 데이터를 도 1a 내지 도 1d에 AEB의 단위로 나타낸다. 각각의 그래프의 좌측은 AD 대상체에 상응하는 데이터를 나타내고 그래프의 우측은 HV에 상응하는 데이터를 나타낸다. 각각의 대상체 카테고리에 대해, 평균 값은 더 긴 수평선으로 나타내고, 데이터세트의 ± 표준 편차(SD)는 평균 값 선의 상하에 더 짧은 선으로 나타낸다.
이러한 혈장 샘플 각각을 콜브 '492 특허에 따라 2가지 상이한 희석 - 1:4 및 1:16으로 희석하였다. 둘 모두의 혈장 샘플 희석을 사용하여 얻어진 결과는 각각 도 1a 및 도 1b에 제공된다. 도 1a에 나타낸 데이터는, 1:4 희석에서, 혈장 샘플의 40%가 콜브 '492 특허의 실시예 1에 기재된 검정의 LLOQ 미만으로 측정된 반면에 20%는 LLOQ에서 측정되었고 다른 40%는 다른 모든 샘플보다 유의하게 더 높게 측정되었음을 입증한다. 특히, 1:4 희석에서 실시예 3의 6개/10개의 샘플이 LLOQ 이하로 측정되었고(AEB = 신호 = 0.035 = S/N>2 및 CV<20%), 다른 4개의 샘플은 현저하게 더 높은 신호를 나타냈다(11 내지 745x LLOQ 초과). 도 1b에 나타낸 바와 같이, 1:16 희석에서는, 1:4 희석에서 유의하게 더 높게 측정된 40%를 포함하는 모든 혈장 샘플이, 콜브 '492 특허의 실시예 1에 기재된 검정의 LLOQ 미만으로 측정되었다. 더욱 특히, 1:16 희석에서는 실시예 3의 모든 샘플이 LLOQ 미만으로 측정되었으며, 이는 상기 언급된 바와 같이 실시예 3의 4명/10명의 대상체에서의 1:4 희석에서의 높은 신호는 실질적으로 비-직선성이었으므로 혈장 매트릭스로부터의 아티팩트로 간주될 수 있음을 나타낸다. 도 1a 및 도 1b에 나타낸 데이터는, 콜브 '492 특허의 실시예 1에 기재된 검정을 사용하여 혈장 중의 p217+타우 펩티드를 검출하는 단계에는 감도의 결여 및 희석 직선성의 결여가 존재하므로, 그러한 검정은 혈장 중에 존재하는 p217+타우 펩티드의 양을 분석하기에 적합하지 않다는 것을 입증한다.
동일한 5명의 HV 및 5명의 AD 대상체로부터의 혈장 샘플 세트를 상기 실시예 2에 따라 변성시켜 10개의 상이한 반-변성 샘플 유체를 얻었다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 반-변성 샘플 유체를 얻는 과정은, p217+ 항체에 의해 검출되는 p217+타우 신호를 저하시키지 않으면서, 간섭 항체가 샘플 내의 p217+타우 펩티드에 대한 p217+ 항체의 결합을 더 이상 방해하지 않도록, 간섭 항체를 변형시킨다. 반-변성 샘플 유체 각각을 1:6 희석하고 콜브 '492 특허의 실시예 1에 기재된 검정을 사용하여 측정한다. 결과는 도 1c에 나타낸다. 도 1c에서 알 수 있는 바와 같이, 반-변성 샘플 유체를 얻는 과정은 임의의 변성 단계 없이 이전에 1:4 희석에서 LLOQ보다 유의하게 더 높게 측정된 샘플(도 1b에 나타냄)의 40%에서 모든 정량가능한 신호를 제거하였다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 반-변성 샘플 유체를 얻는 과정은 p217+ 항체에 의해 검출되는 p217+타우 신호를 저하시키지 않는다. 따라서, 도 1c에 나타낸 데이터는 도 1a에 나타낸 혈장으로부터 검출되는 신호가 p217+타우 펩티드 이외의 다른 성분으로부터의 간섭 및/또는 아티팩트로 오염될 수 있음을 제시한다. 특히, 도 1a에 나타낸 4명/10명의 혈장 샘플에서의 높은 p217+타우 신호는 변성 후에 제거되었으며, 이는 이러한 신호가 진성 타우 신호가 아님을 나타낸다. 도 1a 및 도 1c에 나타낸 1:16 비정제 혈장 데이터는 HV에 비해 AD에서 더 높은 신호를 나타냈으며, 이는 매트릭스 간섭을 제거하는 단계가 혈장에서 바이오마커 관련 p217+타우 신호를 드러낼 수 있다는 것을 입증한다. 그러나, 콜브 '492 특허의 실시예 1에 기재된 검정은 불량한 감도로 인해 혈장 샘플 내의 p217+타우를 측정하기에 적합하지 않다.
콜브 '492 특허는 비정제 혈청 또는 혈장이 감도 및 매트릭스 간섭 장애에 의해 문제를 겪을 수 있음을 인정하였으며 병리학적 타우의 혈액-기반 측정치를 제공하기 위해 콜브 '492 특허의 실시예 1에 기재된 검정과 조합하여 면역침전을 사용하는 농축 전략을 사용할 수 있음을 기재한다. 하기는 콜브 '492 특허의 실시예 1에 기재된 검정과 조합된 면역침전이 AD 대상체로부터의 HV의 개선된 감도 및 분리를 제공한다는 것을 입증한다.
동일한 5명의 HV 및 5명의 AD 대상체로부터의 혈장 샘플 세트를, pT3 항체를 사용하여 그의 p217+타우 신호를 위해 면역침전시킨 후에, 콜브 '492 특허의 실시예 1에 기재된 검정에 따라 측정하였다. 샘플 희석제를 이용하여 면역침전 샘플을 1:4의 비로 희석하였다. 1:4 희석을 갖는 이러한 면역침전 샘플로부터의 결과를 도 1d에 나타낸다. 도 1d에 나타낸 결과를, 동일한 희석비에서 측정되지만 pT3 항체를 이용한 제1 면역침전이 없는 도 1a에 비교하면, 면역침전 단계는 AD 대상체로부터의 혈장 샘플이 모두 직선 범위 내에서, 그리고 HV 샘플로부터 양호하게 분리되어 측정되도록 검정의 감도를 개선하였다. 도 1d는 HV 샘플로부터 얻어진 혈장 중에 존재하는 p217+타우 펩티드의 양이 콜브 '492 특허의 실시예 1에 기재된 검정의 LLOQ를 경미하게 초과하지만, 검정의 LLOQ를 초과하는 신뢰성 있게 정량가능한 결과를 제공하지 않는다는 것을 나타낸다(예를 들어, LLOQ가 HV 샘플에 대한 표준 편차 이내에 들어감). 이러한 결과는 혈장 p217+타우 신호의 정제 및 농축이 유용한 혈장 p217+타우 검정을 산출할 수 있다는 것을 나타냈다. 그러나, 면역침전은 번거롭고 비정밀한 과정이며, 이는 과도한 부담이 있고 검정에 추가의 부정확성을 도입할 수 있다. 본 출원의 검정 및 방법은 인간 혈장 샘플 내의 p217+타우 펩티드의 검출을 위한 충분한 감도를 갖는 결과를 얻기 위해 그의 p217+타우 신호를 농축하는 별도의 면역침전 단계를 필요로 하지 않는다.
실시예 4: p217+타우 펩티드를 검출하기 위한 본 출원의 고감도 검정에 대한 종래의 검정의 비교
본 출원의 검정 및 방법은 혈장 샘플을 포획 항체와 접촉시켜 포획 항체를 혈장 중의 p217+타우 펩티드에 결합시켜 항체-펩티드 복합체를 생성하고, 세척 후에 항체-펩티드 복합체를 검출 항체와 접촉시켜 검출 항체를 항체-펩티드 복합체에 결합시키기 위한 별도의 단계들을 포함하며, 이는 실시예 1에 예시된다. 혈장 샘플을 포획 항체와 접촉시키고, 이어서 항체-펩티드 복합체를 세척한 후에 검출 항체와 접촉시키는 제1 단계는 p217+타우 신호를 혈장 샘플 내의 간섭 성분으로부터 분리한다. 특히, 샘플 내의 p217+타우 펩티드는 포획 항체에 결합되는 반면에 샘플의 간섭 성분은 검출 항체가 항체-펩티드 복합체에 첨가되기 전에 세척된다. 이러한 별도의 단계들을 포함하는 검정 및 방법은 또한 본 명세서에서 "3-단계" 검정으로 지칭된다. 반면에, 콜브 '492 특허의 실시예 1에 기재된 검정은 그의 생물학적 샘플을 포획 항체 및 검출 항체 둘 모두와 동시에 조합하여 세척 단계 전에 생물학적 샘플에 대한 둘 모두의 항체의 결합을 허용한다. 콜브 '492 특허의 실시예 1에 기재된 바와 같은 검정은 또한 본 명세서에서 "2-단계" 검정으로 지칭된다. 본 실시예에서는, 신호의 최대 포획을 허용하기 위해, "2-단계" 검정에 비교하여 "3-단계" 검정의 제1 단계에서의 인큐베이션 시간 및 투입되는 샘플 부피를 또한 증가시켰다. 하기 실시예 4에서 추가로 입증되는 바와 같이, 본 출원의 "3-단계" 검정은 혈청으로부터 p217+타우 펩티드를 측정하는 경우에 "2-단계" 검정에 비해 개선된 감도를 제공한다는 것이 의외로 확인되었으며, 이는 CSF로부터 측정하는 경우에는 관찰되지 않는다.
실시예 4는 CSF 및 혈청 둘 모두로부터 p217+타우 펩티드를 측정하여 본 출원의 "3-단계" 검정을 "2-단계" 검정에 비교한다. 변동되는 인지 상태를 갖는 복수의 대상체에 대해 "2-단계" 및 "3-단계" 검정 둘 모두를 사용하여 CSF 샘플 세트를 측정하였다. 구체적으로, "2-단계" 및 "3-단계" 검정 둘 모두를 사용하여 임상 연구에서 21명의 경증 내지 중등도 치매 대상체로부터 96개의 CSF 샘플을 측정하였다. 각각의 샘플에 대해, 도 2a에는 "2-단계" 검정을 사용하여 얻어진 결과(검출된 p217+타우의 pg/mL 단위)(X-축에 나타냄)를 "3-단계" 검정을 사용하여 얻어진 결과(Y-축에 나타냄)에 대해 맵핑한다. 또한, 실시예 3과 동일한 5명의 HV 및 5명의 AD 대상체에 대해 "2-단계" 및 "3-단계" 검정 둘 모두를 사용하여 혈청 샘플 세트를 측정하였다. 얻어진 결과(검출된 p217+타우의 pg/mL 단위)는 도 2b에 막대 그래프로 나타내며, 여기서 각각의 샘플에 대한 좌측 막대는 "2-단계" 검정을 사용하여 얻어진 결과에 상응하고 우측 막대는 "3-단계" 검정을 사용하여 얻어진 결과에 상응한다.
도 2a에서 알 수 있는 바와 같이, "2-단계" 및 "3-단계" 검정은 CSF 샘플에서 p217+타우 펩티드를 측정하기 위해 사용되는 경우에 높은 상관관계(r2 = 0.94)를 입증했다. 그러나, 도 2b는 혈청 샘플에서 p217+타우 펩티드를 측정하기 위해 검정이 사용되는 경우에는 그러한 상관관계가 관찰되지 않는다는 것을 나타낸다. 추가로, 도 1a는 혈장으로부터 p217+타우 펩티드를 측정하기 위해 "2-단계" 검정이 사용되는 경우에 샘플의 나머지보다 훨씬 더 높은 측정치를 제공하는 샘플 서브세트를 나타냈지만, 도 2b는 혈청으로부터 p217+타우 펩티드를 측정하기 위해 "3-단계" 검정이 사용되는 경우에 이러한 높은 신호 이상값이 극적으로 감소된다는 것을 나타낸다. 도 2b의 데이터는 "2-단계" 검정을 사용하여 관찰된 높은 p217+타우 신호 이상값이 "3-단계" 검정을 사용하여 측정된 동일한 샘플에서는 유사하게 관찰되지 않았다는 것을 나타낸다. 따라서, 도 2b의 데이터는 "2-단계" 검정을 사용하여 관찰된 높은 p217+타우 신호 이상값은 검정의 간섭 및/또는 아티팩트에 상호연관되며, 샘플 내에 존재하는 p217+타우 펩티드를 정확하게 측정하지 않는다는 것을 입증한다. 이러한 데이터는 CSF에서는 무시할만한 매트릭스 간섭이 존재하지만, 혈액 제제(blood product)에서는 실질적인 양성 간섭이 존재한다는 것을 나타낸다.
실시예 5: p217+타우 펩티드를 검출하기 위한 본 출원의 고감도 검정을 사용하는 검출 항체의 비교
실시예 5는 실시예 1에 기재된 바와 같은 예시적인 검정과 함께 2가지 상이한 검출 항체를 사용하여 3가지 유형의 생물학적 유체, 즉, CSF, 혈청, 및 혈장 사이의 일치(concordance) 및 상대적 단편화(relative fragmentation)를 평가한다. 구체적으로, 실시예 5는 실시예 I의 검정에 사용하기 위한 검출 항체(실시예 5에 명시된 바와 같은 상이한 검출 항체는 제외함)로서 hT43과 pT82 사이의 차이를 비교한다. 둘 모두의 예시적인 실시 형태에 대해 포획 항체는 pT3이다. 따라서, 실시예 5에서 비교되는 2개의 예시적인 검정은 pT3xhT43 및 pT3xpT82이다.
실시예 1의 검정, 및 검출 항체가 hT43 mAb로 변형된 점을 제외하고는 실시예 1과 유사한 변형된 검정을 사용하여, 임상 연구에서 18명의 AD(특히, 경증 내지 중등도 치매를 갖는 사람들) 대상체로부터의 CSF, 혈청, 및 혈장을 측정하였다. 얻어진 결과(검출된 p217+타우의 pg/mL 단위)는 각각 CSF, 혈청, 및 혈장에 대해 도 3a, 도 3b, 및 도 3c에 나타낸다. 각각의 유형의 생물학적 유체에 대해, pT3xhT43 검정을 사용하여 얻어진 결과(검출된 p217+타우의 pg/mL 단위)(X-축에 나타냄)를 pT3xpT82 검정을 사용하여 얻어진 결과(Y-축에 나타냄)에 대해 각각 CSF, 혈청, 및 혈장에 대해 도 3a, 도 3b, 및 도 3c에 맵핑한다. 선형 회귀선과 함께 선형 회귀선에 대한 R2 값을 도 3a 내지 도 3c 각각에 나타낸다. 도 3a 내지 도 3c에 나타낸 바와 같이, 3가지 샘플 유형 모두에서, hT43 검출 항체 및 pT82 항체를 사용하여 얻어진 결과는 고도로 일치하였다(R2 = 0.82 내지 0.95). 도 3a 내지 도 3c에 나타낸 선형 회귀선의 기울기는 각각 2.83, 2.41, 및 2.05이다. 또한, pT3xpT82 검정은 CSF, 혈청, 및 혈장에 걸쳐 pT3xhT43 검정보다 약 2.5x 더 높은 수준의 결과를 얻었다. 상기 논의된 바와 같이, pT3은 인간 타우 단백질의 아미노산 210 내지 220에서의 에피토프를 인식한다. 검출 항체 hT43은 인간 타우 단백질의 아미노산 7 내지 20을 인식하고, 검출 항체 pT82는 타우 단백질의 아미노산 116 내지 127을 인식한다. 따라서, pT82는 hT43에 의해 인식되는 것보다 pT3에 더 가까운 에피토프를 인식하며, 이는 pT82가 hT43에 비교하여 긴 p217+ 펩티드 단편에 더하여 짧은 p217+ 펩티드 단편을 인식하는 것을 허용한다. 타우는 CSF에서 고도로 단편화되는 것으로 알려져 있으며, pT82는 hT43보다 더 짧고, 따라서 더 많은 p217+펩티드 단편을 검출하는 능력을 갖기 때문에, pT3xpT82 검정은 pT3xhT43 검정보다 더 높은 농도를 보고하는 것으로 여겨진다. 흥미롭게, 혈청 및 혈장에서 pT3xpT82 검정에 대해 유사한 더 높은 수준이 또한 관찰되며, 이는 혈액 성분(예를 들어, 혈청 및 혈장)에서 타우의 비정제 단편화 패턴(아미노산 20 내지 116)이 CSF에서와 유사할 수 있고, 혈액 제제 내의 hT43 및 pT82 에피토프 사이에 더 큰 단편화가 존재하지 않는다는 것을 나타낸다. pT3xhT43 및 pT3xpT82 검정은 CSF, 혈청, 및 혈장에 걸쳐 고도로 일치하는 것으로 나타나며, 이는 p217+타우 단편화 수준이 CSF에서의 단편화를 반영한다는 것을 제시하므로, 실시예 5에서 평가된 2개의 검정은 상호교환적인 것으로 여겨진다. 그러나, pT3xhT43 검정은 pT3xhT43 검정에 비해 더 큰 감도를 제공한다.
실시예 6: p217+타우 펩티드를 검출하기 위한 검정에 사용하기 위한 상이한 샘플 희석제의 비교
어느 희석제가 검정에 의해 얻어지는 p217+타우 신호에서 비드 클럼핑 및/또는 아티팩트를 감소시킬 것인지를 결정하기 위해, 실시예 6은 실시예 I의 검정에 사용하기 위한 상이한 샘플 희석제를 평가한다(실시예 6에 명시된 바와 같은 상이한 샘플 희석제는 제외함). 완충제 유형(PBS 대 트리스), NaCl 농도, 및 이종친화성 차단제(예를 들어, 인간 항-마우스 상호작용을 차단함)의 존재의 영향을 아티팩트 혈청 p217+타우 신호에 대한 영향 및 ELISA 방법의 종점에서 검출되는 비드의 수에 대한 영향의 관점에서 측정하였다. 실시예 6에서 평가된 상이한 샘플 희석제를 하기 표 1에 나타낸다.
[표 1]
표 1에는 명시되지 않지만, 각각의 샘플 희석제는 또한 5 mM EDTA 및 2%(v/v) 소 혈청 알부민을 포함한다.
실시예 6에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 상이한 샘플 희석제를 이용하는 실시예 1과 유사한 변형된 검정을 사용하여, 높은 타우 수준을 갖는 인간 대상체로부터 얻어진 3개의 풀링된 혈청 샘플 및 보정물질 펩티드의 1 pg/mL 용액(음성 대조군으로서)을 분석하였다. SiMoA 분석기를 사용하여 SiMoA 디스크 상에 로딩된 비드의 수 및 샘플과 희석제의 각각의 조합의 AEB를 결정하였다. 도 4a는 3개의 혈청 샘플 및 9개의 상이한 샘플 희석제 각각 중의 보정물질 펩티드에 대해 SiMoA 디스크 상에 로딩된 비드의 수를 나타낸다. 도 4b는 3개의 혈청 샘플 및 9개의 상이한 샘플 희석제 각각 중의 보정물질 펩티드에 대해 SiMoA 분석기에 의해 검출된 형광 신호를 단위 AEB로 나타낸다. 도 4a 및 도 4b는 상이한 샘플 희석제 중에 측정된 각각의 샘플에 대한 막대 그래프로서 나타낸 데이터를 제공하며, 이는 표 1에 열거된 바와 동일한 순서로 나타낸다.
도 4a에서 알 수 있는 바와 같이, Simoa Homebrew Assay Starter Kit로부터의 샘플 희석제인 샘플 희석제 1은 3개의 혈청 샘플 모두에서 보정물질 펩티드 용액에 비교하여 유의하게 더 낮은 비드 카운트를 제공한다(1688-2921 대 5378). 샘플 희석제 2 내지 9는 혈청 중의 비드 카운트를 개선하였고, Simoa Homebrew 희석제(샘플 희석제 1)를 사용하여 측정된 샘플 중 2개에서 관찰된 아티팩트 신호를 실질적으로 감소시켰다. 검정을 사용하여 혈청 샘플을 분석하는 경우, 혈청에서 관찰된 이러한 감소된 비드 카운트는 검정에서 포획 항체에 대한 기질로서 사용된 상자성 비드의 클럼핑에 의해 야기되는 것으로 여겨진다. 상자성 비드의 클럼핑은 혈청 내의 p217+타우를 검출하기 위한 검정의 정확도 및 정밀도에 부정적인 영향을 미치므로, 상자성 비드의 클럼핑은 바람직하지 않다. 도 4a에 나타낸 데이터는, 모두 세제 Triton X-100을 포함하는 샘플 희석제 2 내지 9가 증가된 비드 카운트 및 따라서, 감소된 비드 클럼핑을 제공한다는 것을 입증하며, 이는 그렇지 않으면 검정의 정확도 및 정밀도를 부정적으로 방해할 것이다. 추가로, 도 4a는 트리스 완충제-기반 샘플 희석제가 포스페이트-기반 완충제보다 더 높은 비드 카운트를 제공하였음을 나타내며, 이는 비드 클럼핑에 의해 야기되는 검정 정확도 및 정밀도에 대한 간섭을 감소시킴에 있어서 트리스 기반 완충제가 유용함을 입증한다. 도 4b에서 알 수 있는 바와 같이, 모든 샘플 희석제가 보정물질 펩티드 용액에 대해 유사한 수준의 형광 신호를 제공하였다. 그러나, 샘플 희석제 1은 다른 샘플 희석제에 의해서는 관찰되지 않은(그러나 샘플 희석제 2, 3, 및 5는 또한 일부 형광 신호의 검출을 유발했음) 유의한 형광 신호의 검출을 또한 유발했다. 샘플 희석제 1에 의해 관찰된 이러한 증가된 형광 신호는, 도 2b에서 "2-단계" 검정에 대해 입증된 것과 유사하게, 검정의 간섭 및/또는 아티팩트에 상호연관되는 것으로 여겨지며, 혈청 샘플 내에 존재하는 p217+타우 펩티드를 정확하게 측정하지 않는다. 도 4b는 또한 검정 시약의 항-마우스 IgG 가교화를 감소시키도록 설계된 이종친화성 차단제인 HBR-9의 첨가가, 검정에서 간섭 및/또는 아티팩트를 추가로 감소시킨다는 것을 나타낸다. 구체적으로, 도 4b에서 알 수 있는 바와 같이, 샘플 희석제 6 내지 9는 샘플 희석제 2 내지 5보다 더 작은 형광 신호를 나타냈으며, 혈청 샘플 중 하나는 HBR-9의 첨가가 검정에 대한 간섭 및/또는 아티팩트의 추가의 감소를 제공한다는 것을 나타낸다. 도 4a 및 4b에서의 데이터는, 실시예 4에서 평가된 샘플 희석제 중에서 실시예 1에 기재된 샘플 희석제와 동일한 샘플 희석제 9가 최소 비드 클럼핑 및 아티팩트 신호 둘 모두를 제공했다는 것을 나타낸다. 상기 논의된 데이터를 고려하여, 트리스 완충제, 더 낮은 NaCl 농도, 및 이종친화성 차단제를 사용하는 경우에 특정 개선이 관찰되었다.
실시예 7: 혈청 및 혈장 중의 p217+타우 펩티드의 검출의 비교
실시예 7은 실시예 1에 기재된 예시적인 검정을 사용하여 혈청 및 혈장 중의 p217+타우 펩티드의 검출을 평가한다. 10명의 HV(본 명세서에서는 또한 건강한 지원자 또는 건강한 대조군으로 지칭됨) 및 실시예 5와 동일한 16명의 AD 대상체로부터의 혈청 샘플 세트를 실시예 1의 예시적인 검정을 사용하여 측정하였으며, 결과는 도 5a에 나타낸다. HV 대상체로부터의 샘플은 혈액 수집 서비스(blood collection service)로부터 얻어졌으며, 인지 정상인 것으로 추정되었다. 도 5a의 대상체군으로부터의 12명의 HV 및 18명의 AD 대상체 서브세트로부터의 혈장 샘플 세트를 실시예 1의 예시적인 검정을 사용하여 측정하였으며, 결과는 도 5b에 나타낸다. 도 5a 및 도 5b에서, 각각의 그래프의 좌측은 HV 대상체에 상응하는 데이터를 나타내고 그래프의 우측은 AD 대상체에 상응하는 대상체 그래프를 나타낸다. 각각의 대상체 카테고리에 대해, 평균 값은 더 긴 수평선으로 나타내고, 데이터세트의 ± 표준 편차(SD)는 평균 값 선의 상하에 더 짧은 선으로 나타낸다. 각각 혈청 및 혈장 각각에 대한 검정의 LLOQ를 나타내기 위해, 도 5a 및 도 5b 각각에 걸쳐 점선을 또한 나타낸다. 실시예 7에 따라 얻어진 데이터는 도 5a 및 도 5b에 pg/mL 단위로 나타낸다. 또한, 도 5a 및 도 5b에 혈장 및 혈청 샘플 둘 모두가 보고된 각각의 대상체(즉, 10명의 HV 및 16명의 AD 대상체)에 대해, 대상체로부터 얻어진 혈장을 사용하여 얻어진 결과(검출된 p217+타우의 pg/mL 단위)를 도 5c 및 도 5d에서 동일한 대상체로부터의 혈청을 사용하여 얻어진 결과에 대해 맵핑한다. 도 5a 및 도 5b에서 알 수 있는 바와 같이, AD 대상체로부터 얻어진 혈청 및 혈장 샘플 둘 모두는 HV 대상체로부터 얻어진 혈청 및 혈장 샘플보다 유의하게 더 높게 측정되었다. 이러한 데이터는 혈청 및 혈장 둘 모두가 진단 목적으로 유용할 수 있다는 것을 제시한다. 의외로, 모든 대상체에 대해 결정된 혈청으로부터 측정된 p217+타우에 대한 혈장으로부터 측정된 p217+타우의 비를 평균함으로써 결정된 바와 같이, 혈장으로부터 얻어진 측정치는 혈청으로부터 얻어진 측정치보다 약 2 내지 3x(구체적으로 2.3x) 더 높은 농도를 보고하였다. 그러나, 도 5d에 나타낸 바와 같이, 데이터의 선형 회귀는 1.9의 기울기를 나타내며, 이는 혈장으로부터 얻어진 측정치가 혈청으로부터 얻어진 측정치보다 1.9x 더 높다는 것을 나타낸다. 혈청에서는 p217+타우 분석물의 검출가능한 수준이 낮으므로, HV 대상체로부터 얻어진 혈청 샘플 중 다수는 검정의 LLOQ 미만으로 측정되었다. 그러나, 혈장에서는 p217+타우의 검출이 더 높으므로, HV 및 AD 환자로부터 얻어진 모든 혈장 샘플은 검정의 LLOQ 이상으로 측정되었다. 따라서, 실시예 1에 기재된 예시적인 검정은 HV 및 AD 대상체 둘 모두에 대해 혈장 중의 p217+타우 펩티드의 양을 검출하고 정량화하기에 유용하다. 또한, 도 5b에서 알 수 있는 바와 같이, HV 대상체로부터 검출되는 p217+타우 펩티드의 범위는 AD 대상체로부터 검출되는 p217+타우 펩티드의 범위와 실질적으로 중첩되지 않는다. HV 환자로부터 얻어지는 모든 혈청 샘플은 검정의 LLOQ 미만으로 측정되었지만(도 5a에 나타냄), 동일한 HV 환자로부터의 혈장 샘플의 대부분(12개 중 11개)은 직선 범위에서 검정의LLOQ 초과로 측정되었다(도 5b에 나타냄). 도 5c에 나타낸 바와 같이, 혈장 및 혈청 p217+타우 농도는 양호하게 상호연관되어 측정되지만(r2 = 0.82), 혈장 측정치는 혈청에서의 것들보다 평균 약 1.9x 더 높았다. 따라서, 본 출원의 검정은 AD 대상체로부터 HV 대상체를 분리하기 위해 사용될 수 있는 정량적 데이터를 의외로 제공한다. 구체적으로, 혈장에서 검출된 p217+타우 펩티드의 양이 사전결정된 역치 값(예를 들어, 도 5b에 나타낸 데이터에 기반하여 약 0.1 pg/mL) 초과인 경우에, 대상체는 타우병증, 특히 알츠하이머병을 갖거나 발생 위험이 있는 것으로 결정될 수 있다.
실시예 8: 혈장에서 p217+타우를 검출하기 위한 검정의 직선 범위
보정물질 재료를 이용한 직선 범위
실시예 1에 기재된 보정물질 펩티드를 생성하였다. 보정물질 펩티드는 PEG4 링커에 의해 분리된 pT3 및 hT43의 코어 에피토프를 함유하였으며, SiMoA 분석기로부터의 AEB의 결과를 보정물질 펩티드의 농도에 상호연관시키는 표준 곡선을 생성하기 위해 사용되었다. 실시예 1에 명시된 바와 같이 상이한 보정물질 펩티드 희석의 5회의 별도 실행에 의해 생성된 대표적인 표준 곡선을 도 6a에 나타낸다. 4-파라미터 곡선 적합 데이터 축소법(curve fit data reduction method)(4PL, 1/y2 가중)을 사용하여 보정 곡선을 생성하였다. 실시예 1의 예시적인 검정의 검출 하한(LLOD)은, 10% CV를 포함하는, 0 보정자의 평균 + 2.5 표준 편차(SD)와 동일한 AEB를 산출하는 계산된 보정물질 수준으로서 결정되었다. 이러한 기준으로, 대표적인 데이터는 약 0.002 pg/mL의 LLOD를 산출하였다. LLOQ와 정량 상한(ULOQ) 사이의 검정의 직선 범위는, 20% 미만의 CV 및 예상치의 80 내지 120% 회수율을 달성하는 최저 내지 최고 표준 곡선 지점으로서 정의되었다. 이러한 기준으로, 실시예 1의 예시적인 검정에 대한 직선 범위는 0.012 내지 30 pg/mL였다. 5회의 별도 실행의 보정 곡선이 양호하게 정렬되었고(5 내지 30,000 fg/mL의 넓은 동적 범위로 일관적인 신호를 입증함) 전체 범위에 걸쳐 증가하는 신호를 나타내지만, 상부 지점에서 간헐적으로 포화되었으며, 이는 실시예 1의 예시적인 검정에 대한 동적 범위로서 0.005 내지 10 pg/mL를 제시한다. 도 6a에 나타낸 5회의 별도 실행에 걸친 각각의 희석에 대한 평균, SD, CV, 및 신호 대 배경 비(S/B)는 하기 표 2에 제공된다.
[표 2]
혈장을 이용한 희석 직선성
혈청 및 혈장 샘플을 시험하기 위한 희석 직선성을 평가하고 최소 필요 희석(MRD)을 결정하기 위해, 높은 타우 수준을 갖는 AD 대상체로부터의 3개의 풀링된 혈청 샘플의 세트 및 높은 수준을 갖는 AD 대상체로부터의 1개의 풀 혈장 샘플을 샘플 희석제 중에 1:2 내지 1:6 희석(즉, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 및 1:6 희석)으로 적정하고 실시예 1의 검정에 따라 측정하였다. 이어서 각각의 희석으로부터 검출된 p217+타우의 양을 재조정하여 희석되지 않은 혈청 또는 혈장 샘플 내에 존재하는 p217+타우의 추정 농도를 제공하고 혈청 또는 혈장 샘플의 1:3 희석으로부터 결정된 p217+타우의 추정 농도에 비교한다. 얻어진 데이터는 도 6b에 샘플 각각의 1:3 희석에서의 p217+타우의 추정 농도의 %로서 나타낸다. 3개의 혈청 샘플 각각에 대해 얻어진 결과는 도 6b에 원(●) 기호, 정사각형(■) 기호, 및 삼각형(▲) 기호로 나타낸다. 혈장 샘플에 대해 얻어진 결과는 도 6b에 역삼각형(▼) 기호로 나타낸다. 도 6b에서 알 수 있는 바와 같이, 샘플 희석 각각은 나타낸 모든 혈청 및 혈장 샘플에 대한 다른 희석의 20% 이내였다. 이러한 데이터는 1:2 내지 1:6 희석의 범위에 걸쳐 허용가능한 희석 직선성을 입증한다. 혈청 및 혈장 샘플은 낮은 양의 p217+타우를 함유하므로, 1:2의 희석이 바람직할 수 있다.
실시예 9a: 혈장에서 p217+타우를 검출하기 위한 검정의 기술적 적격성
정밀도
혈장으로부터의 p217+타우 측정치의 반복간 정밀도(inter-replicate precision)를 평가하기 위해, 232개의 혈장 샘플의 코호트(HV 및 AD 대상체 둘 모두를 포함함)를 실시예 1의 예시적인 검정에 따라 사중실험으로 측정하였다. 보정물질 펩티드 표준 곡선에 기반하여, 검정의 LLOQ는 10 fg/mL인 것으로 결정되었다. 샘플의 1:2 희석을 감안한 후에 LLOQ는 20 fg/mL로 조정되었다. 그러나, 각각의 샘플로부터 검출된 p217+타우의 평균 양(fg/mL 단위)을 각각의 샘플에 대한 사중실험 측정치의 각각의 세트에 걸친 % CV에 대해 맵핑하는 단계에 기반하여, 데이터는 약 40 fg/ml 미만에서 시작하여 비정밀도가 증가했음을 나타냈다(도 7a). 도 7a의 데이터는 샘플의 93%(216개/232개)가 검정의 LLOQ(CV가 20% 미만인 농도 = 본 실시예에서 40 fg/ml, 점선으로 나타냄) 초과로 측정되었음을 나타낸다. 또한, 4개를 제외한 모든 샘플이 연구 전용(RUO: Research Use Only) 검정에 대한 20% CV의 허용가능한 한계 내로 측정되었다. 모든 232개의 혈장 샘플에 걸친 평균 시험내 정밀도는 7.1% CV였고 LLOQ 초과인 샘플에 걸친 평균 시험내 정밀도는 6.7% CV였다.
실시예 1의 검정의 시험간 정밀도를 평가하기 위해, 높은 타우 수준을 갖는 AD 대상체로부터의 혈장의 풀링된 샘플 및 높은 타우 수준을 갖는 AD 대상체로부터의 혈청의 풀링된 샘플과 함께, 샘플 희석제 중에 낮은 농도, 중간 농도, 및 높은 농도의 보정물질 펩티드를 함유하는 3개의 품질 관리(QC) 샘플의 패널을 제조하였다. 이어서 이러한 샘플을 실시예 1의 예시적인 검정에 따라 5회의 별도 실행에 대해 측정하였다. 이러한 샘플로부터 검출된 p217+타우의 희석 보정된 양은 도 7b에 나타낸다. 각각의 샘플에 대해, 평균 값은 더 긴 수평선으로 나타내고, 데이터세트의 ± 표준 편차(SD)는 평균 값 선의 상하에 더 짧은 선으로 나타낸다. 이러한 5개의 샘플에 대해 시험간 정밀도는 5 내지 15% CV인 것으로 결정되었다.
실험실들 사이의 이전가능성
시험 현장들 사이의 p217+타우 검정의 정밀도를 평가하기 위해, 2개의 별도의 위치에서 동일한 로트의 시약을 사용하여, HV 및 AD 대상체로부터 얻어진 혈장 샘플 세트를 시험할 수 있다. 샘플의 측정치가 2개의 시험 현장들 사이에 매우 유사하다면, 예시적인 검정이 실험실들 사이에 이전가능함이 확인된다.
분석물 안정성
AD 대상체로부터 얻어진 혈장의 풀을 분취하고, 각각의 분취액에 4℃, 22℃, 또는 37℃에서 1, 2, 또는 4 시간 동안의 저장을 적용함으로써, 다양한 온도에서 혈장 중의 내인성 p217+타우 에피토프의 안정성을 평가할 수 있다. 또한, 분취액 서브세트를 1, 2, 3, 또는 4 회 동결-해동(-80℃ 내지 22℃)할 수 있다. 이러한 상이한 저장 조건에 걸쳐 신호의 유의한 변화가 관찰되지 않는다면, 그것은 실시예 1의 예시적인 검정에 의해 인식되는 타우 종(및 특히 에피토프)이 표준 저장/시험 절차를 허용하기에 충분히 안정하다는 것을 나타낼 것이다.
실시예 9b: 혈장에서 p217+타우를 검출하기 위한 검정의 기술적 적격성
정밀도
부가적으로, 실시예 9a로부터의 227개의 혈장 샘플(157명의 경증 내지 중등도, 70명의 인지 정상 대상체)에 대한 검정 결과를 또한 분석하여 혈장으로부터의 p217+타우 측정치의 반복간 정밀도를 평가하고 도 7c에 나타냈다. 도 7c에 나타낸 모든 샘플이 검출되었으며(LLOD 초과의 신호를 제시함) 허용가능한 정밀도를 가졌다(25% 미만의 CV, 평균 CV= 7.1%). 실제로, 223개/227개의 샘플(98.2%)이 20% 미만의 CV를 제시했다. 정량 하한(LLOQ)을 더 양호하게 확립하기 위해, 그 미만에서는 혈장 측정치가 20% 초과의 CV를 제시할 가능성이 더 높은 지점에 기반하여 37 fg/ml의 컷오프가 설정되었다. 도 7c에 나타낸 바와 같이, 모든 샘플의 94.7%가 이러한 LLOQ 초과로 측정되었다.
실시예 10: CSF p217+타우 및 타우 PET에 비교한, 혈장 중의 p217+타우를 검출하기 위한 검정의 임상적 적격성
AD의 진단 및 병기 결정에서 실시예 1의 예시적인 검정의 유용성을 평가하기 위해, 검정을 사용하는 p217+타우 측정을 위한 혈장 샘플의 3개의 코호트가 얻어졌다. 이러한 측정치를 CSF p217+타우 수준 및/또는 TauPET SUVR과의 상관관계에 대해 분석하였으며, 이는 코호트 3의 논의에서 하기 추가로 설명된다.
코호트 1: AD 코호트에서 CSF p217+타우에 대한 혈장 p217+타우의 상관관계
코호트 1은, 혈장에서 검출된 p217+타우 펩티드의, 동일한 AD 대상체로부터의 일치하는 CSF에서 검출된 p217+타우에 대한 상관관계를 평가한다. 콜브 '492 특허의 실시예 1에 기재된 pT3xhT43 검정을 사용하여, 임상 연구에서 16명의 AD 대상체(이들은 임상 치매 척도 1+를 갖는 경증 내지 중등도 치매로 임상적으로 진단됨) 각각으로부터의 요추액(LF: Lumbar Fluid) CSF 샘플을 측정하였다. 동일한 16명의 AD 대상체로부터의 혈장 샘플을 상기 기재된 실시예 1의 예시적인 검정에 따라 측정하였다. 도 8a 및 도 8b에는, 각각의 대상체에 대해, 상응하는 CSF 샘플에서 검출된 p217+타우의 양(pg/mL 단위)(X-축에 나타냄)을 상응하는 혈장 샘플에서 검출된 p217+타우의 양(Y-축에 나타냄)에 대해 맵핑하였으며, 이는 도 8a의 데이터를 로그 척도로 나타낸다. 선형 회귀선(R2 = 0.43, 기울기 = 0.007, p=0.006)을 선형 회귀선에 대한 R2 값과 함께 도 8a에 나타낸다. 혈장 p217+타우 농도는 CSF p217+타우 농도의 1.95 +/- 0.23%(평균+/- SEM)였다.
코호트 2: 검증 코호트에서 CSF p217+타우에 대한 혈장 p217+타우의 상관관계
코호트 2는, 다른 임상 연구(n=70)로부터의 무증상 대상체의 코호트에 더하여 임상 연구(n=159)에서 경증 내지 중등도 치매(임상 치매 척도 1+)로 진단된 대상체의 더 큰 코호트에서, 혈장에서 검출된 p217+타우 펩티드의, CSF에서 검출된 p217+타우에 대한 상관관계를 평가한다. 229명의 대상체를 포함하는 코호트 2로부터의 LF CSF 샘플을, 콜브 '492 특허의 실시예 1에 기재된 pT3xhT43 검정을 사용하여 측정하였다. 동일한 229명의 대상체로부터의 혈장 샘플을 실시예 1의 예시적인 검정에 따라 측정하였다. 도 9a에는, 각각의 대상체에 대해, 상응하는 CSF 샘플에서 검출된 p217+타우의 양(pg/mL 단위)(X-축에 나타냄)을 상응하는 혈장 샘플에서 검출된 p217+타우의 양(fg/ml 단위)(Y-축에 나타냄)에 대해 맵핑한다. 선형 회귀(나타내지 않음)는 R2 = 0.35, 기울기 = 6, 및 p<0.0001을 갖는다.
도 9a는 또한, 제1 역치 값(6.6 pg/mL)을 나타내는 수직 점선을 포함하며, 이를 초과하면 CSF 샘플은 타우병증을 갖거나 발생 위험이 있는 대상체를 나타낼 것이고(예를 들어, 증가된 CSF p217+타우 수준 및/또는 증가된 TauPET SUVR에 의해 입증되는 바와 같으며, 이는 코호트 3의 논의에서 하기 추가로 설명됨), 제2 역치 값(104 fg/mL)을 나타내는 상응하는 수평 점선을 포함하며, 이를 초과하면 혈장 샘플은 타우병증을 갖거나 발생 위험이 있는 대상체를 나타낼 것이다. "진성+"로 표지된 상단 우측 사분면은 CSF 및 혈장 샘플 둘 모두가 제1 및 제2 역치 값 초과로 측정된 대상체에 상응하며, 이는 타우병증을 갖거나 발생 위험이 있는 것으로 대상체를 식별함에 있어서 CSF 및 혈장 측정치 둘 모두가 동조함을 나타낸다. "진성-"로 표지된 하단 좌측 사분면은 CSF 및 혈장 샘플 둘 모두가 제1 및 제2 역치 값 미만으로 측정된 대상체에 상응하며, 이는 타우병증의 발생 위험이 없는 것으로 대상체를 식별함에 있어서 CSF 및 혈장 측정치 둘 모두가 동조함을 나타낸다. "가성+"로 표지된 상단 좌측 사분면은 CSF 샘플은 제1 역치 값 초과로 측정되었지만, 혈장 샘플은 제2 역치 값 미만으로 측정된 대상체에 상응하며, 이는 혈장 측정치는 타우병증을 갖거나 발생 위험이 있는 것으로 그 대상체를 식별하는 반면에 CSF 측정치는 그렇지 않음을 나타낸다. "가성-"로 표지된 하단 우측 사분면은 CSF 샘플은 제1 역치 값 미만으로 측정되었지만, 혈장 샘플은 제2 역치 값 초과로 측정된 대상체에 상응하며, 이는 CSF 측정치는 타우병증을 갖거나 발생 위험이 있는 것으로 그 대상체를 식별하는 반면에 혈장 측정치는 그렇지 않음을 나타낸다. 도 9a의 각각의 사분면에서 식별된 대상체의 수는 하기 표 3에 제공된다.
[표 3]
도 9a 및 표 3으로부터의 데이터를 사용하여 수용자-반응 특성(ROC) 곡선을 생성하였으며, 대상체가 타우병증을 갖거나 발생 위험이 있음을 나타내는, 제2 역치 값을 초과하는 CSF 측정치를 갖거나, 대상체가 건강하거나 타우병증의 발생 위험이 없음을 나타내는, 제2 역치 값 미만의 CSF 측정치를 갖는 환자를 구별하는 혈장 측정치의 능력에 대해 도 9b에 나타낸다. 실시예 1의 혈장 검정은 AUC = 0.943(95% CI: 90.9, 97.8)로 양호한 특이성 및 감도를 나타냈다.
본 명세서에 기재된 "2-단계" 검정은 "생검+" 뇌 생검 샘플을 갖는 대상체로부터의 CSF 샘플을 "생검-" 뇌 생검 샘플을 갖는 대상체로부터의 CSF 샘플로부터 분리할 수 있었다는 것이 콜브 '492 특허에 보고되었으며, 이는 CSF 중의 p217+타우의 측정치가 타우병증, 구체적으로 AD에 대한 환자의 임상 병리를 나타낼 수 있음을 나타낸다. 본 명세서에서 도 9a 및 도 9b 및 표 3에 제공된 데이터를 고려하여, 본 출원의 검정 및 방법에 따른 혈장 측정치는 또한 타우병증에 대한 환자의 임상 병리를 나타내며, CSF 중의 p217+타우의 증가에 상응하고, 환자에서 타우병증을 검출하기 위한 예측 바이오마커로서 유용하다.
코호트 3: 타우의 PET 측정치에 대한 CSF p217+타우의 상관관계
코호트 3은 CSF에서 검출된 p217+타우 펩티드의, PET 영상으로부터 측정된 뇌 조직 내의 18F-T807(18F-AV-1451) 트레이서 체류에 대한 상관관계를 평가한다. 18F-T807 트레이서 체류의 PET 측정치(타우 PET 측정치)는 뇌 조직 내의 타우 축적에 상응하며, 이는 타우병증을 갖거나 발생 위험이 있는 대상체를 타우병증의 발생 위험이 없는 건강한 대상체로부터 구별하기 위한 선행 지표이다.
코호트 3은 인지 감퇴의 상태가 변동되는 178명의 대상체를 포함한다(인지 손상이 없는 대조군, 경증 인지 손상, AD 치매, 및 몇몇 다른 신경퇴행성 장애). 코호트 3 내의 대상체 각각의 뇌의 브라크 병기 I 내지 IV 관심 영역(ROI)으로부터 타우 PET 측정치가 얻어졌다. 이러한 대상체로부터 동시에 또는 병행하여 수집된 LF CSF 샘플을 콜브 '492 특허의 실시예 1에 기재된 pT3xhT43 검정을 사용하여 측정하였다. 도 10a에는, 각각의 대상체에 대해, CSF 샘플에서 검출된 p217+타우의 양(pg/mL 단위)(X-축에 나타냄)을 상응하는 대상체에서의 F18-표지된 T807 트레이서에 대한 표준화 흡수 값 비(SUVR)에 대해 맵핑한다. 도 10a의 Y-축 상에 나타낸 바와 같이, 코호트 3의 대상체는 소정 범위의 F18-표지된 T807 트레이서의 SUVR을 갖는 타우 PET 측정치를 나타냈다. 선형 회귀(나타내지 않음)는 R2 = 0.722, 및 p<0.0001을 갖는다.
코호트 3의 대상체는 또한, PET에 의해 측정되는 바와 같이 뇌 조직 내의 아밀로이드-β(Aβ) 침착의 증가에 상호연관되는 것으로 확인된 대상체와 그렇지 않은 대상체의 2개의 상이한 서브세트로 분할될 수 있다. 실시예 10에서 증가된 양의 Aβ를 갖는 사람들은 Aβ+로 지칭되는 반면에, 그렇지 않은 사람들은 하기 Aβ-로 지칭된다. 도 10a는 Aβ+인 대상체를 더 어두운 음영으로 나타내는 반면에, 도면의 하단 좌측 사분면에 주로 존재하는 Aβ- 대상체는 더 밝은 음영으로 나타낸다. Aβ+ 서브세트의 경우에 F18-표지된 T807 트레이서의 SUVR에 대한 CSF 중의 p217+타우 측정치의 선형 회귀(나타내지 않음)는 R2 = 0.740, 및 p<0.0001을 갖는다. Aβ+ 서브세트의 경우에 F18-표지된 T807 트레이서의 SUVR에 대한 CSF 중의 p217+타우 측정치의 선형 회귀(나타내지 않음)는 R2 = 0.091, 및= p=0.532를 갖는다. 도 10a로부터의 데이터를 사용하여, 대상체가 타우병증을 갖거나 발생 위험이 있음을 나타내는 역치 값 초과(예를 들어, 1.25), 또는 대상체가 건강하거나 타우병증의 발생 위험이 없음을 나타내는 역치 값 미만의 F18-표지된 T807 트레이서의 SUVR을 갖는 환자를 구별하는 CSF 측정치의 능력에 대한 ROC 곡선을 생성하였다. 콜브 '492 특허의 실시예 1에 기재된 pT3xhT43 검정을 사용하여 얻어진 CSF 측정치는 AUC = 0.905(95% CI: 86, 94.9)로 이러한 높은 T807 SUVR을 예측하기 위한 양호한 특이성 및 감도를 나타냈으며, 또한 6.6 pg/mL를 원하는 역치 값으로서 식별하였고, 이를 초과하면 CSF p217+타우 측정치는 타우병증을 갖거나 발생 위험이 있는 대상체를 나타낼 것이다. 따라서 이러한 원하는 역치 값을 코호트 2로부터 얻어진 데이터의 분석에 사용하여, 상기 논의된 바와 같이, TauPET에 대한 혈장으로부터의 p217+타우 측정치 사이의 상관관계를 분석하였다. 따라서, 도 10a 및 도 10b에 제공된 데이터는, 코호트 2로부터 얻어진 데이터와 조합하여 고려할 경우에, 본 출원의 검정 및 방법에 따른 혈장 측정치가 타우병증에 대한 환자의 임상 병리를 나타내며, 뇌 조직 내의 타우 축적의 증가에 상응하고, 환자에서 타우병증을 검출하기 위한 예측 바이오마커로서 유용하다는 것을 추가로 입증한다.
실시예 11: CSF p217+타우 및 CSF p181타우에 비교한, 혈장 중의 p217+타우를 검출하기 위한 검정의 임상적 적격성
AD의 진단 및 병기 결정에서 실시예 1의 예시적인 검정의 유용성을 평가하기 위해, 검정을 사용하는 p217+타우 측정을 위한 혈장 샘플이 얻어졌다. 이러한 측정치를 CSF p217+타우 수준 및/또는 CSF p181타우 수준과의 상관관계에 대해 분석하였다. CSF p181타우 수준은 타우 단백질의 잔기 181에서 인산화된 인간 타우 단백질 또는 타우 단편의 CSF로부터 검출된 양에 상응한다.
검증 코호트에서 CSF p217+타우에 대한 혈장 p217+타우의 상관관계
실시예 9b에서 사용된 동일한 코호트를 사용하여 CSF에서 검출된 p217+타우에 대한, 혈장에서 검출된 p217+타우 펩티드의 상관관계를 평가한다. 227명의 대상체를 포함하는 이러한 코호트로부터의 LF CSF 샘플을, 콜브 '492 특허의 실시예 1에 기재된 pT3xhT43 검정을 사용하여 측정하였다. 동일한 227명의 대상체로부터의 혈장 샘플을 상기 기재된 실시예 1의 예시적인 검정에 따라 측정하였다. 도 11a에는, 각각의 대상체에 대해, 상응하는 CSF 샘플에서 검출된 p217+타우의 양(pg/mL 단위)(X-축에 나타냄)을 상응하는 혈장 샘플에서 검출된 p217+타우의 양(fg/ml 단위)(Y-축에 나타냄)에 대해 맵핑한다. 선형 회귀(나타내지 않음)는 R2 = 0.35를 갖는다. 혈장 p217+타우 농도는 CSF p217+타우 농도의 1.87 +/- 0.11%(평균+/- SEM)였다.
도 11b 및 도 11c는 환자의 아밀로이드 상태(예를 들어, A+ 또는 A-)에 의해 분리된 도 11a의 데이터를 나타낸다. A+는 0.089 이하의 CSF Aβ42/40 비를 갖는, 아밀로이드 양성으로 간주되는 환자를 나타낸다. A-는 0.089 초과의 CSF Aβ42/40 비를 갖는, 아밀로이드 음성으로 간주되는 환자를 나타낸다. 도 11a로부터의 17명의 대상체는 도 11b 또는 도 11c에 포함되지 않으며, 이는 이러한 환자에 대해 CSF 아밀로이드 데이터가 이용가능하지 않았기 때문임에 유의한다. 도 11b는 A+인 환자 서브세트(n = 160)에 대한 데이터를 나타내고, 도 11c는 A-인 환자 서브세트(n = 50)에 대한 데이터를 나타낸다. 도 11b에 대한 선형 회귀(나타내지 않음)는 R2 = 0.27을 갖는다. 도 11c에 대한 선형 회귀(나타내지 않음)는 R2 = 0.01을 갖는다. A+ 환자에서의 혈장 p217+타우 농도는 CSF p217+타우 농도의 1.63 +/- 0.08%(평균+/- SEM)였다. A- 환자에서의 혈장 p217+타우 농도는 CSF p217+타우 농도의 2.73 +/- 0.39%(평균+/- SEM)였다. 상기 보고된 데이터에 나타낸 바와 같이, 혈장 대 CSF p217+타우 비는 아밀로이드 양성 코호트에서 경미하지만 유의하게 더 낮았다(독립표본 t-검정을 사용하여 p<0.0001).
CSF p181타우에 대한 CSF p217+타우의 상관관계
CSF에서 검출된 p181의 수준에 대한, CSF에서 검출된 p217+타우 펩티드의 상관관계를 평가하였다. 콜브 '492 특허의 실시예 1에 기재된 pT3xhT43 검정을 사용하여, 그리고 Innotest p181타우 검정에 의해, 경증 내지 중등도 치매 대상체(n=286; 89% A+)로부터의 CSF 샘플을 측정하여, 각각 CSF 샘플로부터 검출된 p217+타우 및 p181의 농도를 결정하였다. 도 12a에는, 각각의 대상체에 대해, CSF 샘플에서 검출된 p181타우의 양(pg/mL 단위)(X-축에 나타냄)을 상응하는 대상체에서 CSF 샘플에서 검출된 p217+타우의 양(pg/mL 단위)(Y-축에 나타냄)에 대해 맵핑한다. 증가된 수준의 CSF p181 타우를 갖는 환자는 T+로 식별될 수 있으며, 이는 환자가 타우병증을 갖거나 발생 위험이 있음을 나타낸다. 소정의 역치 미만의 CSF p181의 수준을 갖는 환자는 T-로 식별될 수 있으며, 이는 환자가 건강하거나 타우병증의 발병 위험이 없음을 나타낸다. 본 실시예의 경우, 52 pg/ml 이상의 CSF p181타우 농도는 T+로 식별되는 반면에, 52 pg/ml 미만의 CSF p181타우 농도는 T-로 지칭된다. 도 12a에 나타낸 데이터의 선형 회귀를 사용하여 이러한 역치 CSF p181타우 농도를 CSF 중의 p217+타우의 농도에 상호연관시킨다. 이러한 데이터에 기반하여, 52 pg/ml의 CSF p181타우 역치 값은 CSF 중의 11.4 pg/ml의 p217+타우에 상호연관된다. 따라서, 11.4 pg/ml 이상의 CSF p217+타우 농도를 사용하여 T+인 환자를 식별할 수 있는 반면에, 11.4 pg/ml 미만의 CSF p217+타우 농도를 사용하여 T-인 환자를 식별할 수 있다.
도 11a로부터의 데이터를 사용하여 T- 환자로부터 T+ 환자를 구별하는 CSF p217+타우 측정치의 능력에 대한 ROC 곡선(도 12b)을 생성하였다. 콜브 '492 특허의 실시예 1에 기재된 pT3xhT43 검정을 사용하여 얻어진 CSF 측정치는 AUC = 0.9469로 환자가 T+일 것인지, 또는 T-일 것인지를 예측하기 위한 높은 정확도를 나타냈다. ROC 곡선의 유덴 인덱스(Youden index) 분석은 T- 환자로부터 T+ 환자를 구별하기 위한 혈장 p217+타우의 역치 값을 124.6 fg/ml로 결정하였다.
도 11a로부터의 데이터는 제1 역치 값(11.4 pg/ml인 것으로 상기 결정된 바와 같음)을 나타내는 수직 점선(이를 초과하면 CSF 샘플은 T+ 환자의 것을 나타낼 것임) 및 제2 역치 값(124.6 fg/ml인 것으로 상기 결정된 바와 같음)을 나타내는 상응하는 수평 점선(이를 초과하면 혈장 샘플은 T- 환자의 것을 나타낼 것임)으로 도 12c에 또한 나타낸다. "진성+"로 표지된 상단 우측 사분면은 CSF 및 혈장 샘플 둘 모두가 제1 및 제2 역치 값 둘 모두 초과로 측정된 대상체에 상응하며, 이는 타우병증을 갖거나 발생 위험이 있는 것으로 대상체를 식별함에 있어서 CSF 및 혈장 측정치 둘 모두가 동조함을 나타낸다. "진성-"로 표지된 하단 좌측 사분면은 CSF 및 혈장 샘플 둘 모두가 제1 및 제2 역치 값 미만으로 측정된 대상체에 상응하며, 이는 타우병증의 발생 위험이 없는 것으로 대상체를 식별함에 있어서 CSF 및 혈장 측정치 둘 모두가 동조함을 나타낸다. "가성+"로 표지된 상단 좌측 사분면은 CSF 샘플은 제1 역치 값 초과로 측정되었지만, 혈장 샘플은 제2 역치 값 미만으로 측정된 대상체에 상응하며, 이는 혈장 측정치는 타우병증을 갖거나 발생 위험이 있는 것으로 그 대상체를 식별하는 반면에 CSF 측정치는 그렇지 않음을 나타낸다. "가성-"로 표지된 하단 우측 사분면은 CSF 샘플은 제1 역치 값 미만으로 측정되었지만, 혈장 샘플은 제2 역치 값 초과로 측정된 대상체에 상응하며, 이는 CSF 측정치는 타우병증을 갖거나 발생 위험이 있는 것으로 그 대상체를 식별하는 반면에 혈장 측정치는 그렇지 않음을 나타낸다. 도 12c는 각각 10 및 2%에서 낮은 가성 +/- 비율을 나타낸다. 도 12c의 각각의 사분면에서 식별된 대상체의 수는 하기 표 4에 제공된다.
[표 4]
도 12e 및 도 12g는 인지 정상 대 경증 내지 중등도 치매 환자에 의해 분리된 도 12c의 데이터를 나타낸다. 도 12e는 인지 정상 환자 서브세트에 대한 데이터를 나타내고 도 12g는 경증 내지 중등도 치매 환자 서브세트에 대한 데이터를 나타낸다.
도 12e로부터의 데이터를 사용하여 인지 정상 환자 서브세트(n =70)에서 T- 환자로부터 T+ 환자를 구별하는 CSF p217+타우 측정치의 능력에 대한 ROC 곡선(도 12d)을 생성하였다. 인지 정상 서브세트에 대한 CSF 측정치는 AUC = 0.9045로 유사한 수준의 정확도를 나타냈다. ROC 곡선의 유덴 인덱스 분석을 사용하여 T- 환자로부터 T+ 환자를 구별하기 위한 혈장 p217+타우의 역치 값을 결정하였다.
도 12e는 또한 제1 역치 값(11.4 pg/ml인 것으로 상기 결정된 바와 같음)을 나타내는 수직 점선을 포함하며, 이를 초과하면 CSF 샘플은 T+ 환자의 것을 나타낼 것이고, 제2 역치 값(도 12d의 ROC 곡선에 의해 결정된 바와 같음)을 나타내는 상응하는 수평 점선을 포함하고, 이를 초과하면 혈장 샘플은 T- 환자의 것을 나타낼 것이다. "진성+"로 표지된 상단 우측 사분면은 CSF 및 혈장 샘플 둘 모두가 제1 및 제2 역치 값 둘 모두 초과로 측정된 대상체에 상응한다. "진성-"로 표지된 하단 좌측 사분면은 CSF 및 혈장 샘플 둘 모두가 제1 및 제2 역치 값 미만으로 측정된 대상체에 상응한다. "가성+"로 표지된 상단 좌측 사분면은 CSF 샘플은 제1 역치 값 초과로 측정되지만, 혈장 샘플은 제2 역치 값 미만으로 측정된 대상체에 상응한다. "가성-"로 표지된 하단 우측 사분면은 CSF 샘플은 제1 역치 값 미만으로 측정되지만, 혈장 샘플은 제2 역치 값 초과로 측정된 대상체에 상응한다. 도 12e는 각각 23 및 0%에서 낮은 가성 +/- 비율을 나타낸다. 도 12e의 각각의 사분면에서 식별된 대상체의 수는 하기 표 5에 제공된다.
[표 5]
도 12g로부터의 데이터를 사용하여 경증 내지 중등도 치매 환자 서브세트(n =157)에서 T- 환자로부터 T+ 환자를 구별하는 CSF p217+타우 측정치의 능력에 대한 ROC 곡선(도 12f)을 생성하였다. 경증 내지 중등도 치매 서브세트에 대한 CSF 측정치는 AUC = 0.9254로 유사한 수준의 정확도를 나타냈다. ROC 곡선의 유덴 인덱스 분석을 사용하여 T- 환자로부터 T+ 환자를 구별하기 위한 혈장 p217+타우의 역치 값을 결정하였다.
도 12g는 또한 제1 역치 값(11.4 pg/ml인 것으로 상기 결정된 바와 같음)을 나타내는 수직 점선을 나타내며, 이를 초과하면 CSF 샘플은 T+ 환자의 것을 나타낼 것이고, 제2 역치 값(도 12f의 ROC 곡선에 의해 결정된 바와 같음)을 나타내는 상응하는 수평 점선을 나타내고, 이를 초과하면 혈장 샘플은 T- 환자의 것을 나타낼 것이다. "진성+"로 표지된 상단 우측 사분면은 CSF 및 혈장 샘플 둘 모두가 제1 및 제2 역치 값 둘 모두 초과로 측정된 대상체에 상응한다. "진성-"로 표지된 하단 좌측 사분면은 CSF 및 혈장 샘플 둘 모두가 제1 및 제2 역치 값 미만으로 측정된 대상체에 상응한다. "가성+"로 표지된 상단 좌측 사분면은 CSF 샘플은 제1 역치 값 초과로 측정되지만, 혈장 샘플은 제2 역치 값 미만으로 측정된 대상체에 상응한다. "가성-"로 표지된 하단 우측 사분면은 CSF 샘플은 제1 역치 값 미만으로 측정되지만, 혈장 샘플은 제2 역치 값 초과로 측정된 대상체에 상응한다. 도 12g는 각각 9 및 4%에서 낮은 가성 +/- 비율을 나타낸다. 도 12g의 각각의 사분면에서 식별된 대상체의 수는 하기 표 6에 제공된다.
[표 6]
도 12e 및 도 12g에 나타낸 데이터는 본 출원의 검정 및 방법에 따른 혈장 측정치가 인지 정상 및 경증 내지 중등도 치매 서브세트 각각에서 유사한 예측력을 제공한다는 것을 나타낸다.
실시예 12: CSF β-아밀로이드에 비교한, 혈장 중의 p217+타우를 검출하기 위한 검정의 임상적 적격성
AD의 진단 및 병기 결정에서 실시예 1의 예시적인 검정의 유용성을 평가하기 위해, 검정을 사용하는 p217+타우 측정을 위한 혈장 샘플이 얻어졌다. 이러한 측정치를 CSF β-아밀로이드 수준과의 상관관계에 대해 분석하였다.
CSF β-아밀로이드 수준에 대한 혈장 p217+타우의 상관관계
210명의 환자의 코호트를 사용하여 CSF β-아밀로이드 수준에 대한 혈장에서 검출된 p217+타우 펩티드의 상관관계를 평가하였다. 이러한 코호트로부터의 CSF 샘플을 측정하여 샘플 내에 존재하는 Aβ42의 양 및 Aβ40의 양을 결정하였다. 동일한 227명의 대상체로부터의 혈장 샘플을 상기 기재된 실시예 1의 예시적인 검정에 따라 측정하였다. Aβ40의 양에 대한 검출된 Aβ42의 양의 비는 아밀로이드성 질환의 발생 위험이 없는 건강한 대상체로부터 아밀로이드성 질환을 갖거나 발생 위험이 있는 대상체를 구별하기 위한 선행 지표이다. 도 13a에는, 각각의 대상체에 대해, 상응하는 CSF 샘플에서 Aβ40의 양에 대한 검출된 Aβ42의 양의 비(Aβ42/40 비)(X-축에 나타냄)를 상응하는 혈장 샘플에서 검출된 p217+타우의 양(fg/ml 단위)(Y-축에 나타냄)에 대해 맵핑한다. 감소된 Aβ42/40 비를 갖는 환자는 A+로 식별될 수 있으며, 이는 환자가 아밀로이드성 질환을 갖거나 발생 위험이 있음을 나타낸다. 증가된 Aβ42/40 비를 갖는 환자는 A-로 식별될 수 있으며, 이는 환자가 건강하거나 아밀로이드성 질환의 발생 위험이 없음을 나타낸다. 본 실시예의 경우, 0.089 이하의 Aβ42/40 비는 A+로 식별되는 반면에, 0.089 초과의 Aβ42/40 비는 A-로 지칭된다.
도 13b로부터의 데이터를 사용하여 T- 환자로부터 T+를 갖는 환자를 구별하는 혈장 p217+타우 측정치의 능력에 대한 ROC 곡선(도 13a)을 생성하였다. 혈장 p217+타우는 AUC = 0.8964로 환자가 A+일 것인지, 또는 A-일 것인지를 예측하기 위한 높은 정확도를 나타냈다. ROC 곡선의 유덴 인덱스 분석은 A- 환자로부터 A+ 환자를 구별하기 위한 혈장 p217+타우의 역치 값을 103.9 fg/ml로 결정하였다.
도 13b는 또한 제1 역치 값(0.089로 상기 결정된 바와 같음)을 나타내는 수직 점선을 포함하며, 그 미만이면 Aβ42/40 비는 A+ 환자의 것을 나타낼 것이고, 제2 역치 값(103.9 fg/ml인 것으로 상기 결정된 바와 같음)을 나타내는 상응하는 수평 점선을 포함하며, 그 미만이면 혈장 p217+타우 수준은 A- 환자의 것을 나타낼 것이다. Aβ42/40 비가 제1 역치 값 미만이고 혈장 p217+타우 수준이 제2 역치 값 초과인 "진성+"로 표지된 상단 좌측 사분면은, 아밀로이드성 질환을 갖거나 발생 위험이 있는 것으로 대상체를 식별함에 있어서 Aβ42/40 비 및 혈장 p217+타우 측정치 둘 모두가 동조함을 나타낸다. "진성-"로 표지된 하단 우측 사분면은 둘 모두의 Aβ42/40 비가 제1 역치 값 초과이고 혈장 p217+타우 수준이 제2 역치 값 미만인 대상체에 상응하며, 이는 아밀로이드성 질환의 발생 위험이 없는 것으로 대상체를 식별함에 있어서 Aβ42/40 비 및 혈장 p217+타우 측정치 둘 모두가 동조함을 나타낸다. "가성+"로 표지된 상단 우측 사분면은 Aβ42/40 비 및 혈장 p217+타우 수준이 각각 제1 및 제2 역치 값 초과인 대상체에 상응하며, 이는 혈장 p217+타우 수준은 아밀로이드성 질환을 갖거나 발생 위험이 있는 것으로 그 대상체를 식별하는 반면에 Aβ42/40 비는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. "가성-"로 표지된 하단 좌측 사분면은 Aβ42/40 비가 제1 역치 값 미만이고 혈장 p217+타우 수준이 제2 역치 값 미만으로 측정된 대상체에 상응하며, 이는 Aβ42/40 비는 아밀로이드성 질환을 갖거나 발생 위험이 있는 것으로 그 대상체를 식별하는 반면에 혈장 p217+타우 수준은 그렇지 않다는 것을 나타낸다. 도 13b는 각각 1 및 18%에서 낮은 가성 +/- 비율을 나타낸다. 도 13b의 각각의 사분면에서 식별된 대상체의 수는 하기 표 7에 제공된다.
[표 7]
도 13d 및 도 13f는 인지 정상 대 경증 내지 중등도 치매 환자에 의해 분리된 도 13b의 데이터를 나타낸다. 도 13d는 인지 정상 환자 서브세트에 대한 데이터를 나타내고 도 13f는 경증 내지 중등도 치매 환자 서브세트에 대한 데이터를 나타낸다.
도 13d로부터의 데이터를 사용하여 인지 정상 환자 서브세트(n =70)에서 A- 환자로부터 A+를 갖는 환자를 구별하는 혈장 p217+타우 측정치의 능력에 대한 ROC 곡선(도 13c)을 생성하였다. 인지 정상 환자 서브세트에 대한 혈장 p217+타우 측정치는 AUC = 0.6554를 갖는 ROC 곡선을 갖는다. ROC 곡선의 유덴 인덱스 분석을 사용하여 A- 환자로부터 A+ 환자를 구별하기 위한 혈장 p217+타우의 역치 값을 결정하였다.
도 13d는 또한 제1 역치 값(0.089로 상기 결정된 바와 같음)을 나타내는 수직 점선을 포함하며, 그 미만이면 Aβ42/40 비는 A+ 환자의 것을 나타낼 것이고, 제2 역치 값(도 13c의 ROC 곡선에 의해 결정된 바와 같음)을 나타내는 상응하는 수평 점선을 포함하며, 그 미만이면 혈장 p217+타우 수준은 A- 환자의 것을 나타낼 것이다. "진성+"로 표지된 상단 좌측 사분면은 Aβ42/40 비는 제1 역치 값 미만이고 혈장 p217+타우 수준은 제2 역치 값 초과이다. "진성-"로 표지된 하단 우측 사분면은 둘 모두의 Aβ42/40 비는 제1 역치 값 초과이고 혈장 p217+타우 수준은 제2 역치 값 미만인 대상체에 상응한다. "가성+"로 표지된 상단 우측 사분면은 Aβ42/40 비 및 혈장 p217+타우 수준이 각각 제1 및 제2 역치 값 초과인 대상체에 상응한다. "가성-"로 표지된 하단 좌측 사분면은 Aβ42/40 비가 제1 역치 값 미만이고 혈장 p217+타우 수준이 제2 역치 값 미만으로 측정된 대상체에 상응한다. 도 13d는 각각 10 및 24%에서 가성 +/- 비율을 나타낸다. 도 13d의 각각의 사분면에서 식별된 대상체의 수는 하기 표 8에 제공된다.
[표 8]
도 13f로부터의 데이터를 사용하여 경증 내지 중등도 치매 환자 서브세트(n =140)에서 A- 환자로부터 A+를 갖는 환자를 구별하는 혈장 p217+타우 측정치의 능력에 대한 ROC 곡선(도 13e)을 생성하였다. 혈장 p217+타우 측정치는 경증 내지 중등도 치매 환자 서브세트에서 AUC = 0.9832로 높은 정확도를 제공하였다. ROC 곡선의 유덴 인덱스 분석을 사용하여 A- 환자로부터 A+ 환자를 구별하기 위한 혈장 p217+타우의 역치 값을 결정하였다.
도 13f는 또한 제1 역치 값(0.089로 상기 결정된 바와 같음)을 나타내는 수직 점선을 포함하며, 그 미만이면 Aβ42/40 비는 A+ 환자의 것을 나타낼 것이고, 제2 역치 값(도 13e의 ROC 곡선에 의해 결정된 바와 같음)을 나타내는 상응하는 수평 점선을 포함하며, 그 미만이면 혈장 p217+타우 수준은 A- 환자의 것을 나타낼 것이다. "진성+"로 표지된 상단 좌측 사분면은 Aβ42/40 비는 제1 역치 값 미만이고 혈장 p217+타우 수준은 제2 역치 값 초과이다. "진성-"로 표지된 하단 우측 사분면은 둘 모두의 Aβ42/40 비는 제1 역치 값 초과이고 혈장 p217+타우 수준은 제2 역치 값 미만인 대상체에 상응한다. "가성+"로 표지된 상단 우측 사분면은 Aβ42/40 비 및 혈장 p217+타우 수준이 각각 제1 및 제2 역치 값 초과인 대상체에 상응한다. "가성-"로 표지된 하단 좌측 사분면은 Aβ42/40 비가 제1 역치 값 미만이고 혈장 p217+타우 수준이 제2 역치 값 미만으로 측정된 대상체에 상응한다. 도 13f는 각각 0 및 6%에서 가성 +/- 비율을 나타낸다. 도 13f의 각각의 사분면에서 식별된 대상체의 수는 하기 표 9에 제공된다.
[표 9]
도 13d 및 도 13f에 제공된 데이터는 본 출원의 검정 및 방법에 따른 혈장 측정치가 경증 내지 중등도 치매 환자 서브세트에서 예측 정확도의 개선을 제공한다는 것을 나타낸다.
실시예 13: 생화학적 정제를 이용한 CSF p217+타우에 대한 혈장 p217+타우의 상관관계
CSF에서 검출된 p217+타우에 대한 혈장에서 검출된 p217+타우 펩티드의 상관관계를 추가로 평가하기 위해 36명의 환자의 부가적인 코호트를 시험하였다. 이러한 코호트에서의 CSF 샘플을, 콜브 '492 특허의 실시예 1에 기재된 pT3xhT43 검정을 사용하여 측정하였다. 동일한 대상체로부터의 혈장 샘플을 3가지 상이한 방식으로 측정하였다. 첫 번째는, 비정제 혈장 샘플을 실시예 1의 예시적인 검정에 따라 측정한다. 두 번째는, 타우 펩티드를 혈장 샘플로부터 화학적으로 추출하고 실시예 1의 예시적인 검정에 따라 측정한다. 세 번째는, 간섭 단백질이 열에 의해 변성되도록 혈장 샘플을 실시예 2에 따라 반-변성시킨다. 도 14a에는, 각각의 대상체에 대해, 상응하는 CSF 샘플에서 검출된 p217+타우의 양(pg/mL 단위)(X-축에 나타냄)을 상응하는 비정제 혈장 샘플에서 검출된 p217+타우의 양(fg/ml 단위)(Y-축에 나타냄)에 대해 맵핑한다. 도 14a에 대한 선형 회귀(나타내지 않음)는 R2 = 0.6418을 갖는다. 도 14b에는, CSF 샘플 p217+타우의 양(pg/mL 단위)(X-축에 나타냄)을 상응하는 화학적으로 추출된 혈장 샘플에서 검출된 p217+타우의 양(fg/ml 단위)(Y-축에 나타냄)에 대해 맵핑한다. 도 14b에 대한 선형 회귀(나타내지 않음)는 R2 = 0.6748을 갖는다. 도 14c에는, CSF 샘플 p217+타우의 양(pg/mL 단위)(X-축에 나타냄)을 상응하는 반-변성 혈장 샘플에서 검출된 p217+타우의 양(fg/ml 단위)(Y-축에 나타냄)에 대해 맵핑한다. 도 14c에 대한 선형 회귀(나타내지 않음)는 R2 = 0.5484를 갖는다.
실시예 14: 외인성 항-타우 항체로 치료된 대상체에서의 총 p217+타우의 정량화
항-타우 항체, 특히, 항-p217+타우 항체를 이용한 치료를 받고 있는 대상체로부터 얻어진 혈장 샘플에서 총 p217+타우를 검출하기 위해 본 출원의 검정 및 방법을 사용할 수 있다. 그러나, 항-타우 항체를 이용한 치료를 받고 있는 대상체의 혈장 샘플 내의 p217+타우의 검출은 혈장 샘플 내의 치료 항체의 존재에 의해 야기되는 간섭 및/또는 아티팩트를 겪을 수 있다. 따라서, p217+타우 신호가 반-변성 샘플 유체 중에 잔류하는 것을 허용하면서 치료 항체로부터의 간섭을 감소시키기 위해, 실시예 2에 기재된 반-변성 샘플 유체를 생성하는 단계를 사용하여 항-타우 항체를 이용한 치료를 받고 있는 대상체로부터의 혈장 샘플을 처리할 수 있다.
실시예 14는 실시예 2에 따라 반-변성 샘플 유체를 얻는 단계에 대해 기재된 것들과 동일한 방식으로 샘플을 변성시키는 단계로 실시예 1의 예시적인 검정을 변형한다. HV 및 AD 대상체의 혈장 샘플을 사용하여 변형된 예시적인 검정을 평가한다. 실시예 10의 예시적인 검정에 따라 이러한 혈장 샘플을 가열하고 측정하였으며, 결과(검출된 p217+타우의 pg/mL 단위)는 도 15a에 나타낸다. 도 15a의 좌측은 HV 대상체에 상응하는 데이터를 나타내고 그래프의 우측은 AD 대상체에 상응하는 데이터를 나타낸다. 각각의 대상체 카테고리에 대해, 평균 값은 더 긴 수평선으로 나타내고, 데이터세트의 ± 표준 편차(SD)는 평균 값 선의 상하에 더 짧은 선으로 나타낸다. 도 15a에서 알 수 있는 바와 같이, AD 대상체의 반-변성 혈장 샘플은 HV 대상체로부터 얻어진 것들보다 유의하게 더 높게 측정되었으며, 이는 실시예 1 검정을 이용하여 비정제 혈장 샘플에서 관찰된 결과를 반영한다.
감도 및 정밀도를 평가하기 위해, 실시예 14의 변형된 예시적인 검정을 사용하여 항-p217+타우 항체 요법의 1상 임상 시험으로부터의 585개의 혈장 샘플의 패널을 측정하였다. 실시예 1에 명시된 바와 같이 상이한 보정물질 펩티드 희석으로부터 얻어진 반-변성 샘플 유체의 8회의 별도 실행으로부터 대표적인 표준 곡선을 생성하였으며, 도 15b에 나타낸다. 실시예 14에 기재된 바와 같은 반-변성 샘플을 검정하기 위한 LLOQ와 ULOQ 사이의 직선 범위는 20% 미만의 CV 및 예상치의 80 내지 120% 회수율을 달성하는 최저 내지 최고 표준 곡선 지점으로서 정의되었으며, 이어서 샘플의 1:6 희석에 대해 보정되었다. 이러한 기준으로, 실시예 10의 변형된 예시적인 검정에 대한 직선 범위는 약 0.24 내지 180 pg/mL였다. 그러나 실제 샘플로 실시예 14의 변형된 예시적인 검정의 정밀도를 평가하기 위해, 각각의 반-변성 혈장 샘플로부터 검출된 p217+타우의 평균 양(fg/mL 단위)을 각각의 샘플에 대한 % CV에 대해 맵핑하였다(도 15c). 도 15c의 데이터는 CV가 14%의 평균을 갖는 0 내지 141%의 범위임을 나타낸다. 또한, 도 15c에 나타낸 샘플의 82%는 20% 미만의 CV를 가지며 샘플의 66%는 직선 범위 내에 있다. 수직 점선은 비정밀도가 증가하는 것으로 보이는 반-변성 샘플 내의 농도를 나타내며, 따라서 실시예 14의 방법으로 샘플-정의된 약 0.2 pg/ml의 LLOQ이다.
이러한 데이터를 고려하여, 외인성으로 투여된 항-타우 항체를 갖는 대상체로부터 얻어진 혈장 샘플 내의 p217+타우의 수준을 측정하여 혈장 중의 p217+타우 수준에 대한 항-타우 항체 요법의 약리학적 효과를 모니터링하기 위해, 본 출원의 검정 및 방법을 혈장 샘플의 분석전 조작과 조합할 수 있다는 것이 추가로 고찰된다.
실시예 15: 타우병증을 검출하고/하거나 예측하는 컴퓨터-구현 방법
실시예 15는 타우병증에 대한 바이오마커의 혈액-기반 측정치를 분석하여 대상체에서 타우병증의 검출 및/또는 예측을 개선하기 위한 예시적인 컴퓨터-구현 방법을 기재한다. 특히, 실시예 15에 사용된 바이오마커 측정치 중 하나는 혈청 샘플로부터 검정된 p217+타우 수준이다. 그러나, 실시예 15에 기재된 방법은 혈장에서 측정된 p217+타우 수준, 예컨대 실시예 1의 예시적인 검정을 사용하여 얻어진 측정치에 동일하게 적용가능하다는 것이 고찰된다.
실시예 15에서는, III상 임상 연구에서 경증 내지 중등도 AD를 갖는 199명의 대상체로부터의 혈장 및 혈청 샘플에서 23개의 혈액-기반 바이오마커의 패널을 검정하였다. 23개의 혈액-기반 바이오마커는 p217+타우, NFL, 아디포넥틴, 렙틴, 및 다른 염증 마커 및 대사 마커를 포함하였다. 또한, 이러한 환자 각각에 대해, p217+타우 수준은 또한 콜브 '492 특허의 실시예 1에 기재된 pT3xhT43 검정을 사용하여 CSF에서 측정되었다. 대상체의 CSF로부터 측정된 p217+타우 펩티드의 양이 21 pg/mL를 초과했다면 대상체는 "T-양성"인 것으로 결정되었으며, 이러한 농도는 "T" 상태를 정의하기 위한 Innotest p181-타우와 함께 일반적으로 사용되는 70 pg/mL의 컷오프에 상응한다. 199명의 대상체 모두에 대한 환자 인구통계학적 데이터(예를 들어, 연령 및 성별)와 함께, CSF에서의 23개의 바이오마커 측정치 및 p217+타우 측정치에 상응하는 데이터를, 이어서 트레이닝 세트(n = 150) 및 홀드아웃 세트(n = 49)의 2개의 상이한 데이터 세트로 분리하였다. 트레이닝 세트를 분석하여 CSF의 증가된 수준에 대해 더 높은 상관관계를 가진 특징을 선택하였다 - "T-양성"으로 식별된 대상체. 선택된 특징은 p217+타우, NFL, 아디포넥틴, 및 렙틴에 대한 혈액-기반 측정치를 포함한다. 트레이닝 세트를 사용하여 복수의 기계 학습 모듈을 트레이닝하였다. 구체적으로, 트레이닝 세트를 사용하여 서포트 벡터 머신 모듈, 랜덤 포레스트 모듈, 로지스틱 회귀 모듈, 구배 부스팅 모듈을 트레이닝하였다. 이러한 트레이닝된 기계 학습 모듈 모두의 앙상블을 사용하여 결과를 생성하였다.
앙상블 기계 학습 모듈에 의해 생성된 결과의 감도 및 정확도를 평가하기 위해, 홀드아웃 세트로부터의 데이터를 앙상블 기계 학습 모듈에 의해 분석하여 홀드아웃 세트의 각각의 대상체에 대한 데이터가 "T-양성" 대상체에 상응하는지 여부의 결정을 생성하였다. 이어서 앙상블 기계 학습 모듈에 의해 생성된 결정을 홀드아웃 세트의 대상체의 실제 "T-양성" 상태에 비교하여 앙상블 기계 학습 모듈의 감도 및 정확도를 평가한다. 하기 표 10에 나타낸 바와 같이 상이한 바이오마커 서브세트를 사용하여 이러한 방식으로 앙상블 기계 학습 모듈을 평가하였다.
[표 10]
대조군 데이터 서브세트는, 임의의 바이오마커 데이터를 배제하는, 홀드아웃 세트로부터의 데이터를 포함한다. 구체적으로, 각각의 대상체의 비-바이오마커 특징 - 연령 및 성별 - 을 사용하여 앙상블 기계 학습 모듈에 의해 대조군 데이터 서브세트를 분석하였다. 앙상블 기계 학습 모듈에 의해 대조군 데이터 서브세트에 대해 생성된 분석을 사용하여 임의의 바이오마커가 없이 홀드아웃 세트 내의 대상체의 "T-양성" 상태를 구별하는 앙상블 기계 학습 모듈의 능력에 대한 ROC 곡선을 생성하였으며, 이는 도 16a 내지 도 16e에 점선으로 나타낸다. 임의의 바이오마커 데이터 없이, 대조군 데이터 서브세트를 분석하는 앙상블 기계 학습 모듈에 대한 ROC 곡선의 AUC는 0.59이다.
데이터 서브세트 1 내지 5 각각은 대조군 데이터 서브세트 및 상기 표 10에 명시된 바이오마커에 상응하는 홀드아웃 세트로부터의 데이터를 포함한다. 데이터 서브세트 1 내지 5 각각에 대해 앙상블 기계 학습 모듈에 의해 생성된 분석은 하기 표 5 내지 표 9에 제공된다. 하기 표 5 내지 표 9에서 21 pg/mL를 초과하는 CSF 중의 p217+타우 측정치를 갖는 대상체는 "관찰+"로 열거되는 반면에 그 미만인 대상체는 "관찰-"로 열거된다. 표 5 내지 표 9에서 앙상블 기계 학습 모듈에 의해 "T-양성" 상태에 상응하는 것으로 식별된 대상체는 "예측+"로 열거되는 반면에 "T-양성" 상태에 상응하는 것으로 식별되지 않은 대상체는 "예측-"로 열거된다.
혈청으로부터의 p217+타우 측정치를 특징으로 이용하는 데이터 서브세트 1의 분석으로부터의 결과는 표 11에 제공된다. 표 11로부터의 데이터를 사용하여, 혈청으로부터의 p217+타우 측정치를 이용하여 홀드아웃 세트 내의 대상체의 "T-양성" 상태를 구별하는 앙상블 기계 학습 모듈의 능력에 대한 ROC 곡선을 생성하였으며, 이는 도 16a에 실선으로 나타낸다. ROC 곡선의 AUC는 0.87이다.
[표 11]
혈청으로부터의 p217+타우 측정치를 가지며 NFL에 대한 데이터가 특징인, 데이터 서브세트 2의 분석으로부터의 결과는 표 12에 제공된다. 표 12로부터의 데이터를 사용하여, 혈청으로부터의 p217+타우 측정치 및 NFL에 대한 데이터를 이용하여 홀드아웃 세트 내의 대상체의 "T-양성" 상태를 구별하는 앙상블 기계 학습 모듈의 능력에 대한 ROC 곡선을 생성하였으며, 이는 도 16b에 실선으로 나타낸다. ROC 곡선의 AUC는 0.89이다.
[표 12]
혈청으로부터의 p217+타우 측정치를 가지며, NFL 및 아디포넥틴에 대한 데이터가 특징인, 데이터 서브세트 3의 분석으로부터의 결과는 표 13에 제공된다. 표 13으로부터의 데이터를 사용하여, 혈청으로부터의 p217+타우 측정치, 및 NFL 및 아디포넥틴에 대한 데이터를 이용하여 홀드아웃 세트 내의 대상체의 "T-양성" 상태를 구별하는 앙상블 기계 학습 모듈의 능력에 대한 ROC 곡선을 생성하였으며, 이는 도 16c에 실선으로 나타낸다. ROC 곡선의 AUC는 0.92이다.
[표 13]
혈청으로부터의 p217+타우 측정치를 가지며, NFL, 아디포넥틴, 및 렙틴에 대한 데이터가 특징인, 데이터 서브세트 4의 분석으로부터의 결과는 표 14에 제공된다. 표 14로부터의 데이터를 사용하여, 혈청으로부터의 p217+타우 측정치, 및 NFL, 아디포넥틴, 및 렙틴에 대한 데이터를 이용하여 홀드아웃 세트 내의 대상체의 "T-양성" 상태를 구별하는 앙상블 기계 학습 모듈의 능력에 대한 ROC 곡선을 생성하였으며, 이는 도 16d에 실선으로 나타낸다. ROC 곡선의 AUC는 0.96이다.
[표 14]
NFL, 아디포넥틴, 및 렙틴에 대한 데이터를 특징으로 갖는, 데이터 서브세트 5의 분석으로부터의 결과는 표 15에 제공된다. 표 15로부터의 데이터를 사용하여, NFL, 아디포넥틴, 및 렙틴에 대한 데이터를 이용하지만 혈청으로부터의 p217+타우 측정치는 이용하지 않으면서, 홀드아웃 세트 내의 대상체의 "T-양성" 상태를 구별하는 앙상블 기계 학습 모듈의 능력에 대한 ROC 곡선을 생성하였으며, 이는 도 16e에 실선으로 나타낸다. ROC 곡선의 AUC는 0.78이다.
[표 15]
실시예 15에 사용된 바이오마커 특징 세트는 혈청 p217+타우, NFL, 아디포넥틴, 및 렙틴으로 이루어졌으며, 이들 각각은 CSF p127+ 타우 수준에 대한 스피어만 상관관계(Spearman correlation)가 각각 0.47, 0.37, 0.16, -0.23이다. 혈청 p217+타우, 연령, 및 성별을 특징으로 사용하는 기계 학습 분석은, 대조군 데이터 서브세트에 대한 0.59에 비교하여 0.87의 AUC를 갖는 성능 개선을 유발하였다. 순차적으로 NFL, 아디포넥틴, 및 렙틴을 특징으로 첨가함으로써 기계 학습 분석에 복잡성을 증가시키는 단계는 점진적으로 성능을 개선하여, 각각 0.89, 0.92, 및 0.96의 AUC를 유발하였다. 기계 학습 분석이 4개의 바이오마커 모두(혈청으로부터의 p217+타우 측정치, 및 NFL, 아디포넥틴, 및 렙틴에 대한 데이터)를 특징으로 포함하는 경우, 정확도는 0.84에서, 정보가 없는 비율보다 유의하게 더 높았다(p < 0.005). 혈청으로부터의 p217+타우 측정치를 특징으로부터 제거하는 것은 AUC를 0.78로 감소시켰으며, 따라서 p217+타우 측정치는 "T-양성" 상태를 예측하기 위한 유의한 바이오마커일 것임을 제시한다.
4개의 바이오마커 모두를 이용하면, 정확도는 0.84에서, 정보가 없는 비율보다 유의하게 더 높았다(p<0.005). 전체 모델로부터 혈청 타우를 누락시키는 것은 AUC를 0.78로 감소시켰다.
요약하면, 혈액-기반 바이오마커를 사용하여 타우 양성 대상체를 식별할 수 있다. 혈청 p217+타우는 경증 내지 중등도 AD 대상체에서 타우병증 또는 타우병증의 뇌 병리를 예측하기 위한 최상의 단일 분석물이었다(예를 들어, CSF에서 검출된 p217+타우의 양).
본 명세서에 기재되고 청구된 발명은 본 명세서에 개시된 구체적인 실시 형태에 의해 범주가 제한되지 않는데, 그 이유는 이들 실시 형태가 본 발명의 몇몇 태양의 예시로서 의도되기 때문이다. 임의의 등가의 실시 형태는 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 실제로, 본 명세서에 도시 및 기재된 것들에 더하여 본 발명의 다양한 수정이 전술한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 수정은 또한 첨부된 청구범위의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물은 전체적으로 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> JANSSEN PHARMACEUTICA NV
<120> BLOOD-BASED ASSAY FOR DETECTING TAUOPATHY OR AMYLOIDOGENIC
DISEASE
<130> JAB7064
<140>
<141>
<150> 63/200,399
<151> 2021-03-04
<150> 62/705,759
<151> 2020-07-14
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 441
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> tau protein 2N4R
<400> 1
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val
65 70 75 80
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu
85 90 95
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
100 105 110
Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val
115 120 125
Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
145 150 155 160
Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro
165 170 175
Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly
180 185 190
Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser
195 200 205
Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
210 215 220
Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys
225 230 235 240
Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val
245 250 255
Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
260 265 270
Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln
275 280 285
Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser
305 310 315 320
Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln
325 330 335
Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser
340 345 350
Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn
355 360 365
Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala
370 375 380
Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser
385 390 395 400
Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser
405 410 415
Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val
420 425 430
Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
435 440
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CDR-H1 Sequence of PT82 mAb
<400> 2
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn
1 5 10
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CDR-H2 Sequence of PT82 mAb
<400> 3
Gln Ile Arg Leu Gln Ser Asp Asn Tyr Ala Thr Arg Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 4
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CDR-H3 sequence of PT82 mAb
<400> 4
Gly Ile Thr Tyr
1
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CDR-L1 Sequence of PT82 mAb
<400> 5
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CDR-L2 Sequence of PT82 mAb
<400> 6
Ser Ala Ser Ile Arg Tyr Thr
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CDR-L3 Sequence of PT82 mAb
<400> 7
Gln Gln Phe Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 8
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> VH sequence of PT82 mAb
<400> 8
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Arg Leu Gln Ser Asp Asn Tyr Ala Thr Arg Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Thr Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala
115
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> VL sequence of PT82 mAb
<400> 9
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ile Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Tyr Met Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Phe Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> HCDR1 of HT43 mAb
<400> 10
Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Gly Met Ser
1 5 10
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> HCDR2 of HT43 mAb
<400> 11
Thr Ile Asn Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> HCDR3 of HT43 mAb
<400> 12
Ser Trp Asp Gly Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 13
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> LCDR1 of HT43 mAb
<400> 13
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Phe Glu
1 5 10 15
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> LCDR2 of HT43 mAb
<400> 14
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> LCDR3 of HT43 mAb
<400> 15
Phe Gln Gly Ser Leu Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 16
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> Heavy chain variable region of HT43 mAb
<400> 16
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Thr Ile Asn Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Ser Trp Asp Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 17
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> Light chain variable region of HT43 mAb
<400> 17
Asp Val Leu Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser Leu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 18
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> calibrant peptide pT3xhT43
<220>
<221> SITE
<222> (20)..(21)
<223> dPEG4 linker
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(26)
<223> phosphorylated threonine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (31)..(31)
<223> phosphorylated threonine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)..(40)
<223> C-terminal amide
<400> 18
Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr Tyr Gly
1 5 10 15
Leu Gly Asp Arg Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro
20 25 30
Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val
35 40
<210> 19
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> PT3 mouse mAb VH
<400> 19
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Asn Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Lys Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asn Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Trp Gly Asp Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Val Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> PT3 mouse mAb VL
<400> 20
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Arg Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Leu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Asp Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 21
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> PT3 humanized mAb VH
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Lys Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Trp Gly Asp Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Val Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> PT3 humanized mAb VL
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Arg Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Leu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> PT3 mouse mAb HCDR1, Kabat numbering
<400> 23
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> PT3 mouse mAb HCDR2, Kabat numbering
<400> 24
Ser Ile Ser Lys Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asn Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> PT3 mouse mAb HCDR3, Kabat numbering
<400> 25
Gly Trp Gly Asp Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> PT3 mouse mAb LCDR1, Kabat numbering
<400> 26
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Arg Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> PT3 mouse mAb LCDR2, Kabat numbering
<400> 27
Arg Ala Asn Arg Leu Leu Asp
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> PT3 mouse mAb LCDR3, Kabat numbering
<400> 28
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu Thr
1 5
Claims (31)
- 대상체에서 p217+타우 펩티드를 검출하는 검정 방법으로서,
대상체로부터 혈장 샘플을 얻는 단계;
혈장 샘플을 p217+타우 에피토프에 대해 지향된 포획 항체와 접촉시켜 포획 항체를 혈장 샘플 내의 p217+타우 펩티드에 결합시켜 항체-펩티드 복합체를 형성하는 단계;
항체-펩티드 복합체를 세척하는 단계;
항체-펩티드 복합체를 검출 항체와 접촉시켜 검출 항체를 항체-펩티드 복합체에 결합시키는 단계; 및
검출 항체를 검출하여 혈장 샘플 내의 p217+타우 펩티드의 양을 결정하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 포획 항체는 고체상 위에 고정되는, 방법.
- 제2항에 있어서, 고체상은 자성 비드인, 방법.
- 제1항에 있어서, 포획 항체는 인간 타우 단백질의 아미노산 210 내지 220을 함유하는 에피토프에 결합하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 검출 항체는 인간 타우 단백질의 아미노산 7 내지 20 또는 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 결합하는, 방법.
- 제4항에 있어서, 포획 항체는 pT3인, 방법.
- 제5항에 있어서, 검출 항체는 pT82인, 방법.
- 제3항에 있어서, 포획 항체와 접촉시키는 단계 전에 혈장 샘플을 샘플 희석제로 희석하며, 샘플 희석제는 비이온성 계면활성제 및 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
- 대상체에서 타우병증을 검출하는 방법으로서,
대상체로부터 혈장 샘플을 얻는 단계;
검정을 사용하여 혈장 샘플 내의 p217+타우 펩티드의 양을 검출하며, 여기서 검정은 p217+타우 에피토프에 대해 지향된 포획 항체를 사용하여 포획 항체를 혈장 샘플 내의 p217+타우 펩티드에 결합시켜 항체-펩티드 복합체를 형성하고 검출 항체를 사용하여 검출 항체를 항체-펩티드 복합체에 결합시키는 단계; 및
p217+타우 펩티드의 양이 사전결정된 역치 값 초과인 경우에 대상체는 타우병증을 갖거나 타우병증의 발생 위험이 있는 것으로 결정하며, 여기서 사전결정된 역치 값은 검정의 정량 하한(LLOQ: Lower Limit of Quantification) 초과인 단계를 포함하는, 방법. - 제9항에 있어서, 검정은 존재하는 p217+타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 전에 면역침전에 의해 혈장 샘플로부터 p217+타우 펩티드를 농축하지 않는, 방법.
- 제9항에 있어서, 혈장 샘플은 비정제 혈장인, 방법.
- 제9항에 있어서, LLOQ는 검정의 변동 계수(CV: coefficient of variation)의 15 내지 25%에 상응하는, 방법.
- 제12항에 있어서, LLOQ는 검정의 CV의 20%에 상응하는, 방법.
- 제9항에 있어서, 사전결정된 역치 값은 LLOQ의 3배 이상인, 방법.
- 제9항에 있어서, 사전결정된 역치 값은 검정의 검출 하한의 10배 이상인, 방법.
- 제9항에 있어서, 타우병증은 가족성 알츠하이머병, 산발성 알츠하이머병, 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반하는 전측두엽 치매(FTDP-17), 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 픽병, 진행성 피질하 신경교증, 농축체 단독 치매, 석회화를 동반하는 광범위 신경섬유 매듭, 은친화성 과립성 치매, 근위축성 측삭 경화증 파킨슨증-치매 복합군, 다운 증후군, 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커병, 할러포르텐-스파츠병, 봉입체 근염, 크로이츠펠트-야콥병, 다계통 위축증, C형 니만-픽병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아급성 경화성 범뇌염, 근긴장성 이영양증, 신경섬유 매듭을 동반하는 비-괌 운동 신경세포병, 뇌염후 파킨슨증, 만성 외상성 뇌병증, 및 권투선수 치매(복싱병)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제16항에 있어서, 타우병증은 알츠하이머병인, 방법.
- 제16항에 있어서, 타우병증은 진행성 핵상 마비인, 방법.
- 대상체에서 아밀로이드성 질환을 검출하는 방법으로서,
대상체로부터 혈장 샘플을 얻는 단계;
검정을 사용하여 혈장 샘플 내의 p217+타우 펩티드의 양을 검출하며, 여기서 검정은 p217+타우 에피토프에 대해 지향된 포획 항체를 사용하여 포획 항체를 혈장 샘플 내의 p217+타우 펩티드에 결합시켜 항체-펩티드 복합체를 형성하고 검출 항체를 사용하여 검출 항체를 항체-펩티드 복합체에 결합시키는 단계; 및
p217+타우 펩티드의 양이 사전결정된 역치 값 초과인 경우에 대상체는 아밀로이드성 질환을 갖거나 아밀로이드성 질환의 발생 위험이 있는 것으로 결정하며, 여기서 사전결정된 역치 값은 검정의 정량 하한(LLOQ) 초과인 단계를 포함하는, 방법. - 제19항에 있어서, 검정은 존재하는 p217+타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 전에 면역침전에 의해 혈장 샘플로부터 p217+타우 펩티드를 농축하지 않는, 방법.
- 제19항에 있어서, 혈장 샘플은 비정제 혈장인, 방법.
- 제19항에 있어서, LLOQ는 검정의 변동 계수(CV)의 15 내지 25%에 상응하는, 방법.
- 제22항에 있어서, LLOQ는 검정의 CV의 20%에 상응하는, 방법.
- 제19항에 있어서, 사전결정된 역치 값은 LLOQ의 3배 이상인, 방법.
- 제19항에 있어서, 사전결정된 역치 값은 검정의 정량 하한의 10배 이상인, 방법.
- 제19항에 있어서, 아밀로이드성 질환은 알츠하이머병인, 방법.
- 대상체에서 타우병증을 검출하거나 예측하기 위한 방법으로서,
혈장 샘플을 p217+타우 에피토프에 대해 지향된 포획 항체와 접촉시켜 포획 항체를 혈장 샘플 내의 p217+타우 펩티드에 결합시켜 항체-펩티드 복합체를 형성하는 단계, 및 별도로 항체-펩티드 복합체를 검출 항체와 접촉시켜 검출 항체를 항체-펩티드 복합체에 결합시키는 단계에 의해 혈장 샘플 내의 p217+타우 펩티드의 양을 검출하는 단계;
검출된 p217+타우 펩티드의 양에 상응하는 타우 데이터를 생성하는 단계;
대상체로부터 검출된 하나 이상의 바이오마커에 상응하는 바이오마커 데이터를 얻으며, 여기서 바이오마커는 NFL, 아디포넥틴, 및 렙틴을 포함하는 군으로부터 선택되는 단계; 및
기계 학습 모듈을 사용하여 타우 데이터 및 추가의 바이오마커 데이터를 참조 데이터 세트에 비교하여 대상체가 타우병증을 갖거나 타우병증의 발생 위험이 있는지 여부를 결정하거나 예측하는 단계를 포함하는, 방법. - 제27항에 있어서, 기계 학습 모듈은 서포트 벡터 머신(support vector machine) 모듈, 랜덤 포레스트(random forest) 모듈, 로지스틱 회귀(logistic regression) 모듈, 및 구배 부스팅(gradient boosting) 모듈 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
- 제27항에 있어서, 타우병증은 가족성 알츠하이머병, 산발성 알츠하이머병, 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반하는 전측두엽 치매(FTDP-17), 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 픽병, 진행성 피질하 신경교증, 농축체 단독 치매, 석회화를 동반하는 광범위 신경섬유 매듭, 은친화성 과립성 치매, 근위축성 측삭 경화증 파킨슨증-치매 복합군, 다운 증후군, 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커병, 할러포르텐-스파츠병, 봉입체 근염, 크로이츠펠트-야콥병, 다계통 위축증, C형 니만-픽병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아급성 경화성 범뇌염, 근긴장성 이영양증, 신경섬유 매듭을 동반하는 비-괌 운동 신경세포병, 뇌염후 파킨슨증, 만성 외상성 뇌병증, 및 권투선수 치매(복싱병)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제27항에 있어서, 타우병증은 알츠하이머병인, 방법.
- 제27항에 있어서, 타우병증은 진행성 핵상 마비인, 방법.
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