CN104422666A - 一种检测土壤谷氨酸脱氢酶活性的分析方法 - Google Patents

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张丽莉
杨立杰
武志杰
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Abstract

本发明涉及一种检测土壤中谷氨酸脱氢酶活性的分析方法：1）称取土壤使用氯仿进行熏蒸于试管中，向试管中加入三羟甲基氨基甲烷缓冲液振荡，将酶提取到此溶液中；提取后离心；离心后将每一个试管的上清液加入到2个丙烯酸比色皿中，向其中一个比色皿中NH4 +溶液，酮戊二酸溶液和0.08-0.12ml NADPH溶液；另外一个比色皿作为对照，酮戊二酸用等体积的三羟甲基氨基甲烷缓冲液代替；盖上盖子，混匀，置于室温条件下比色；根据得到的吸光度值和标准曲线的斜率计算出对应的NADPH浓度。1）本发明首次探明土壤中谷氨酸脱氢酶的测定方法；2）减少对设备要求的依赖性；3）方法准确度高，易操作；4）结果稳定可靠，重现性好。

Description

一种检测土壤谷氨酸脱氢酶活性的分析方法
技术领域
本发明涉及土壤中谷氨酸脱氢酶活性的测定，具体地说是一种检测土壤中谷氨酸脱氢酶活性的分析方法。
背景技术
土壤中的谷氨酸脱氢酶催化酮戊二酸生成谷氨酸盐的反应：
氮是土壤中微生物生长繁殖所需最重要的营养元素，细菌和真菌可利用很多种有机和无机氮化合物。微生物对有机氮和无机氮的利用比例强烈影响氮在土壤中的循环以及微生物和植物对氮的竞争。NH4 +是土壤中能够被直接利用的无机氮形态，微生物对无机氮的利用有两种机制，结果都是通过胺化作用将α-酮戊二酸合成谷氨酸盐。其中一种途径由谷氨酸脱氢酶（E.C.1.4.13）进行催化。谷氨酸脱氢酶对NH4 +的俘获能力较弱，亲合力较小（较大的Km值），因此只有在NH4 +浓度较高时这种酶的有效性才能显现出来，但当土壤中微生物活动需要的C源不足时，此种酶的优势就显现出来，因为这种酶发挥作用不需要ATP。对这种酶活性的测定有助于理解微生物对无机氮不同利用途径的强弱，对探究土壤氮的形为具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检验土壤中谷氨酸脱氢酶活性的分析方法。该方法是首次对土壤谷氨酸脱氢酶活性的测定，通过对不同土壤样品的测定表明，分析结果精确可靠，分析重现性较好。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种检测土壤中谷氨酸脱氢酶活性的分析方法：
1）称取过2-4mm筛的土壤风干样品使用氯仿进行熏蒸；
2）称取熏蒸后的土壤每份1克于n（n≥6）支硼硅酸盐试管中，向试管中加入2.2-2.8ml三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.6）振荡50-70分，将酶提取到此溶液中；
3）提取后样品在13000-16000转/分条件下离心1-3分钟；
4）离心后将每一个试管的上清液加入到2个丙烯酸比色皿中，每个取0.5-0.9ml；
5）向其中一个比色皿中加入0.08-0.12ml NH4 +溶液（100mM），0.08-0.12ml酮戊二酸溶液（60mM）和0.08-0.12ml NADPH溶液（1.5mM）；
6）另外一个比色皿作为对照，酮戊二酸用等体积的三羟甲基氨基甲烷缓冲液代替；
7）比色皿盖上盖子，混匀，置于室温条件下，在340nm条件下比色，3小时内比色3次，每小时1次，分别得到吸光度值A1,A2和A3；
8）根据得到的吸光度值和标准曲线的斜率b计算出对应的NADPH浓度，设定浓度为S，S=A*b；
9）计算出NADPH浓度在单位时间内的减少量，设定减少量为Sd，Sd=[(S1-S2)+(S2-S3)]/2；
10）谷氨酸脱氢酶活性用单位时间NADPH浓度的减少量来表示，单位μmol NADPH kg-1干土h-1)。
标准曲线的制作：溶解1molNADPH于100ml三羟甲基氨基甲烷中得溶液A，分别吸取1,2,3,4,5ml溶液A用100ml三羟甲基氨基甲烷溶液溶解，得到浓度为10，20，30，40和50μmol/ml的B1～B5溶液，将B1～B5溶液在340nm条件下比色，根据得到的吸光度和样品浓度绘制标准曲线，得到斜率b。
本发明方法的测定原理
在土壤中，谷氨酸脱氢酶在发挥上述作用的同时需要消耗NADPH作为电子受体，在反应过程中被氧化，NADPH可以在340nm条件下通过分光光度计检测。通过测定单位时间内NADPH浓度的变化来表示谷氨酸脱氢酶的活性。
具体实施方式
1.试剂配制：
1)三羟基氨基甲烷缓冲液（pH7.6）：溶解12.12g l-1三羟基氨基甲烷于水中；
2)60mM酮戊二酸溶液：溶解10.09gα-酮戊二酸于100ml缓冲液中；
3)100mM(NH4)2Cl溶液：溶解0.89g氯化铵于1l-1缓冲液中；
4)1.5mM NADPH溶液：溶解1.25gβ-NADPH l-1缓冲溶液。
标准曲线的制作：溶解1molNADPH于100ml三羟甲基氨基甲烷中，分解吸取1,2,3,4,5ml此液体用100ml三羟甲基氨基甲烷溶液溶解，得到浓度为10，20，30，40和50μmol/ml的溶液。将此溶液在340nm条件下比色，根据得到的吸光度和样品浓度绘制标准曲线，得到斜率b。
操作步骤：
1）称取过2-4mm筛的土壤n克风干样品使用氯仿进行熏蒸；
2）称取熏蒸后的土壤n克于n支硼硅酸盐试管中（16*100mm），每份1g，向试管中加入2.2-2.8ml三羟甲基氨基甲烷缓冲液振荡50-70分，将酶提取到此溶液中；
3）提取后样品在13000-16000转/分条件下离心1-3分钟；
4）离心后将每一个试管的上清液加入到2个丙烯酸比色皿中，每个取0.5-0.9ml；
5）向其中一个比色皿中加入0.08-0.12ml NH4+溶液，0.08-0.12ml酮戊二酸溶液和0.08-0.12ml NADPH溶液；
6）另外一个比色皿作为对照，酮戊二酸用等体积的三羟甲基氨基甲烷缓冲液代替；
7）比色皿盖上盖子，混匀，置于室温条件下，在340nm条件下比色，3小时内比色3次，每小时1次，分别得到吸光度值A1,A2和A3；
8）根据得到的吸光度值和标准曲线的斜率b(见下面标准曲线的制作)计算出对应的NADPH浓度，假定浓度为S，S=A*b；
9）计算出NADPH浓度在单位时间内的减少量，假定减少量为Sd，Sd=[(S1-S2)+(S2-S3)]/2；
10）谷氨酸脱氢酶活性用单位时间NADPH浓度的减少量来表示，单位μmol NADPH kg-1干土h-1)
标准曲线的制作：溶解1molNADPH于100ml三羟甲基氨基甲烷中，分解吸取1,2,3,4,5ml此液体用100ml三羟甲基氨基甲烷溶液溶解，得到浓度为10，20，30，40和50umol/ml的溶液。将此溶液在340nm条件下比色，根据得到的吸光度和样品浓度绘制标准曲线，得到斜率b。
实施例1
本实施例所使用的黑土采自于中国科学院海伦生态试验站，设三个不同的处理：1号为对照，既不经过任何处理和添加任何土壤添加剂在25℃培养24h以上的普通土壤；2号为添加硝化抑制剂DCD且在25℃培养24h以上的土壤；3号为添加硝化抑制剂DMPP且在25℃培养24h以上的土壤。土壤含水量均为20%(风干土重)。2号和3号添加硝化抑制剂的土壤，其中两种抑制剂的添加量都是50ppm，用上述方法检测三种土壤的谷氨酸脱氢酶活性。
每种土壤得具体分析步骤如下：
11）称取过2mm筛的土壤6g风干样品使用氯仿进行熏蒸；
12）称取熏蒸后的土壤6份于6支硼硅酸盐试管中（16*100mm），每份1g，向试管中加入2.5ml三羟甲基氨基甲烷缓冲液振荡一个小时，将酶提取到此溶液中；
13）提取后样品在15000rev/min条件下离心3分钟；
14）离心后将每一个试管的上清液加入到2个丙烯酸比色皿中，每个取0.7ml；
15）向其中一个比色皿中加入加入0.1mlNH4+溶液，0.1ml酮戊二酸溶液和0.1mlNADPH溶液；
16）另外一个比色皿作为对照，酮戊二酸用等体积的三羟甲基氨基甲烷缓冲液代替；
17）比色皿盖上盖子，混匀，置于室温条件下，在340nm条件下比色，3小时内比色3次，每小时1次，分别得到吸光度值A1,A2和A3；
18）根据得到的吸光度值和标准曲线的斜率b(见下面标准曲线的制作)计算出对应的NADPH浓度，假定浓度为S，S=A*b；
19）计算出NADPH浓度在单位时间内的减少量，Sd，Sd=[(S1-S2)+(S2-S3)]/2；
20）谷氨酸脱氢酶活性用单位时间NADPH浓度的减少量来表示，单位umol NADPH kg-1干土h-1)
标准曲线的制作：溶解1molNADPH于100ml三羟甲基氨基甲烷中，分解吸取1,2,3,4,5ml此液体用100ml三羟甲基氨基甲烷溶液溶解，得到浓度为10，20，30，40和50μmol/ml的溶液。将此溶液在340nm条件下比色，根据得到的吸光度和样品浓度绘制标准曲线，得到斜率b。
试验结果如下：
由表中数据可以看出，添加硝化抑制剂使土壤谷氨酸脱氢酶活性显著下降，第2种和第3种土壤之前无显著差异，说明不同的硝化抑制剂类别对土壤谷氨酸合成酶的活性影响不大，较小的标准差值表明该分析方法结果之间的偏差较小，精确度较高，重现性好。
实施例2
本实施例所使用的三种不同种植作物的棕壤均采于中国科学院沈阳生态实验站：其中4号土壤前茬作物为水稻，5号土壤前茬作物为玉米，6号土壤前茬作物为大豆。三种不同耕作制度的土壤均在含水量为20%(风干土重)，温度在25℃条件下培养24ｈ以上，测定其谷氨酸脱氢酶活性，具体步骤同实例1。
试验结果如下：
表中数据同样显示了分析结果的稳定性及较高的精密度。也表明不同的耕作制度对谷氨酸脱氢酶的活性影响较大。

Claims (2)

1.一种检测土壤中谷氨酸脱氢酶活性的分析方法，其特征在于：
1）称取过2-4mm筛的土壤风干样品使用氯仿进行熏蒸；
2）称取熏蒸后的土壤每份1克于n（n≥6）支硼硅酸盐试管中，向试管中加入2.2-2.8ml三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.6）振荡50-70分，将酶提取到此溶液中；
3）提取后样品在13000-16000转/分条件下离心1-3分钟；
4）离心后将每一个试管的上清液加入到2个丙烯酸比色皿中，每个取0.5-0.9ml；
5）向其中一个比色皿中加入0.08-0.12ml NH4 +溶液（100mM），0.08-0.12ml酮戊二酸溶液（60mM）和0.08-0.12ml NADPH溶液（1.5mM）；
6）另外一个比色皿作为对照，酮戊二酸用等体积的三羟甲基氨基甲烷缓冲液代替；
7）比色皿盖上盖子，混匀，置于室温条件下，在340nm条件下比色，3小时内比色3次，每小时1次，分别得到吸光度值A1,A2和A3；
8）根据得到的吸光度值和标准曲线的斜率b计算出对应的NADPH浓度，设定浓度为S，S=A*b；
9）计算出NADPH浓度在单位时间内的减少量，设定减少量为Sd，Sd=[(S1-S2)+(S2-S3)]/2；
10）谷氨酸脱氢酶活性用单位时间NADPH浓度的减少量来表示，单位μmol NADPH kg-1干土h-1)。
2.按权利要求1所述分析方法，其特征在于：
标准曲线的制作：溶解1molNADPH于100ml三羟甲基氨基甲烷中得溶液A，分别吸取1,2,3,4,5ml溶液A用100ml三羟甲基氨基甲烷溶液溶解，得到浓度为10，20，30，40和50μmol/ml的B1～B5溶液，将B1～B5溶液在340nm条件下比色，根据得到的吸光度和样品浓度绘制标准曲线，得到斜率b。
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