CN104419748A - 利用基因型检测强直性脊柱炎易感性的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用基因型检测强直性脊柱炎易感性的方法和试剂盒，其中，检测强直性脊柱炎易感性的方法包括：检测该个体的PSMB1基因、转录本和/或蛋白，并与正常的PSMB1基因、转录本和/或蛋白相比较，存在差异就表明该个体患强直性脊柱炎的可能性高于正常人群；该试剂盒包括：特异性扩增PSMB1基因或转录本的引物，所述的引物扩增出长度为100-2000bp且含有SEQ ID NO.1中第618位的扩增产物。本发明可用于早期辅助性诊断强直性脊柱炎，而且可使一些携带者在未发病前就采取合理的预防措施，从而提高携带者的生存期和生存质量，具有极其重大的应用价值和社会效益。

Description

利用基因型检测强直性脊柱炎易感性的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测强直性脊柱炎易感性的方法和试剂盒，特别是涉及一种利用基因型检测强直性脊柱炎易感性的方法和试剂盒。

背景技术

强直性脊柱炎又名别赫捷列夫氏（VonBechterev）病或马-施二氏（Maritstrumpell）病，是一种慢性、进行性，中轴关节受累的慢性炎症性疾病。主要影响骨盆的骶髂关节、脊柱关节和椎旁组织。主要症状为下腰痛、脊椎僵硬及运动范围受限、X线显示两侧骶髂关节炎(sacroilitis)为其特征。由于该病一般先侵犯骶髂关节，并重点累及脊柱，最终导致脊柱骨性强直，故目前国内外多称之为强直性脊柱炎（Ankglosing Spondytitis，AS）。

强直性脊柱炎有明显的种族性，在不同民族中发病率的差异很大。印第安人发病率最高，北美印第安人发病率为2.7％～6.3％。其次为白种人，白种人中发病率为0.1％～1.4％。黄种人低于白种人，我国约为0.3％。而黑人发病率最低，约为白人的1/4，在非洲仅为0.2％。

强直性脊柱炎好发于20至40岁的成年人，尤其是20～30岁的青年男性。

强直性脊柱炎呈常染色体显性遗传，有明显的家族遗传倾向,遗传因素>90％。据调查，强直性脊柱炎病人亲属发病率比一般人高一倍左右，同胞复发风险比为82.90％以上的AS病人具有HLA-B27阳性，在正常人群中阳性率为8％；子女HLA-B27阳性占50％，发生强直性脊柱炎的占25％。目前基本上已有定论，HLA-B27作为独立的致病基因在AS的发病中起作用。因为在HLA-B27阳性个体中只有1％～5％发展成为AS，提示还有其他基因参与AS的发病。

PSMB1基因位于6q27，大小约为22Kbp，其编码的产物属于蛋白酶体B型家族，是一种泛素-蛋白酶复合物中的20S核心β-亚单位。蛋白酶体是一种存在于胞质和胞核内的蛋白水解酶复合物，负责降解细胞内大部分蛋白质，在MHC I类分子包括HLA-B27分子的表达及相关抗原呈递过程中起关键作用。MHC I类分子呈递的抗原均来源于蛋白酶体的降解产物。蛋白酶体的功能受其结构组成的调控，其核心部分是由α和β亚单位组成的四环状圆柱形结构，与PA28结合后成为免疫蛋白酶体。PSMB1是β环中重要的结构亚单位。β环的改变会影响到降解蛋白质的速度及切割位点，以及内源性蛋白质的降解和抗原的呈递。PSMB1基因的多态性影响着免疫蛋白酶体与待降解目标蛋白的结合情况，引起降解内源性蛋白质产生的抗原肽的数量和性质发生改变，其中可能包括能诱导AS发生的特异性抗原肽。有研究发现PSMB1基因与另一种自身免疫性疾病I型糖尿病的发生有关（J Autoimmun.2005May;24(3):243-50）。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用基因型检测强直性脊柱炎易感性的方法和试剂盒，为辅助诊断（尤其是早期诊断）强直性脊柱炎和治疗强直性脊柱炎提供基础。

在本发明的第一方面，提供了一种对个体的利用基因型检测强直性脊柱炎易感性的方法的方法，包括步骤：

检测该个体的PSMB1基因、转录本和/或蛋白，并与正常的PSMB1基因、转录本和/或蛋白相比较，存在差异就表明该个体患强直性脊柱炎的可能性高于正常人群。

在另一优选例中，所述的方法中检测的是PSMB1的基因或转录本，并与正常PSMB1核苷酸序列比较差异。

在另一优选例中，所述的差异是以下的单核苷酸多态性（SNP）：

第618位的基因型CC；其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO.1。

在本发明的第二方面，提供了一种检测样品是否存在PSMB1基因的单核苷酸多态性的方法，包括步骤：

1）用PSMB1基因特异性引物扩增样品的PSMB1基因，得到扩增产物；

2）检测扩增产物中是否存在以下的单核苷酸多态性：

第618位的G/C多态（尤其是基因型CC）；其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO.1。

在另一优选例中，所述PSMB1基因特异性引物具有SEQ ID NO.2和3的序列。

在另一优选例中，所述的扩增产物的长度为100-2000bp，且含有SEQ ID NO.1中第618位。

在本发明的第三方面，提供了一种利用基因型检测强直性脊柱炎（强直性脊柱炎易感性）的试剂盒，其包括：特异性扩增PSMB1基因或转录本的引物，更佳地，所述的引物扩增出长度为100-2000bp且含有SEQ ID NO.1中第618位的扩增产物。

在另一优选例中，所述试剂盒还含有选自下组的试剂：

1）与SEQ ID NO.1中第618位的G/C多态相结合的探针；

2）识别SEQ ID NO.1中第618位的G/C多态的限制性内切酶。

在另一优选例中，所述第618位的G/C多态是G/C多态中的基因型CC。

所述引物的序列，可如SEQ ID NO.2和3所示。

所述扩增产物的长度为100-2000bp且含有SEQ ID NO.1中第618位。

本发明经过深入而广泛的研究，对大量候选基因的SNP进行了测定和分析。发现和证明了PSMB1的基因组序列与强直性脊柱炎密切相关，其中关联研究结果显示，在PSMB1基因的SEQ ID NO.1中第618位的SNP（第618位的基因型CC）在对照组和病例组中的分布存在显著性差异（P＜0.05），因此，可作为辅助性检测强直性脊柱炎（或其易感性）的特异性SNP。在此基础上完成了本发明。

本发明对PSMB1基因中的几乎整个区域进行了测序，关联研究表明SEQ ID NO.1中第618位的基因型CC是与强直性脊柱炎易感性关联性非常高的SNP。

具体而言，本发明揭示了PSMB1基因一种单核苷酸多态性(SNP)以及该多态性与强直性脊柱炎的相关性。本发明的SNP是SEQ ID NO.1所示序列的第618位的G/C多态，基因型CC在强直性脊柱炎病人群中的频率，要高于在正常对照人群中的频率。

基于本发明的新发现，PSMB1蛋白或多肽有多方面的新用途。这些用途包括：用于辅助性诊断强直性脊柱炎。

另一方面，本发明还包括对人PSMB1基因DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人PSMB1基因产物或片段。较佳地，指那些能与人PSMB1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人PSMB1蛋白的分子，也包括那些并不影响人PSMB1蛋白功能的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人PSMB1基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人PSMB1蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括弗氏佐剂等。

本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断人PSMB1蛋白功能的抗体以及不影响人PSMB1蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人PSMB1基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人PSMB1基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人PSMB1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人PSMB1蛋白的多少和/或突变与否。一种优选的抗PSMB1抗体是不识别正常PSMB1但识别突变PSMB1的抗体，或者识别正常PSMB1但不识别突变PSMB1的抗体。利用这些抗体，可以方便地进行蛋白质水平的强直性脊柱炎易感性检测。

利用本发明PSMB1蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与PSMB1蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明还涉及定量和定位检测人PSMB1蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括ELISA等。

一种检测检测样品中是否存在PSMB1蛋白的方法是利用PSMB1蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与PSMB1蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在PSMB1蛋白。

PSMB1蛋白的多聚核苷酸可用于PSMB1蛋白相关疾病的辅助诊断。在诊断方面，PSMB1蛋白的多聚核苷酸可用于检测PSMB1蛋白的表达与否或在疾病状态下PSMB1蛋白的异常表达。如PSMB1基因DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断PSMB1蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用PSMB1蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测PSMB1蛋白的转录产物。

检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。PSMB1蛋白突变的形式包括与正常野生型PSMB1基因DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

最方便的检测本发明SNP的方法，是通过用PSMB1基因特异性引物扩增样品的PSMB1基因，得到扩增产物；然后检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：第618位的基因型CC，其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO.1。

应理解，在本发明揭示了PSMB1基因的SNP与强直性脊柱炎的相关性之后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含该SNP位置的扩增产物，然后通过测序等方法确定是否存在第618位的基因型CC。通常，引物的长度为15-50bp，较佳地为20-30bp。虽然引物与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5′端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。

含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明SNP的对应位置。一种优选的引物对具有SEQ ID NO.2和3的序列。

虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为100-2000bp，较佳地为150-1500bp，更佳地为200-1000bp。这些扩增产物都应含有SEQ ID NO.1中第618位。

由于本发明的SNP与强直性脊柱炎具有非常高的关联性，因而可用于早期辅助性诊断强直性脊柱炎，而且可以未雨绸缪地使一些携带者在未发病前就采取合理的预防措施，从而提高携带者的生存期和生存质量，因此，具有极其重大的应用价值和社会效益。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

一、研究对象

病例样本全部采集自门诊病人，患者的诊断由富有临床经验的风湿病科医师根据1984年提出修订的纽约标准作出，并通过多次随访确诊。对照样本选自南方中心样本库中病例组年龄、性别匹配、无关节炎病史的个体。

在知情同意的基础上，随机收集了581例AS病人和612例健康的正常对照个体的外周血样本。

二、实验方法和结果

1、DNA提取

用常规酚氯仿法从人的外周血样本中提取DNA（也可采用商业化的试剂盒，提前DNA），浓度校正至20ng/μl后，用于常规PCR扩增。

2、用于PCR和测序中的引物设计

根据GenBank中PSMB1的基因组序列，设计和合成以下引物：

有义引物P1：5′-gctctttccgcagttgtttc-3′（SEQ ID NO.2所示）

反义引物P2：5′-accaaggctgtatcgcaatc-3′（SEQ ID NO.3所示）。

3、PSMB1基因的PCR扩增

以提取的DNA为模板，用含Taq酶的常规PCR反应所需试剂，在GeneAmp9700PCR仪上以Touchdown程序进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，63℃退火40秒，72℃延伸40秒，共10个循环，每个循环退火温度递减0.5℃；以后94℃变性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30个循环；最后72℃延伸7分钟。

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证。结果，获得PSMB1基因的扩增产物。

4、SNP的发现和检测

PCR产物经Resin树脂纯化后，用ABI-3730DNA测序仪（美国应用生物系统公司appliedbiosystems(ABI)）进行测序，用Polyphred软件（美国华盛顿大学http://droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html）进行序列的判读、基因分型和SNP确认。

结果，发现存在以下SNP：

SEQ ID NO.1中第618位的G/C多态（rs12717）。

其中，rs12717：

tgcatttatattcagttctgccactcccagttcatgcactgttgtcacatggctctttccgcagttgtttcttagtgggacttcagcacgccttgattttcccttctgtagttcattgtggcgtaatcatatgttatactgcttgttttctttgtactttttattatcagtgaggttgtgagctctttaaggataggaaatgttatatacattttttattagccaggacaattaacgttcccaccgttattcgagttgccgttgcgccatagttctgacaatttttttgtatggtcagacttaaatttttgtccattggggtgaattccaatgttttcttcgagggggaaaaaaacaaaaaacaaacaaaaaaaaccctttacatccctgtcagcgctttttggaatgggcgggattcaactaccaaagggacaagccgccgtgcagccctccaggagcaacgactagcgtgagatagagaggccgggagcgaacttcagGAGAAGCCGGAAGTGGCGTAACGTCCGGTCAAGGCAGCCATCTCGCCGTGAGACAGCAAGTGTCGGATCCGCAGGCGCAGCCGTGCGATGTTGTCCTCTACAGCCATGTATTCGGCT（G/C）CTGGCAGAGACTTGGGGATGGAACCGCACAGAGCCGCGGGCCCTTTGCAGCTGCGATTTTCGCCCTACGTTTTCAACGGAGGgtaaaaaccccagagagctgcggctttcactttcgcccttcccccatctgctgaagcctatttaggagtcaccgccgtgatggcgctgccccgggctcctgcaggcctcagaaccctgagctgagggggtccgcacaaggccggtctccctgccgtcctctcatgccctgtgtttccctcttcaggctcgctttgctcaagtttacttggtgattgcgatacagccttggtttttagggttt（SEQ IDNO.1所示）。其中，序列中的“（G/C）”即为SNP位点。

5、SNP基因分型和关联分析

用直接单向测序法进行SNP基因分型。即在强直性脊柱炎病人和正常对照组中进行分型和关联分析。

对基因分型结果进行描述性统计分析，列联表进行卡方检验。观察基因型在病人和对照之间是否具有差异，其分析结果如下：

根据病例-对照关联分析的研究方法对基因分型的结果进行了卡方计算，结果发现位于第一外显子的多态性位点rs12717的基因型CC具有显著的统计学差异。其中，在病例样本中，rs12717的分布为（基因型GG362例、基因型GC189例、基因型CC30例）；而在对照样本中为（基因型GG405例、基因型GC190例、基因型CC17例），两者具有显著性差异。

基因型CC在病例中比在对照中要多，卡方检验P=0.039。基因型CC的个体罹患强直性脊柱炎的风险要比其它两种基因型（GG+GC）的个体高1.83倍（95%CI:1.02-3.28）。

以上结果表明：基因型CC增加了强直性脊柱炎的易感性，PSMB1基因多态性位点rs12717的基因型CC与强直性脊柱炎的发病显著相关。即：SEQ ID NO.1中第618位的SNP位点与强直性脊柱炎的发生存在着相关性。

实施例2强直性脊柱炎易感性检测试剂盒

如实施例1所述，SEQ ID NO.1中第618位的G/C多态（SNP位点）与强直性脊柱炎疾病密切相关。因此，可基于这个SNP位点，设计PSMB1基因特异性引物，再以病人的DNA为模板进行扩增进行检测。

制备一试剂盒（100人次），其含有：

1）有义引物P1（SEQ ID NO.2所示），浓度100pmol；

2）反义引物P2（SEQ ID NO.3所示），浓度100pmol；以及

3）含Taq酶、dNTP、镁离子、PCR反应缓冲液的PCR反应液。

随机挑选100个人构成的测试组，其中，包括：未知是否患强直性脊柱炎的对象、已知患强直性脊柱炎病人和经检测无强直性脊柱炎的正常人。

抽取测试组中待检测对象的外周血3ml，使用常规方法（或使用特定的商业化试剂盒）从血液中提取DNA。将强直性脊柱炎检测试剂盒中的PCR引物稀释到10μmol/l，以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后，用ABI3730DNA测序仪进行测序，用Polyphred软件进行序列的判读和SNP确认。

或者，将扩增产物与正常对照用变性高效液相色谱仪（DHPLC）进行色谱分析，也可检测出SEQ ID NO.1中第618位的基因型CC。

检测结果：对于PSMB1基因存在第618位的基因型CC的对象，进一步通过常规方法检测以确认是否患有强直性脊柱炎情况。检测结果表明，含第618位的基因型CC的检测对象的强直性脊柱炎易感性比例明显高于该位点为GG的检测对象。

因此，这表明通过检测PSMB1基因的SEQ ID NO.1中第618位的基因型CC，可进行强直性脊柱炎的辅助性检测。

实施例3强直性脊柱炎易感性辅助性检测

重复实施例2的检测，不同点在于随机选取了70个人（检测前不知道是否有强直性脊柱炎症状）进行检测。

制备一试剂盒（100人次），其含有：

1）有义引物P1（SEQ ID NO.2所示），浓度100pmol；

2）反义引物P2（SEQ ID NO.3所示），浓度100pmol；以及

3）含Taq酶、dNTP、镁离子、PCR反应缓冲液的PCR反应液。

抽取待检测对象的外周血3ml，使用常规方法（或使用特定的商业化试剂盒）从血液中提取DNA。将强直性脊柱炎检测试剂盒中的PCR引物稀释到10μmol/l，以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后，用ABI3730DNA测序仪进行测序，用Polyphred软件进行序列的判读和SNP确认。

结果同样证实了，含SEQ ID NO.1中第618位的基因型CC的检测对象的强直性脊柱炎比例明显高于该位点为GG的检测对象。

Claims (5)

1.一种利用基因型检测强直性脊柱炎的试剂盒，其特征在于，包括：特异性扩增PSMB1基因或转录本的引物，所述的引物扩增出长度为100-2000bp且含有SEQ ID NO.1中第618位的扩增产物。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有选自下组的试剂：

1）与SEQ ID NO.1中第618位的G/C多态相结合的探针；

2）识别SEQ ID NO.1中第618位的G/C多态的限制性内切酶。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述第618位的G/C多态是G/C多态中的基因型CC。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述引物的序列如SEQ ID NO.2和3所示。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述扩增产物的长度为100-2000bp且含有SEQ ID NO.1中第618位。