CN104411713A

CN104411713A - Par4激动剂肽

Info

Publication number: CN104411713A
Application number: CN201380034451.0A
Authority: CN
Inventors: M.G.科纳克; C.马佩利; D.J.里克兴格尔
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2012-04-26
Filing date: 2013-04-24
Publication date: 2015-03-11
Also published as: WO2013163248A1; US20160304560A1; US20150158910A1; US20130289238A1; EA201491959A1; US9605024B2; JP2015516983A; EP2841448A1; US9303065B2; MX2014012803A; US8927688B2; BR112014026644A2; CA2871640A1

Abstract

本发明提供PAR4激动剂肽。这些肽可用于开发稳健的PAR4受体测定法。

Description

PAR4激动剂肽

发明领域

本发明提供与PAR4受体结合并且具有激动剂或部分激动剂活性的新的肽。肽可用于开发稳健的PAR4受体测定法。

发明背景

血栓栓塞性疾病在发达国家仍然为死亡的主导起因，尽管可利用抗凝血剂例如华法林(COUMADIN®)、肝素、低分子量肝素(LMWH)、合成的五糖和抗血小板药物例如阿司匹林和氯吡格雷(PLAVIX®)。

当前的抗血小板疗法具有限制，包括提高的出血风险以及部分效力(相对心血管风险降低20-30%范围)。因此，发现和开发安全和有效的口服或肠胃外抗血栓药用于预防和治疗宽范围的血栓栓塞性疾病仍然为重要的目标。

α-凝血酶为血小板聚集和脱粒的最有效的已知活化剂。血小板的活化在起因上涉及动脉粥样血栓形成脉管闭塞。通过裂解称为蛋白酶激活的受体(PARs)的G-蛋白偶联受体，凝血酶激活血小板。PARs提供它们自己的存在于N-末端细胞外域的隐蔽配体，该细胞外域通过蛋白水解裂解暴露，随后与受体分子内结合以诱导发信号(束缚配体机理；Coughlin，S. R.，Nature，407:258-264 (2000))。当蛋白水解激活后，模拟新形成的N-末端的序列的合成肽可独立于受体裂解诱导发信号。血小板在动脉粥样血栓形成事件中为关键的参与者。人血小板表达至少两种凝血酶受体，通常称为PAR1和PAR4。已充分研究PAR1的抑制剂，并且若干化合物(包括vorapaxar和atopaxar)已进入至晚期临床试验。近来，在ACS患者的TRACER III期试验中，vorapaxar不显著降低心血管事件，但是显著提高大出血的风险(Tricoci，P.等人，N. Eng. J. Med.，366(1):20-33 (2012)。因此，仍需要发现具有提高的效力和降低的出血副作用的新的抗血小板药物。

存在一些PAR4抑制剂的临床前研究的早期报道。Lee，F-Y.等人，"Synthesis of 1-Benzyl-3-(5′-hydroxymethyl-2′-furyl)indazole Analogues as Novel Antiplatelet Agents (1-苄基-3-(5′-羟基甲基-2′-呋喃基)吲唑类似物作为新的抗血小板药物的合成)"，J. Med. Chem.，44(22):3746-3749 (2001)在摘要中公开了化合物

"发现为选择性和有效的抑制剂或蛋白酶-激活的受体类型4 (PAR4)-依赖性血小板激活。"

化合物58在Wu，C-C.等人，" Selective Inhibition of Protease-activated Receptor 4-dependent Platelet Activation by YD-3(通过YD-3蛋白酶-激活的受体4-依赖性血小板激活的选择性抑制)"，Thromb. Haemost.，87:1026-1033 (2002)中也称为YD-3。还参见Chen，H.S.等人，"Synthesis and platelet activity(合成和血小板活性)"，J. Bioorg. Med. Chem.，16:1262-1278 (2008)。

EP 1166785 A1和EP 0667345公开了可用作血小板聚集的抑制剂的各种吡唑衍生物。

发明概述

本发明的一些实施方案涉及肽，此类肽作为受体的激动剂或部分激动剂调节PAR4受体。相对于本领域已知的天然的PAR4激动剂序列，这些肽呈现提高的生物活性，因此使得它们成为PAR4受体测定法开发的理想候选。

在一些实施方案中，PAR4激动剂肽为包含式I的氨基酸序列的分离的肽：

Ala-Xaa₁-Pro-Gly-Xaa₂-Leu-Val (式I)

其中，

所述肽的氨基末端为游离的；

X_aa1选自Tyr和Phe(4-F)；

X_aa2选自Trp(5-OH)、(D,L)-Trp(5-Br)、D-Trp、Bzt、Tpi、His、Tza、3-Thi、3-Fur、His(Bzl)、Phe、Tyr、Phe(五-F)、2-Pya、3-Pya、4-Pya、Dpa、3-Pya(4-甲苯基)、Bip(2-甲基)、1-萘基-Ala、2-萘基-Ala、Tyr(Bzl)和苯乙烯基-Ala；和

C-末端被酰胺化。

在一些实施方案中，PAR4激动剂肽包含选自以下的肽：SEQ ID NO：1-8，12-16和18-34。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽包含选自以下的肽：SEQ ID NO：2-7，12，13，15，18-24和26-34。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽包含SEQ ID NO：3的肽。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：18的氨基酸序列组成。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：19的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：21的氨基酸序列组成。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：22的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：24的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：26的氨基酸序列组成。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：27的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：28的氨基酸序列组成。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：29的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：30的氨基酸序列组成。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：31的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：33的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：34的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，PAR4激动剂肽包含式I的氨基酸序列并且在Val之后还包含Lys。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽包含式I的氨基酸序列并且在Val之后还包含Lys-Asn。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽包含式I的氨基酸序列并且在Val之后还包含Lys-Asn-Gly。

在其它实施方案中，PAR4激动剂肽在Val之后还包含Lys，如以下式II所示：

Ala-Xaa₁-Pro-Gly-Xaa₂-Leu-Val-Lys (式II)

其中，

所述肽的氨基末端为游离的；

X_aa1选自Tyr和Phe(4-F)；

C-末端被酰胺化。

在其它实施方案中，PAR4激动剂肽在Val之后还包含Lys-Asn，如以下式III所示：

Ala-Xaa₁-Pro-Gly-Xaa₂-Leu-Val-Lys-Asn(式III)

其中，

所述肽的氨基末端为游离的；

X_aa1选自Tyr和Phe(4-F)；

C-末端被酰胺化。

在其它实施方案中，PAR4激动剂肽在Val之后还包含Lys-Asn-Gly，如以下式IV所示：

Ala-Xaa₁-Pro-Gly-Xaa₂-Leu-Val-Lys-Asn-Gly(式IV)

其中，

所述肽的氨基末端为游离的；

X_aa1选自Tyr和Phe(4-F)；

C-末端被酰胺化。

本发明的一些实施方案涉及一种肽，所述肽包含式I的氨基酸序列，

Ala-Xaa₁-Pro-Gly-Xaa₂-Leu-Val (式I)

其中，

所述肽的氨基末端不与氨基酸稠合；

X_aa1选自Tyr和Phe(4-F)；

所述肽具有PAR4激动剂活性。在一些实施方案中，X_aa1为Phe(4-F)。在其它实施方案中，X_aa2为Trp。在一些实施方案中，肽基本上由或由氨基酸序列组成。在其它实施方案中，肽的C-末端被酰胺化。在一些实施方案中，氨基酸序列在Val之后还包含Lys。在其它实施方案中，氨基酸序列在Val之后还包含Lys-Asn。在其它实施方案中，氨基酸序列在Val之后还包含Lys-Asn-Gly。在一些实施方案中，肽激活PAR4受体。在其它实施方案中，PAR4受体激活通过血小板聚集测定法、FLIPR测定法或二者测量。在一些实施方案中，PAR4受体激活高于通过由SEQ ID NO：1组成的肽的PAR4受体激活。例如，PAR4受体激活可比通过由SEQ ID NO：1组成的肽的PAR4受体激活高至少约10倍，至少约20倍，至少约30倍，至少约40倍，至少约50倍，至少约60倍，至少约70倍，至少约80倍，至少约90倍，至少约100倍，或者至少约110倍。

已发现本发明的咪唑并噻二唑和咪唑并哒嗪化合物为在α-凝血酶诱导的血小板聚集测定中抑制血小板聚集的PAR4拮抗剂。

因此，本发明提供新的咪唑并噻二唑类似物和咪唑并哒嗪类似物，其为PAR4拮抗剂并且可用作血小板聚集的选择性抑制剂，包括其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、溶剂合物或前药酯。

本发明还提供用于制备本发明的化合物或其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、溶剂合物或前药酯的方法和中间体。

本发明还提供药用组合物，所述组合物包含药学上可接受的载体和至少一种本发明的化合物或其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、溶剂合物或前药酯。

本发明还提供一种用于治疗或预防血栓栓塞性疾病的方法，所述方法包括给予需要这种治疗或预防的患者治疗有效量的至少一种本发明的化合物或其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、溶剂合物或前药酯。

本发明还提供用于治疗的本发明的化合物或其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、溶剂合物或前药酯。

本发明还提供本发明的化合物或其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、溶剂合物或前药酯在制备药物中的用途，该药物用于治疗或预防血栓栓塞性疾病。

根据以下详细描述和权利要求书，本发明的其它特征和优点将是显而易见的。

附图简述

图1A为显示实施例3化合物在抑制人洗涤的血小板的聚集的有效性的图，该血小板通过1.5 nM α-凝血酶刺激；和

图1B为显示实施例3化合物在抑制α-凝血酶-诱导的血小板聚集的IC₅₀的图。

发明详述

PAR4激动剂肽

本发明的一个实施方案提供相对于已知的PAR4激动剂肽AYPGKF (SEQ ID NO：1)，效力具有提高的PAR4激动剂肽。参见Faruqi，T.R.等人，J. Biol. Chem.，275(26):19728-19734 (2000)。在本发明的一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：1，PAR4激动剂肽效力具有高达20倍提高。在其它实施方案中，相对于SEQ ID NO：1，PAR4肽效力具有高达60倍提高。在其它实施方案中，相对于SEQ ID NO：1，PAR4肽效力具有高达100倍提高。作为提高的效力的结果，本发明的PAR4激动剂肽可用于开发具有提高的灵敏度和特异性的稳健的PAR4受体测定法。

除非在具体的情况下另外限定，否则本文提供的定义适用于但不限于在整个说明书中使用的术语。

本文使用的术语"PAR4激动剂肽"指可完全或部分激活PAR4受体和引出发信号事件和或与PAR4受体激活相关的功能响应的肽。示例性PAR4激动剂肽为SEQ ID NO：1-8，12-16和18-34，如表1所示，其中序列的N-末端为游离的，而序列的C-末端被酰胺化。在表1中，在表顶部的数字1-10反映在肽内氨基酸的位置，其中位置1在N-末端开始。

表1

SEQ ID NO.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

A

Y

P

G

K

F

2

A

Y

P

G

W

L

V

K

N

G

3

A

Phe(4-F)

P

G

W

L

V

K

N

G

4

A

Phe(4-F)

P

G

W

L

V

K

N

5

A

Phe(4-F)

P

G

W

L

V

K

6

A

Phe(4-F)

P

G

W

L

V

7

A

Phe(4-F)

P

G

W

L

8

A

Phe(4-F)

P

G

W

9

A

Phe(4-F)

P

G

10

A

Y

P

G

11

A

Y

P

G

Q

V

C

A

N

D

12

A

Phe(4-F)

P

G

Trp(5-OH)

L

V

13

A

Phe(4-F)

P

G

(D,L)-Trp(5-Br)

L

V

14

A

Phe(4-F)

P

G

D-Trp

L

V

15

A

Phe(4-F)

P

G

Bzt

L

V

16

A

Phe(4-F)

P

G

Tpi

L

V

17

A

Phe(4-F)

P

G

H

L

V

18

A

Phe(4-F)

P

G

Tza

L

V

19

A

Phe(4-F)

P

G

3-Thi

L

V

20

A

Phe(4-F)

P

G

3-Fur

L

V

21

A

Phe(4-F)

P

G

His(Bzl)

L

V

22

A

Phe(4-F)

P

G

F

L

V

23

A

Phe(4-F)

P

G

Y

L

V

24

A

Phe(4-F)

P

G

Phe(五-F)

L

V

25

A

Phe(4-F)

P

G

2-Pya

L

V

26

A

Phe(4-F)

P

G

3-Pya

L

V

27

A

Phe(4-F)

P

G

4-Pya

L

V

28

A

Phe(4-F)

P

G

Dpa

L

V

29

A

Phe(4-F)

P

G

3-Pya(4-甲苯基)

L

V

30

A

Phe(4-F)

P

G

Bip(2-甲基)

L

V

31

A

Phe(4-F)

P

G

1-萘基-Ala

L

V

32

A

Phe(4-F)

P

G

2-萘基-Ala

L

V

33

A

Phe(4-F)

P

G

Tyr(Bzl)

L

V

34

A

Phe(4-F)

P

G

苯乙烯基-Ala

L

V

在一些实施方案中，PAR4激动剂肽的ED50 < 100 µM。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽的ED50 < 10 µM。用于测量PAR4激动剂活性的示例性测定法包括但不限于在实施例G中描述的血小板聚集测定法和在实施例H中描述的FLIPR测定法。

在一些实施方案中，肽为包含式I的氨基酸序列的分离的肽：

Ala-Xaa₁-Pro-Gly-Xaa₂-Leu-Val (式I)

其中，

所述肽的氨基末端为游离的；

X_aa1选自Tyr和Phe(4-F)；

C-末端被酰胺化。

术语"游离的"为本领域技术人员公知的术语。例如，术语"游离的"可用于指肽的氨基末端不封端或修饰。术语"游离的"也可用于指所述肽的氨基末端不与氨基酸稠合。在一些实施方案中，肽的氨基末端不与任何氨基酸稠合，但是与一个或多个非氨基酸部分稠合。

在式(I)、(II)、(iii)或(IV)中和在本文的氨基酸序列中使用的连字符(-)表示肽键。

在一些实施方案中，PAR4激动剂肽包含选自以下的肽：SEQ ID NO：1-8，12-16和18-34。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽包含选自以下的肽：SEQ ID NO：2-7，12，13，15，18-24和26-34。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽包含SEQ ID NO：3的肽。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：18的氨基酸序列组成。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：19的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：21的氨基酸序列组成。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：22的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：24的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：26的氨基酸序列组成。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：27的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：28的氨基酸序列组成。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：29的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：30的氨基酸序列组成。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：31的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：32的氨基酸序列组成。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：33的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽基本上由或由SEQ ID NO：34的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，PAR4激动剂肽包含式I的氨基酸序列并且在Val之后还包含Lys。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽包含式I的氨基酸序列并且在Val之后还包含Lys-Asn。在其它实施方案中，PAR4激动剂肽包含式I的氨基酸序列并且在Val之后还包含Lys-Asn-Gly。

Ala-Xaa₁-Pro-Gly-Xaa₂-Leu-Val-Lys (式II)

其中，

所述肽的氨基末端为游离的；

X_aa1选自Tyr和Phe(4-F)；

C-末端被酰胺化。

Ala-Xaa₁-Pro-Gly-Xaa₂-Leu-Val-Lys-Asn(式III)

其中，

所述肽的氨基末端为游离的；

X_aa1选自Tyr和Phe(4-F)；

C-末端被酰胺化。

Ala-Xaa₁-Pro-Gly-Xaa₂-Leu-Val-Lys-Asn-Gly(式IV)

其中，

所述肽的氨基末端为游离的；

X_aa1选自Tyr和Phe(4-F)；

C-末端被酰胺化。

Ala-Xaa₁-Pro-Gly-Xaa₂-Leu-Val (式I)

其中，

所述肽的氨基末端不与氨基酸稠合；

X_aa1选自Tyr和Phe(4-F)；

氨基酸包括以下通用结构表示的化合物：

其中R和R′如本文讨论的。除非另外指示，否则本文使用的术语"氨基酸"，单独地或作为另一个基团的一部分，包括但不限于与相同的碳(称为"α"碳)连接的氨基和羧基，其中R和/或R′可为天然或非天然侧链，包括氢。在"α"碳处的绝对"S"构型通常称为"L"或"天然"构型，L-半胱氨酸例外，其具有绝对"R"构型。在其中"R"和"R′"(原始)取代基二者等于氢的情况下，氨基酸为甘氨酸并且不是手性的。除非另外说明，否则本文记载的氨基酸为"L"构型。

氨基酸在本文中可通过它们的通常已知的三-字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单一字母符号提及。本发明的PAR4激动剂肽可包括天然编码的氨基酸(常见的氨基酸)以及非天然编码的氨基酸。"非天然编码的氨基酸"指不是20种常见的氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸中之一的氨基酸。可与术语"非天然编码的氨基酸"同义使用的其它术语为"非天然氨基酸"、"非天然氨基酸"、"非天然存在的氨基酸"及其各种连字符和非连字符形式。以下显示可存在于PAR4激动剂肽中的示例性非天然编码的氨基酸。

本文公开的PAR4激动剂肽显示对PAR-4受体提高的亲和力，并且可用作激动剂，在PAR4受体测定法中激活PAR-4受体。

本文描述的肽可使用各种固相技术通过化学合成来产生，例如在以下文献描述的那些：Barany，G.等人，The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology (肽：分析、合成、生物学)，第2卷：" Special Methods in Peptide Synthesis, Part A (在肽合成中的专用方法，部分A)"，第3-284页，Gross，E.等人编辑，Academic Press，New York出版(1980)；和Stewart，J.M.等人，Solid-Phase Peptide Synthesis (固相肽合成)，第2版，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL出版(1984)。期望的策略基于Fmoc (9-芴基甲基甲基-氧基羰基)基团用于临时保护α-氨基，与叔丁基组合用于临时保护氨基酸侧链(参见例如Atherton，E.等人，" The Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Protecting Group (芴基甲氧基羰基氨基保护基团)"，在The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology (肽：分析、合成、生物学)，第9卷：" Special Methods in Peptide Synthesis, Part C (在肽合成中的专用方法，部分C)"，第1-38页，Undenfriend，S.等人编辑，Academic Press，圣地亚哥出版(1987)。

肽可采用分步方式在不溶性聚合物载体(也称为"树脂")上由肽的C-末端起始来合成。通过形成酰胺或酯键，通过使肽的C-末端氨基酸悬挂于树脂，开始合成。这允许分别作为C-末端酰胺或羧酸，最终释放所得到的肽。或者，在其中存在C-末端氨基醇的情况下，C-末端残基可与2-甲氧基-4-烷氧基苄醇树脂连接(Sasrin，Bachem Bioscience，Inc.，King of Prussia，PA)，如本文描述的，在完成肽序列装配后，所得到的肽醇在THF中被LiBH₄释放 (参见Stewart，J.M.等人，如上，第92页)。

用于合成的C-末端氨基酸和所有其它氨基酸需要使它们α-氨基和侧链官能团(如果存在)被不同的保护，使得在合成期间，可选择性除去α-氨基保护基团。通过其羧基活化为活性酯，以及与悬挂于树脂的N-末端氨基酸的未封端的α-氨基反应，进行氨基酸的偶联。重复α-氨基脱保护和偶联的顺序，直至装配整个肽序列。肽随后从树脂释放，伴随侧链官能团的脱保护，通常在适当的清除剂存在下，以限制副反应。所得到的肽最终通过反相HPLC纯化。

作为最终的肽的前体所需的肽基-树脂的合成利用市售可得的交联的聚苯乙烯聚合物树脂(Novabiochem，San Diego，CA；Applied Biosystems，Foster City，CA)。对于C-末端甲酰胺，优选的固体载体为：4-(2′,4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基乙酰基-对-甲基二苯甲基胺树脂(Rink酰胺MBHA树脂)；9-Fmoc-氨基-氧杂蒽-3-基氧基-Merrifield树脂(Sieber酰胺树脂)；4-(9-Fmoc)氨基甲基-3,5-二甲氧基苯氧基)戊酰基-氨基甲基-Merrifield树脂(PAL树脂)。第一和随后氨基酸的偶联可使用分别由DIC/HOBT、HBTU/HOBT、BOP、PyBOP或者由DIC/HOAT、HATU/HOAT生产的HOBT或HOAT活性酯完成。对于保护的肽片段，优选的固体载体为：2-氯三苯甲基氯树脂和9-Fmoc-氨基-氧杂蒽-3-基氧基-Merrifield树脂(Sieber酰胺树脂)。在2-氯三苯甲基氯树脂上第一氨基酸的装载最好通过Fmoc-保护的氨基酸与树脂在二氯甲烷和DIEA中反应而实现。如果需要，可加入少量的DMF，以促进氨基酸的溶解。

本文描述的PAR4激动剂肽的合成可通过使用肽合成仪进行，例如Advanced ChemTech多肽合成仪(MPS396Ω)或Advanced ChemTech 90型合成仪或Applied Biosystems Inc.肽合成仪(ABI 433A)。MPS396Ω合成仪用于同时制备高达96种肽。Advanced ChemTech 90型合成仪用于以大规模(高达5 mmol树脂)制备常见的肽序列。ABI 433A合成仪用于在高达0.25 mmol的规模制备单个肽。在所有情况下，利用本文描述的Fmoc/叔丁基保护策略，进行分步固相肽合成。以下显示可用于固相合成的示例性垂直保护的氨基酸。

可使用任何标准程序(参见，例如，King，D.S.等人，Int. J. Peptide Protein Res.，36:255-266 (1990))，将用于它们的相应的肽的肽基-树脂前体解离和脱保护。期望的方法为在水和TIS作为清除剂存在下使用TFA。通常，在室温下，将肽基-树脂在TFA/水/TIS (94:3:3，v:v:v；1 mL/100 mg肽基树脂)中搅拌2-6小时。随后将用过的树脂滤除，将TFA溶液减压浓缩或干燥。将所得到的粗品肽沉淀和用Et₂O洗涤或直接再溶解于DMSO或50%含水乙酸中，用于通过制备HPLC纯化。通过使用制备HPLC(例如，在Waters 4000型或Shimadzu LC-8A型液相色谱仪)纯化，可得到具有期望的纯度的肽。将粗品肽的溶液注入YMC S5 ODS (20×100 mm)柱，用MeCN在水中的线性梯度洗脱，均用0.1% TFA缓冲，使用14-20 mL/分钟的流速，通过在220 nm下的UV吸光度，监测洗脱液。纯化的肽的结构可通过电喷雾MS分析证实。

在实施例和本文的其它地方采用以下缩写：

Ph=苯基

Bz或Bnz=苄基

i-Bu=异丁基

i-Pr=异丙基

Me=甲基

Et=乙基

Pr=正丙基

Bu=正丁基

t-Bu=叔丁基

Trt=三苯甲基

TMS=三甲基甲硅烷基

TIS=三异丙基硅烷

Et₂O=乙醚

HOAc或AcOH=乙酸

AcCN或CH₃CN=乙腈

DMF=N,N-二甲基甲酰胺

EtOAc=乙酸乙酯

TFA=三氟乙酸

NMM=N-甲基吗啉

NMP=N-甲基吡咯烷酮

DCM=二氯甲烷

TEA=三乙胺

min=分钟

h或hr=小时

L=升

mL或ml=毫升

µL=微升

g=克

mg=毫克

mol=摩尔

mmol=毫摩尔

meq=毫当量

rt或RT=室温

aq.=含水

BOP试剂=苯并三唑-1-基氧基-三-二甲基氨基-磷六氟磷酸盐(Castro试剂)

PyBOP试剂=苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷子基磷六氟磷酸盐

HBTU=2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐

HATU=O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐

HCTU=2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐

DIEA=二异丙基乙基胺

Fmoc或FMOC=芴基甲氧基羰基

Boc或BOC=叔丁氧基羰基

HOBT或HOBT●H₂O=1-羟基苯并三唑水合物

Cl-HOBt=6-氯-苯并三唑

HOAT=1-羟基-7-氮杂苯并三唑

HPLC=高效液相色谱法

LC/MS=高效液相色谱法/质谱法

NMR=核磁共振

PAR4拮抗剂

本发明的咪唑并噻二唑和咪唑并哒嗪化合物

在第一方面，本发明提供具有以下结构的式I的咪唑并噻二唑或咪唑并哒嗪化合物：

或其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、溶剂合物或前药酯，其中：

R⁰为R¹或R^1a；

Y为S或-CR⁸=CR⁹-，使得为8元或9元双环杂芳基环，其在每一个环中含有一个氮和一个桥头氮，即或；

R¹选自：

卤素，例如F、Cl、Br或I，

C₁-C₄烷基，例如甲基、乙基、正丙基或异丙基，

C₁-C₄烷氧基，例如，CH₃O，

含有1-5个卤素的卤基-C₁-C₂-烷基，其中卤基为例如F或Cl，包括，例如，CF₃、CF₃CF₂、-CF₂CH₃、、F₂C(Cl)-和CHFCH₃，和

C₁-C₄烷硫基，例如CH₃S；

R^1a选自：

H，

卤基，例如F、Cl、Br或I，

C₁-C₄烷基，例如CH₃、C₂H₅、n-C₃H₇或i-C₃H₇，

C₁-C₄烷氧基，例如CH₃O，

含有1-5个卤素的卤基-C₁-C₂-烷基，其中卤基为例如F或Cl，例如CF₃、CF₃CF₂、-CF₂CH₃、、F₂C(Cl)、CHF₂和CHFCH₃，和

C₁-C₄烷硫基，例如CH₃S；

R⁸和R⁹独立地选自：

H，

C₁-C₄烷基，例如CH₃，

卤基，例如Cl或F，

C₁-C₄烷氧基，例如CH₃O，

CF₃，

CF₃O，

CHF₂，和

OH；

条件是R^1a、R⁸和R⁹中至少一个不为H；

R²选自：

H，

卤基，例如F或Cl，

C₁-C₄烷基，

C₁-C₄烷氧基，例如甲氧基，和

氰基；

X¹为CH、N或CR¹⁰；

X²、X³和X⁴独立地选自CR³或N；

R³为H、C₁-C₄烷氧基例如CH₃O、C₁-C₄烷硫基例如CH₃S、卤基例如F或Cl、CF₃O、CHF₂O，或者含有1-5个卤素的卤基-C₁-C₂-烷基，例如CF₃或CHF₂；

R⁴和R⁵独立地选自H和C₁-C₄烷基，例如甲基，或者可与它们连接的碳共同形成C₃-C₇环烷基环，例如环丙基；

为含有至少一个O、N或S原子的5元杂芳基环，例如一个或两个N原子和一个S原子，或者两个或三个N原子；

R⁶选自H、卤基例如F、Cl、Br或I、OCF₃、CF₃、CHF₂、OCHF₂、OH、CN、NO₂、NR¹¹R¹²、COOH、C₁-C₄烷氧基羰基、(C=O)NR¹¹R¹²、C₁-C₄烷基磺酰基、S(=O)₂NR¹¹R¹²、被0-3个独立地选自以下的基团取代的C₁-C₄烷基：卤基例如F、Br、Cl或I、CF₃、OCF₃、OH、羟基-C₁-C₄-烷基、C₁-C₄烷氧基、(二-C₁-C₄-烷氧基-C₁-C₄-烷基)-C₁-C₄-烷基、C₁-C₄烷硫基和二-C₁-C₄-烷基氨基苯基-C₁-C₄-烷基；或者

R⁶为A-D-，其中：

D为连接基，其选自：

单键，

-O-，

-S-，

，

C₁-C₄亚烷基，例如-CH₂-，

C₁-C₄亚烷基氧基，例如-CH₂O-，

C₁-C₄亚烷基硫基，例如-CH₂S-，

C₁-C₄亚烷基氧基-C₁-C₄-亚烷基，例如-CH₂OCH₂-，

C₁-C₄-亚烷基硫基-C₁-C₄-亚烷基，例如-CH₂SCH₂-，

-S-C₁-C₄-亚烷基，例如-S-CH₂-，或者

-O-C₁-C₄-亚烷基，例如-O-CH₂-；和

A选自：

被0-3个独立地选自以下的基团取代的C₆-C₁₀芳基(即，苯基或萘基)：卤基例如F或Cl、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷基、环丙基、CF₃、OCF₃或CF₂CH₃，

被0-3个独立地选自以下的基团取代的5元至10元杂芳基：卤基例如F、Br、Cl或I、CF₃、OCF₃、5元或6元杂芳基、OH、羟基-C₁-C₄-烷基或C₁-C₄烷基，

被0-3个独立地选自以下的基团取代的4元至10元杂环基：卤基例如F、Br、Cl或I、CF₃、OCF₃、5元或6元杂芳基、OH、羟基-C₁-C₄-烷基、C₆-C₁₀芳基或C₁-C₄烷基，或者

被0-3个独立地选自以下的基团取代的C₃-C₆环烷基：卤基例如F、Br、Cl或I、CF₃、OCF₃、5元或6元杂芳基、OH、羟基-C₁-C₄-烷基、C₆-C₁₀芳基或C₁-C₄烷基；

R¹¹和R¹²每次出现时独立地选自：

H，

C₁-C₄烷基，例如CH₃，

被0-3个独立地选自以下的基团取代的-(CH₂)_n ¹-苯基：卤基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷基、环丙基、CF₃、OCF₃、OCHF₂和氰基，

被0-3个独立地选自以下的基团取代的-(CH₂)_n ¹-C₃-C₆-环烷基：卤基例如F、Br、Cl或I、CF₃、OCF₃、5元或6元杂芳基、OH、羟基-C₁-C₄-烷基或C₁-C₄烷基，

被0-3个独立地选自以下的基团取代的-(CH₂)_n ¹-4元至10元-杂环基：卤基例如F、Br、Cl或I、CF₃、OCF₃、5元或6元杂芳基、OH、羟基-C₁-C₄-烷基或C₁-C₄烷基，

被0-3个独立地选自以下的基团取代的-(CH₂)_n ¹-5元至10元-杂芳基：卤基例如F、Br、Cl或I、CF₃、OCF₃、5元或6元杂芳基、OH、羟基-C₁-C₄-烷基或C₁-C₄烷基，

二-C₁-C₄-烷基氨基-C₁-C₄-烷基，

C₁-C₄-烷基羰基氨基-C₁-C₄-烷基，

二-C₁-C₄-烷氧基-C₁-C₄-烷基，

二-C₁-C₄-烷基氨基苯基，

氰基-C₁-C₄-烷基，

C₁-C₄-烷氧基-C₁-C₄-烷基，

或者，R¹¹和R¹²，当与相同的氮连接时，组合以形成含有碳原子和0-2个选自N、NR¹³、O和S(O)_p的另外的杂原子的4元至6元杂环状环；

R¹³每次出现时独立地选自H、C₁-C₄烷基和-(CH₂)苯基；

R⁷选自H、卤基例如F或Cl和C₁-C₄烷基例如CH₃；

R¹⁰选自C₁-C₄烷基例如CH₃、卤基(其为F、Cl、Br或I)、C₁-C₄烷氧基例如CH₃O和可含有1-5个卤素的卤基-C₁-C₂-烷基(其中卤基为F或Cl)；

n每次出现时选自0、1、2和3；

n¹选自0、1、2、3、4或5；和

p每次出现时选自0、1和2。

因此，R⁶可为：

被0-3个独立地选自以下的基团取代的C₃-C₆环烷基：卤基例如F、Br、Cl或I、CF₃、OCF₃、5元或6元杂芳基、OH、羟基-C₁-C₄-烷基或C₁-C₄烷基；

被0-3个独立地选自以下的基团取代的5元至10元杂芳基：卤基例如F、Br、Cl或I、CF₃、OCF₃、5元或6元杂芳基、OH、羟基-C₁-C₄-烷基或C₁-C₄烷基；

被0-3个独立地选自以下的基团取代的4元至10元杂环基：卤基例如F、Br、Cl或I、CF₃、OCF₃、5元或6元杂芳基、OH、羟基-C₁-C₄-烷基或C₁-C₄烷基；

被0-3个独立地选自以下的基团取代的C₃-C₆环烷基氧基：卤基例如F、Br、Cl或I、CF₃、OCF₃、5元或6元杂芳基、OH、羟基-C₁-C₄-烷基或C₁-C₄烷基；

被0-3个独立地选自以下的基团取代的芳基，例如苯基或萘基：卤基例如F或Cl、含有1-5个卤素例如F的卤基-C₁-C₂-烷基例如CF₃和-CF₂CH₃、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷基、环丙基和OCF₃；

芳氧基，例如苯氧基，其中芳基被0-3个独立地选自以下的基团取代：卤基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷基、环丙基、CF₃、OCF₃、OCHF₂和氰基；

芳硫基，例如苯硫基，其中芳基被0-3个独立地选自以下的基团取代：卤基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷基、环丙基、CF₃、OCF₃、OCHF₂和氰基；

芳基-C₁-C₄-烷氧基，例如苯基烷氧基，其中芳基被0-3个独立地选自以下的基团取代：卤基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷基、环丙基、CF₃、OCF₃、OCHF₂和氰基；

5元至10元杂芳基-C₁-C₄-烷基，其中杂芳基被0-3个独立地选自以下的基团取代：卤基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷基、环丙基、CF₃、OCF₃、OCHF₂和氰基；

5元至10元杂芳基-C₁-C₄-烷氧基，其中杂芳基被0-3个独立地选自以下的基团取代：卤基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷基、环丙基、CF₃、OCF₃、OCHF₂和氰基；

芳基-C₁-C₄-烷基，例如苯基烷基，其中芳基被0-3个独立地选自以下的基团取代：卤基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷基、环丙基、CF₃、OCF₃、OCHF₂和氰基；

二-C₁-C₄-烷基氨基苯基-C₁-C₄-烷基；

OH；

CN；

NO₂；

NR¹¹R¹²；

羧基；

C₁-C₄烷氧基羰基；

C(=O)NR¹¹R¹²；

C₁-C₄烷基磺酰基；和

S(=O)₂NR¹¹R¹²。

在式I的本发明化合物的一些实施方案中：

Y为S或CH=CH；

X¹为CH或N；

X²、X³和X⁴各自独立地为CR³；

R⁰为R¹或R^1a；

R¹和R^1a选自：

C₁-C₄烷基，例如CH₃，

C₁-C₄烷硫基，例如CH₃S，

C₁-C₄烷氧基，例如CH₃O，和

可含有1-5个卤素原子的卤基-C₁-C₂-烷基，例如F和Cl；

R²为H；

R₃选自：

C₁-C₄烷氧基，例如CH₃O，

H，和

卤基，例如F或Cl；

n为1；和

R⁴和R⁵各自为H。

因此，本发明的化合物可具有以下结构：

。

在一些实施方案中，本发明包括具有以下结构的化合物：

。

在一些实施方案中，本发明包括其中R⁶为或R^6a的在式I的范围内的化合物，其具有以下结构：

，

其中：

为：

被0-3个独立地选自以下的基团取代的5元至10元杂芳基：卤基例如F、Br、Cl或I、CF₃、OCF₃、5元或6元杂芳基、OH、羟基-C₁-C₄-烷基例如HOCH₂CH₂-、C₁-C₄烷基例如CH₃、C₁-C₄烷氧基例如CH₃O或二-C₁-C₄-烷基氨基例如(CH₃)₂N，

被0-3个独立地选自以下的基团取代的4元至10元杂环基：卤基例如F、Br、Cl或I、CF₃、OCF₃、5元或6元杂芳基、OH、羟基-C₁-C₄-烷基例如HOCH₂CH₂-、C₁-C₄烷基例如CH₃、C₁-C₄烷氧基例如CH₃O或二-C₁-C₄-烷基氨基例如(CH₃)₂N，

被0-3个独立地选自以下的基团取代的C₃-C₆环烷基：卤基例如F、Br、Cl或I、CF₃、OCF₃、5元或6元杂芳基、OH、羟基-C₁-C₃-烷基、C₁-C₄烷基例如CH₃、C₁-C₄烷氧基例如CH₃O或二-C₁-C₄-烷基氨基例如(CH₃)₂N；和

R^6a为H、卤基、OCF₃OCHF₂、C₁-C₄烷基、被1-5个氟取代的卤基-C₁-C₄-烷基、CF₃、CHF₂、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷硫基、C₃-C₆环烷氧基、OH、CN、NO₂、NR¹¹R¹²、羧基、C₁-C₄烷氧基羰基、C(=O)NR¹¹R¹²、C₁-C₄烷基磺酰基、S(=O)₂NR¹¹R¹²、苯氧基、苯硫基、苯基-C₁-C₄-烷氧基、杂芳基-C₁-C₄-烷氧基、苯基-C₁-C₄-烷基、二-C₁-C₄-烷基氨基苯基-C₁-C₄-烷基、(二-C₁-C₄-烷氧基-C₁-C₄-烷基)C₁-C₄-烷基或C₁-C₄-烷氧基-C₁-C₄-烷氧基-C₁-C₄-烷基；和

R⁷为H、F、Cl或CH₃。

存在于式I的化合物中的5元杂芳基环的实例包括但不限于、、、、和。

存在于式I的化合物中的R⁶基团的实例包括但不限于：

；

取代的苯基，例如、、、

、、、、、

、、或；

杂环基，例如、、或；

取代的杂环基，例如、、

、、或；

环烷基，例如；

杂芳基，例如、或；

取代的杂芳基，例如、或

；

杂芳基-C₁-C₄-烷基，例如；

卤代烷基，例如CF₃，

卤基，例如Br，

C₁-C₄-烷氧基-C₁-C₄-烷氧基-C₁-C₄-烷基，例如CH₃OCH₂CH₂OCH₂-，

C₁-C₄烷基，例如-CH₂CH₃或CH₃，

芳基-C₁-C₄-烷基，例如或，或者

H；

-NR¹¹R¹²，例如、、

R⁷选自H和C₁-C₄烷基，例如CH₃。

适用于式I的化合物的R⁰基团的实例包括但不限于：

H；

C₁-C₄烷基，例如CH₃；

C₁-C₄烷硫基，例如CH₃S；

C₁-C₄烷氧基，例如CH₃O；和

卤基-C₁-C₄-烷基，例如F(CH₃)CH-、F₂(CH₃)C-或CF₃。

适用于式I的化合物的R³基团的实例包括但不限于：

C₁-C₄烷氧基，例如CH₃O；

H；和

卤基，例如Cl。

R²优选为H。

Y优选为S或-CH=CH-。

在一些实施方案中，本发明包括式I的化合物，其中：

Y为S或-CH=CH-；

X¹为CH；

X²为CH；

X³为CR³；

X⁴为CH；

R³为CH₃O、F或Cl；

R²为H；和

R⁴和R⁵各自为H。

在一些实施方案中，本发明包括式I的化合物，其中：

Y为S或-CH=CH-；

X¹为CH；

X²为CH；

X³为CR³；

X⁴为CH；

R⁴和R⁵各自为H；

R⁰为R¹和R^1a；

R¹和R^1a独立地选自CH₃O、CH₃S、CH₃或卤基-C₁-C₂-烷基例如F(CH₃)CH-或F₂(CH₃)C-；

R²为H；和

R³为CH₃O、F或Cl。

在一些实施方案中，本发明包括式I的化合物，其中：

R⁰为R¹和R^1a；

R¹和R^1a独立地选自CH₃O、CH₃S、CH₃或卤基-C₁-C₂-烷基例如F(CH₃)CH-；

R²为H；

R₃为CH₃O、F或Cl；和

其中R^6a如前定义并且可为：

H，

被1-5个氟取代的卤基-C₁-C₄-烷基，例如CF₃或CHF₂，

卤基，例如Br，

OCF₃，

OCHF₂，

杂芳基-C₁-C₃-烷基，例如，

C₃-C₆环烷氧基，

OH，

CN，

NO₂，

S(=O)₂NR¹¹R¹²，

NR¹¹R¹²，

COOH，

C₁-C₄烷氧基羰基，

C(=O)NR¹¹R¹²，

C₁-C₄烷基磺酰基，

二-C₁-C₄-烷基氨基苯基-C₁-C₄-烷基，例如，

(二-C₁-C₄-烷氧基-C₁-C₄-烷基)C₁-C₄-烷基，例如，

C₁-C₄烷基，例如CH₃或C₂H₅，

C₁-C₄烷氧基，例如CH₃O，

芳基-C₁-C₄-烷基，例如或；和

R⁷为H或C₁-C₄烷基，例如CH₃。

在一些实施方案中，本发明包括式I的化合物，其中：

R⁰为R¹或R^1a；

R²为H；

R₃为CH₃O、F或Cl；

取代的苯基，例如、、

杂芳基，例如

杂环基，例如

环烷基，例如；和

R⁷为H或C₁-C₄烷基，例如CH₃。

在一些实施方案中，本发明包括式I的化合物，其中：

Y为S；

X¹为CH；

X²为CH；

X³为CR³；

X⁴为CH；

R²为H；

R⁴和R⁵各自为H；

R⁰为R¹；

R¹为CH₃O或F(CH₃)CH-；

R³为CH₃O；

R⁴和R⁵各自为H；

为；

R⁷为H或CH₃。

在一些实施方案中，本发明包括式I的化合物，其中：

Y为CH=CH；

X¹为CH；

X²为CH；

X³为CR³；

X⁴为CH；

R²为H；

R⁴和R⁵各自为H；

R⁰为R^1a；

R^1a为CH₃；

R³为CH₃O；

CH₂CH₃；和

R⁷为H。

在一些实施方案中，本发明包括式I的化合物，其中：

R⁰为C₁-C₄烷氧基例如CH₃O、C₁-C₄烷基例如甲基、乙基和异丙基或卤基例如Br或Cl；

R²为H；

R³为C₁-C₄烷氧基例如CH₃O或卤基例如F或Cl；

R⁴为H；和

R⁵为H。

在一些实施方案中，本发明包括式I的化合物，其中：

X¹为CH；

R⁰为C₁-C₂烷氧基例如甲氧基或卤基例如F；

为或，其中R¹或R^1a独立地选自C₁-C₄烷基(例如CH₃、C₂H₅或i-C₃H₇)或C₁-C₃烷氧基(例如CH₃O)；

R⁸和R⁹各自为H；和

R²为H。

在一些实施方案中，本发明包括式I的化合物，其中：

X¹为CH或N；

R³为OCH₃或卤基例如F；和

R⁶为

苯基，和

被0-3个选自以下的取代基取代的苯基：1个或2个卤基例如F、含有1-5个卤素的卤基-C₁-C₂烷基例如CF₃、C₁-C₃烷基例如CH₃和C₁-C₃烷氧基，或者

R⁶为C₁-C₃烷基例如CH₃或卤基-C₁-C₂-烷基例如CF₃。

在一些实施方案中，本发明包括式I的化合物，其中为含有一个或两个N原子和一个S原子或三个N原子的5元杂芳基环。

在一些实施方案中，本发明包括式I的化合物，其中：

为或；

X¹为CH；

R¹为CH₃O、CH₃、C₂H₅或i-C₃H₇；

R^1a为CH₃；

R²为H；

R³为CHO或F；

R⁶为CH₃、CF₃、苯基、、、或；和

R⁸和R⁹各自为H。

在一些实施方案中，本发明包括式I的化合物，其中：

为，其中

R¹为C₁-C₃烷氧基例如CH₃O或C₁-C₄烷基例如i-C₃H₇，

R²为H，

X¹为CH，

R³为C₁-C₃烷氧基例如CH₃O或卤基例如F，和

R⁶为CF₃、苯基、被1或2个卤素例如F或Cl取代的苯基，例如，p-F-C₆H₄或2,4-二-F-C₆H₃，或者被CF₃取代的苯基，例如p-CF₃-C₆H₄，或者

R⁸和R⁹各自为H；和

为，其中

R¹为C₁-C₃烷基，例如CH₃，

X¹为CH，

R²为H，

R³为C₁-C₃烷氧基，例如CH₃O，

R⁶为被CF₃取代的苯基，例如p-CF₃-C₆H₄，和

R⁸和R⁹各自为H。

在一些实施方案中，本发明包括具有以下结构的本发明的化合物：

。

优选，在FLIPR测定法(下文描述)中，本发明的PAR4化合物的IC₅₀为5 μM或更少，更优选500 nM或更少，甚至更优选10 nM或更少。这样的优选的PAR4化合物的实例为在本文的具体的工作实施例中报道的那些。许多这些化合物的活性数据在实施例F的表中呈现。

在一些实施方案中，本发明提供至少一种本发明的化合物或其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、溶剂合物或前药酯。

在一些实施方案中，本发明提供一种药用组合物，所述组合物包含药学上可接受的载体和单独地或与另一种治疗剂联合的治疗有效量的式I的化合物，或其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、前药酯或溶剂合物。

在一些实施方案中，本发明提供一种药用组合物，所述组合物还包含另一种治疗剂。在一个优选的实施方案中，本发明提供一种药用组合物，其中所述另外的治疗剂为抗血小板药物或其组合。优选，抗血小板药物为P2Y12拮抗剂和/或阿司匹林。优选，P2Y12拮抗剂为氯吡格雷、ticagrelor或prasugrel。在另一优选的实施方案中，本发明提供一种药用组合物，其中所述另外的治疗剂为抗凝血剂或其组合。优选，抗凝血剂为FXa抑制剂或凝血酶抑制剂。优选，FXa抑制剂为apixaban或rivaroxaban。优选，凝血酶抑制剂为达比加群。

在一些实施方案中，本发明提供一种用于治疗或预防血栓栓塞性疾病的方法，所述方法包括给予需要这种治疗或预防的受试者(例如，人)治疗有效量的至少一种本发明的化合物或其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、溶剂合物或前药酯的步骤。

在一些实施方案中，本发明包括一种用于治疗血栓栓塞性疾病或血栓栓塞性疾病的初级预防的方法，所述方法包括给予有需要的患者(例如，人)治疗有效量的式I的化合物，或其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、前药酯或溶剂合物的步骤，其中所述血栓栓塞性疾病选自动脉心血管血栓栓塞性疾病、静脉心血管血栓栓塞性疾病、在心室中或在外周循环中的血栓栓塞性疾病、动脉脑血管血栓栓塞性疾病和静脉脑血管血栓栓塞性疾病。

在一些实施方案中，本发明包括一种上述方法，其中所述血栓栓塞性疾病选自不稳定的心绞痛、急性冠状动脉综合征、房颤、第一次心肌梗塞、复发性心肌梗塞、缺血性猝死、一过性缺血发作、中风、动脉粥样硬化、外周闭塞动脉疾病、静脉血栓形成、深静脉血栓形成、血栓性静脉炎、动脉栓塞、冠状动脉血栓形成、脑动脉血栓形成、脑栓塞、肾栓塞、肺栓塞和由其中血液暴露于促进血栓形成的人造表面的医疗植入物、装置和程序引起的血栓形成。

在一些实施方案中，本发明包括一种抑制或防止血小板聚集的方法，所述方法包括给予有需要的受试者(例如人)治疗有效量的PAR4拮抗剂的步骤，其为本发明的式I化合物。

本发明的其它实施方案

在一些实施方案中，本发明提供一种用于制备本发明的化合物或其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、溶剂合物或前药酯的方法。

在一些实施方案中，本发明提供一种用于制备本发明的化合物或其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、溶剂合物或前药酯的中间体。

在一些实施方案中，本发明提供一种治疗或预防血栓栓塞性疾病的方法，所述方法包括给予有需要的受试者(例如，人)治疗有效量的与PAR4结合(例如本发明的式I的化合物)并且抑制PAR4裂解和/或发信号的化合物，其中所述受试者具有双重PAR1/PAR4血小板受体功能。

在一些实施方案中，本发明提供一种本发明的化合物或其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、溶剂合物或前药酯，用于用于治疗或预防血栓栓塞性疾病的疗法中。

在一些实施方案中，本发明还提供本发明的化合物或其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、溶剂合物或前药酯用于制备药物的用途，该药物用于治疗或预防血栓栓塞性疾病。

本发明可以其它具体形式体现，而不会偏离其精神或基本性质。本发明包括本文提到的本发明的优选的方面的所有组合。应理解的是，本发明的任何和所有实施方案可与任何一个或多个其它实施方案结合以描述另外的实施方案。还应理解的是，实施方案的每一个单个要素为其自己的独立实施方案。此外，实施方案的任何要素是要与来自任何实施方案的任何和所有其它要素组合以描述另外的实施方案。

化学

本发明的化合物可具有一个或多个不对称的中心。除非另外指示，否则本发明化合物的所有手性(对映异构和非对映异构)和外消旋形式包括在本发明中。烯烃、C=N双键等的许多几何异构体也可存在于化合物中，并且所有这些稳定的异构体考虑在本发明中。描述本发明化合物的顺式和反式几何异构体，并且可分离作为异构体的混合物或作为单独的异构形式。本发明的化合物可采用光学活性或外消旋形式分离。本领域公知如何制备光学活性形式，例如通过拆分外消旋形式或通过由光学活性原料合成。预定结构的所有手性(对映异构和非对映异构)和外消旋形式和所有几何异构形式，除非明确指示特定的立体化学或异构体形式。当没有具体提及化合物(或不对称的碳)的构型(顺式、反式或R或S)时，则预定任何一种异构体或多于一种异构体的混合物。制备方法可使用外消旋体、对映异构体或非对映异构体作为原料。用于制备本发明的化合物的所有方法和本文制备的中间体认为是本发明的一部分。当制备对映异构或非对映异构产物时，它们可通过常规的方法分离，例如，通过层析法或分级结晶。本发明的化合物及其盐可以多种互变异构形式存在，其中氢原子移位至分子的其它部分，并且分子的原子之间的化学键因此重排。应理解的是，在它们可存在的范围内，所有互变异构形式包括在本发明中。

本发明化合物的分子量优选小于约800 g/mol。

本文使用的术语"烷基"或"亚烷基"，单独地或作为另一个基团的一部分，旨在包括具有1-10个碳或指定数量的碳原子的支链和直链饱和脂族烃基二者。例如，"C_1-10烷基"(或亚烷基)旨在包括C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉和C₁₀烷基。此外，例如，"C₁-C₆烷基"表示具有1-6个碳原子的烷基。烷基可未被取代或被取代，其中至少一个氢被另一个化学基团置换。示例烷基包括但不限于甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如，正丙基和异丙基)、丁基(例如，正丁基、异丁基、叔丁基)和戊基(例如，正戊基、异戊基、新戊基)以及其链异构体等以及可任选包括1-4个取代基的这样的基团，所述取代基例如卤基(例如F、Br、Cl或I)或CF₃、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳基(芳基)或二芳基、芳基烷基、芳基烷氧基、烯基、环烷基、环烷基烷基、环烷基烷氧基、氨基、羟基、羟基烷基、酰基、杂芳基、杂芳氧基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、芳氧基烷基、烷硫基、芳基烷硫基、芳氧基芳基、烷基酰氨基、烷酰基氨基、芳基羰基氨基、硝基、氰基、硫醇、卤代烷基、三卤代烷基和/或烷硫基以及(=O)、OR_a、SR_a、(=S)、-NR_aR_b、-N(烷基)₃ ⁺、-NR_aSO₂、-NR_aSO₂R_c、-SO₂R_c-SO₂NR_aR_b、-SO₂NR_aC(=O)R_b、SO₃H、-PO(OH)₂、-C(=O)R_a、-CO₂R_a、-C(=O)NR_aR_b、-C(=O)(C₁-C₄亚烷基)NR_aR_b、-C(=O)NR_a(SO₂)R_b、-CO₂(C₁-C₄亚烷基)NR_aR_b、-NR_aC(=O)R_b、-NR_aCO₂R_b、-NR_a(C₁-C₄亚烷基)CO₂R_b、=N-OH、=N-O-烷基，其中R_a和R_b相同或不同，并且独立地选自氢、烷基、烯基、CO₂H、CO₂(烷基)、C₃-C₇环烷基、苯基、苄基、苯基乙基、萘基、4元至7元杂环或5元至6元杂芳基，或者当与相同的氮原子连接时，可连接以形成杂环或杂芳基，并且R_c选自与R_a和R_b相同的基团，但不是氢。每一个基团R_a和R_b(当不是氢时)和每一个R_c基团任选具有最高达三个在R_a、R_b和/或R_c的任何可用的碳或氮原子处连接的其它取代基，所述取代基相同或不同，并且独立地选自(C₁-C₆)烷基、(C₂-C₆)烯基、羟基、卤素、氰基、硝基、CF₃、O(C₁-C₆烷基)、OCF₃、C(=O)H、C(=O)(C₁-C₆烷基)、CO₂H、CO₂(C₁-C₆烷基)、NHCO₂(C₁-C₆烷基)、-S(C₁-C₆烷基)、-NH₂、NH(C₁-C₆烷基)、N(C₁-C₆烷基)₂、N(CH₃)₃ ⁺、SO₂(C₁-C₆烷基)、C(=O)(C₁-C₄亚烷基)NH₂、C(=O)(C₁-C₄亚烷基)NH(烷基)、C(=O)(C₁-C₄亚烷基)N(C₁-C₄烷基)₂、C₃-C₇环烷基、苯基、苄基、苯基乙基、苯氧基、苄氧基、萘基、4元至7元杂环或5元至6元杂芳基。当取代的烷基为被芳基、杂环、环烷基或杂芳基取代时，所述成环的系统如下定义，因此可具有0个、1个、2个或3个也如下定义的取代基。

"烯基"或"亚烯基"，单独地或作为另一个基团的一部分，旨在包括直链或支链构型并且具有一个或多个沿着链可在任何稳定的点出现的碳-碳双键的烃链。例如，"C_2-6烯基"(或亚烯基)旨在包括C₂、C₃、C₄、C₅和C₆烯基。烯基的实例包括但不限于乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、2-甲基-2-丙烯基和4-甲基-3-戊烯基，并且可被1-4个取代基任选取代，所述取代基即，卤素、卤代烷基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、环烷基、氨基、羟基、杂芳基、环杂烷基、烷酰基氨基、烷基酰氨基、芳基羰基-氨基、硝基、氰基、硫醇和/或烷硫基。

"炔基"或"亚炔基(alkynylene)"，单独地或作为另一个基团的一部分，旨在包括直链或支链构型并且具有一个或多个沿着链可在任何稳定的点出现的碳-碳叁键的烃链。例如，"C_2-6炔基"(或亚炔基)旨在包括C₂、C₃、C₄、C₅和C₆炔基；例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基和己炔基，并且可被1-4个取代基任选取代，所述取代基即，卤素、卤代烷基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、环烷基、氨基、杂芳基、环杂烷基、羟基、烷酰基氨基、烷基酰氨基、芳基羰基氨基、硝基、氰基、硫醇和/或烷硫基。

术语"烷氧基"或"烷基氧基"，单独地或作为另一个基团的一部分，指-O-烷基，其中烷基如上定义。"C_1-6烷氧基"(或烷基氧基)旨在包括C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆烷氧基。实例烷氧基包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基(例如，正丙氧基和异丙氧基)和叔丁氧基。类似地，"烷硫基"或"硫基烷氧基"，单独地或作为另一个基团的一部分，表示具有指定数量的通过硫桥连接的碳原子如上定义的烷基或烷氧基；例如甲基-S-和乙基-S-。

"卤基"、"卤代"或"卤素"，单独地或作为另一个基团的一部分，包括氟、氯、溴和碘。

"卤基烷基"或"卤代烷基"打算包括被1-7个卤素(优选1-4个卤素，优选F和/或Cl)取代的具有指定数量的碳原子的支链和直链饱和脂族烃基二者。卤基烷基或卤代烷基的实例包括但不限于氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氯甲基、五氟乙基、五氯乙基、1,1-二氟乙基、1-氟乙基、2,2,2-三氟乙基、七氟丙基和七氯丙基。卤基烷基或卤代烷基的实例还包括打算包括被1-7个氟原子(优选1-4个氟原子)取代的具有指定数量的碳原子的支链和直链饱和脂族烃基二者的"氟烷基"。

"卤基-C₁-C₂-烷氧基"或"卤代烷氧基"表示具有指定数量的通过氧桥连接的碳原子的如上定义的卤代烷基。例如，"C_1-6卤代烷氧基"旨在包括C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆卤代烷氧基。卤代烷氧基的实例包括但不限于三氟甲氧基、2,2,2-三氟乙氧基、五氟乙氧基等。类似地，"卤代烷硫基"或"硫基卤代烷氧基"表示具有指定数量的通过硫桥连接的碳原子的如上定义的卤代烷基；例如三氟甲基-S-和五氟乙基-S-。

除非另外指示，否则本文采用的术语"环烷基"，单独地或作为另一个基团的一部分，包括含有1-3个环的饱和或部分不饱和的(含有1个或2个双键)环状烃基，包括共含有3-10个形成环的碳的单环烷基、双环烷基(或二环烷基)和三环烷基(C₃-C₁₀环烷基)，并且可与1或2个为芳基描述的芳族环稠合，其包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环癸基、环十二烷基、环己烯基、降冰片烷基、

其中任何基团可被1-4个取代基任选取代，所述取代基例如卤素、烷基、烷氧基、羟基、芳基、芳氧基、芳基烷基、环烷基、烷基酰氨基、烷酰基氨基、氧代基、酰基、芳基羰基氨基、氨基、硝基、氰基、硫醇和/或烷硫基，和/或用于烷基的任何取代基，以及包括2个自由键，因此为连接基团的这样的基团。

本文使用的"碳环"或"碳环残基"打算指任何稳定的3-、4-、5-、6-或7元单环或双环或7-、8-、9-、10-、11-、12-或13元双环或三环状环，其中的任何环可为饱和、部分不饱和、不饱和或芳族的。这样的碳环的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环丁烯基、环戊基、环戊烯基、环己基、环庚烯基、环庚基、环庚烯基、金刚烷基、环辛基、环辛烯基、环辛二烯基、[3.3.0]二环辛烷、[4.3.0]二环壬烷、[4.4.0]二环癸烷、[2.2.2]二环辛烷、芴基、苯基、萘基、茚满基、金刚烷基、蒽基和四氢萘基(四氢化萘)。如以上显示的，桥环也包括在碳环的定义中(例如，[2.2.2]二环辛烷)。除非另外指定，否则优选的碳环为环丙基、环丁基、环戊基、环己基、苯基和茚满基。当使用术语"碳环"时，打算包括"芳基"。当一个或多个碳原子连接两个非相邻的碳原子时，出现桥环。优选的桥为一个或两个碳原子。应注意，桥总是将单环状环转化为三环状环。当环桥接时，记载用于环的取代基也可存在于桥上。

"芳基"基团指单环或多环芳族烃，包括，例如，苯基、萘基和菲基。芳基部分为公知的并且例如描述于Lewis，R.J.编辑，Hawley's Condensed Chemical Dictionary，第13版，John Wiley & Sons，Inc.，New York (1997)。"C_6-10芳基"指苯基和萘基。除非另外指定，否则"芳基"、"C_6-10芳基"或"芳族残基"可未被取代或被1-3个选自以下的基团取代：OH、OC₁-C₃烷氧基、Cl、F、Br、I、CN、NO₂、NH₂、N(CH₃)H、N(CH₃)₂、CF₃、OCF₃、OCHF₂、C(=O)CH₃、SCH₃、S(=O)CH₃、S(=O)₂CH₃、C₁-C₃烷基、CO₂H和CO₂CH₃。

本文使用的术语"杂环"、"杂环基"或"杂环的"基团打算指稳定的5元、6元或7元单环或双环或7元、8元、9元、10元、11元、12元、13元或14元双环杂环状环，其为饱和或部分不饱和的，并且含有碳原子和1、2、3或4个独立地选自N、O和S的杂原子，并且包括其中任何以上定义的杂环状环与苯环稠合的任何双环基团。氮和硫杂原子可任选被氧化(即，N→O和S(O)_p，其中p为0、1或2)。氮原子可被取代或未被取代(即，N或NR，其中R为H或另一个取代基，如果限定)。杂环状环可在导致稳定结构的任何杂原子或碳原子处与其侧基连接。如果所得到的化合物稳定，本文描述的杂环状环可在碳原子或在氮原子上被1-3个选自以下的基团任选取代：OH、OC₁-C₃烷氧基、Cl、F、Br、I、CN、NO₂、NH₂、N(CH₃)H、N(CH₃)₂、CF₃、OCF₃、OCHF₂、=O、C(=O)CH₃、SCH₃、S(=O)CH₃、S(=O)₂CH₃、C₁-C₃烷基、CO₂H和CO₂CH₃。杂环中的氮可任选被季铵化。优选当杂环中的S和O原子的总数超过1时，则这些杂原子彼此不相邻。优选杂环中的S和O原子的总数不大于1。当使用术语"杂环"时，不打算包括杂芳基。

示例性单环杂环基包括氮杂环丁烷基、吡咯烷基、氧杂环丁烷基、咪唑啉基、唑烷基、异唑啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、四氢呋喃基、哌啶基、哌嗪基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、2-氧代氮杂环庚烯基、氮杂环庚烯基、4-哌啶酮基、四氢吡喃基、吗啉基、硫吗啉基、硫吗啉基亚砜、硫吗啉基砜、1,3-二氧杂环戊烷和四氢-1,1-二氧代噻吩基等。

示例性双环杂环基团包括奎宁环基。

优选的杂环基团包括

，其任选可被取代。

本文使用的术语"芳族杂环基"或"杂芳基"打算指包括至少一个杂原子环成员(例如硫、氧或氮)的稳定的单环和多环芳族烃。杂芳基包括但不限于吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、呋喃基、喹啉基、异喹啉基、噻吩基、咪唑基、噻唑基、吲哚基、吡咯基、唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、异唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、吲唑基、1,2,4-噻二唑基、异噻唑基、嘌呤基、咔唑基、苯并咪唑基、吲哚啉基、苯并二氧杂环戊烷基和苯并二氧杂环己烷。杂芳基未被取代或被1-3个选自以下的基团取代：OH、OC₁-C₃烷氧基、Cl、F、Br、I、CN、NO₂、NH₂、N(CH₃)H、N(CH₃)₂、CF₃、OCF₃、OCHF₂、=O、C(=O)CH₃、SCH₃、S(=O)CH₃、S(=O)₂CH₃、C₁-C₃烷基、CO₂H和CO₂CH₃。氮原子被取代或未被取代(即，N或NR，其中R为H或另一个取代基，如果限定)。氮和硫杂原子可任选被氧化(即，N→O和S(O)_p，其中p为0、1或2)。桥环也包括在杂环的定义中。当一个或多个原子(即，C、O、N、或者S)连接两个非相邻的碳或氮原子时，出现桥环。桥环的实例包括但不限于一个碳原子、两个碳原子、一个氮原子、两个氮原子和碳-氮基团。应注意，桥总是将单环状环转化为三环状环。当环桥接时，记载用于环的取代基也可存在于桥上。

优选的杂芳基包括

等。

当本文使用术语"不饱和的"提及环或基团时，该基团可为完全不饱和的或部分不饱和的。

术语"酰基"，单独地或作为另一个基团的一部分，指与有机基团连接的羰基，更特别是基团C(=O)R_e以及其与有机基团连接的二价基团-C(=O)-或-C(=O)R_e-。基团R_e可选自本文定义的烷基、烯基、炔基、氨基烷基、取代的烷基、取代的烯基或取代的炔基，或者适当地，相应的二价基团，例如，亚烷基、亚烯基等。

与环或其它基团连接的符号""或""或""指自由键或连接基团。

在整个说明书中，基团及其取代基可由本领域技术人员选择，以提供稳定的部分和化合物和可用作药学上可接受的化合物的化合物和/或可用于制备药学上可接受的化合物的中间体化合物。

术语"反荷离子"用于表示带负电荷类物质，例如氯离子、溴离子、氢氧根、乙酸根和硫酸根。

本文提及的术语"取代的"指至少一个氢原子被非氢基团替代，条件是保持正常的化合价，并且取代导致稳定的化合物。当取代基为酮(即，=O)时，则原子上的2个氢被替代。酮取代基不存在于芳族部分上。本文使用的环双键为在两个相邻的环原子之间形成的双键(例如，C=C、C=N或N=N)。

在其中在本发明的化合物上存在氮原子(例如，胺)的情况下，通过用氧化剂(例如，mCPBA和/或过氧化氢)处理，这些氮原子可转化为N-氧化物，以得到本发明的其它化合物。因此，认为显示的和要求保护的氮原子包括显示的氮及其N-氧化物(N→O)衍生物二者。在其中在本发明的化合物中存在季碳原子的情况下，这些碳原子可被硅原子替代，条件是它们不形成Si-N或Si-O键。

当在化合物的任何组分或化学式中，任何变量出现多于一次时，其定义每次出现时独立于其在每一次其它出现时的定义。因此，例如，如果基团显示被0-3个R^3a取代，则所述基团可任选被至多三个R^3a基团取代，并且每次出现时，R^3a独立地选自R^3a的定义。另外，只有在取代基和/或变量的组合导致稳定的化合物，这样的组合才是可允许的。

当与取代基连接的键显示为交叉连接环中的两个原子的键时，则这样的取代基可与环上的任何原子连接。当列举取代基而没有指示其中这样的取代基与给定化学式的化合物的其余部分的哪个原子结合时，则这样的取代基可经由这样的取代基中的任何原子结合。只有在取代基和/或变量的组合导致稳定的化合物，这样的组合才是可允许的。

短语"药学上可接受的"在本文中用于指那些化合物、材料、组合物和/或剂型，其在合理的医学判断内，适用于与人和动物的组织接触，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应和/或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比匹配。

本文使用的"药学上可接受的盐"指其中母体化合物通过制备其酸式盐或碱式盐而被修饰的所公开的化合物的衍生物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性基团(例如胺)的无机酸盐或有机酸盐；和酸性基团(例如羧酸)的碱性盐或有机盐。药学上可接受的盐包括例如由非毒性无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规的非毒性盐或季铵盐。例如，这样的常规的非毒性盐包括衍生自无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸)的那些；和由有机酸制备的盐，所述有机酸例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、扑酸、马来酸、羟基马来酸、苯基乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸和羟乙磺酸等。

本发明的药学上可接受的盐可通过常规的化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，这样的盐可通过这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的适当的碱或酸在水中或在有机溶剂中或在二者的混合物中反应而制备；通常，优选非含水介质，像醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适的盐的列举在Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington的药物科学)，第18版，Mack Publishing Company，Easton，PA (1990)中找到，其公开的内容通过引用结合到本文中。

此外，式I的化合物可具有前药酯形式。体内转化以提供生物活性剂(即，式I的化合物)的任何化合物为在本发明的范围和精神内的前药。各种形式的前药为本领域公知的。对于这样的前药衍生物的实例，参见：

a) Bundgaard，H.编辑，Design of Prodrugs (前药的设计)，Elsevier (1985)和Widder，K.等人编辑，Methods in Enzymology (酶学方法)，112:309-396，Academic Press (1985)；

b) Bundgaard，H.，第5章，" Design and Application of Prodrugs (前药的设计和应用)"，Krosgaard-Larsen，P.等人编辑，A Textbook of Drug Design and Development (药物设计和开发教科书)，第113-191页，Harwood Academic Publishers (1991)；

c) Bundgaard，H.，Adv. Drug Deliv. Rev.，8:1-38 (1992)；

d) Bundgaard，H.等人，J. Pharm. Sci.，77:285 (1988)；

e) Kakeya，N.等人，Chem. Pharm. Bull.，32:692 (1984)；和

f) King，F.D.编辑，Medicinal Chemistry: Principles and Practice (医学化学：原理和实践)，The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK (1994)。

本文还提供同位素标记的本发明的化合物，即，其中一个或多个所描述的原子被该原子的同位素替代(例如，¹²C被¹³C或被¹⁴C替代；和氢的同位素包括氚和氘)。这样的化合物具有多种潜在的应用，例如在测定潜在的药物化合物与靶蛋白质或受体结合能力中作为标准物和试剂，或者用于使与生物受体体内或体外结合的本发明的化合物成像。

在制备后，优选将本发明的化合物分离和纯化，以得到含有其量等于或大于98%，优选99%重量本发明的化合物的组合物("基本上纯的")，其随后如本文描述的使用或配制。这样的"基本上纯的"化合物本文也考虑是本发明的一部分。

"稳定的化合物"和"稳定的结构"是指足够稳健以承受得住由反应混合物和制剂分离至可用的纯度程度成为有效的治疗剂的化合物。优选本发明的化合物不含N-卤素、S(O)₂H或S(O)H基团。

术语"溶剂合物"指本发明的化合物与一种或多种溶剂分子(无论是有机还是无机)的物理缔合物。该物理缔合包括氢键键合。在某些情况下，溶剂合物能分离，例如当将一种或多种溶剂分子掺入到结晶固体的晶格中时。"溶剂合物"包括溶液-相和能被分离的溶剂合物二者。示例性溶剂合物包括但不限于水合物、乙醇化物、甲醇化物和异丙醇化物。溶剂化的方法通常为本领域已知的。

本文使用的缩写如下定义："1×"为一次，"2×"为两次，"3×"为三次，"℃"为摄氏度，"eq"为当量，"g"为克，"mg"为毫克，"L"为升，"mL"为毫升，"μL"为微升，"N"为标准，"M"为摩尔浓度，"mmol"为毫摩尔，"min"为分钟，"h"为小时，"rt"为室温，"RT"为保留时间，"atm"为大气压，"psi"为磅/平方英寸，"conc."为浓度，"sat"或"sat'd"为饱和的，"MW"为分子量，"mp"为熔点，"MS"或"Mass Spec"为质谱法，"ESI"为电喷雾离子化质谱法，"HR"为高分辨率，"HRMS"为高分辨质谱法，"LCMS"为液相色谱法质谱法，"HPLC"为高压液相色谱法，"RP HPLC"为反相HPLC，"TLC"为薄层层析法，"SM"为原料，"NMR"为核磁共振光谱法，"¹H"为质子，"δ"为delta，"s"为单峰，"d"为双峰，"t"为三重峰，"q"为四重峰，"m"为多重峰，"br"为宽，"Hz"为赫兹，"tlc"为薄层层析法。"α"、"β"、"R"、"S"、"E"和"Z"为本领域技术人员熟悉的立体化学符号。

本发明的化合物可采用有机合成领域技术人员已知的多种方式制备。可使用以下描述的方法以及合成有机化学领域已知的合成方法或者本领域技术人员认识到的其变体合成本发明的化合物。优选的方法包括但不限于以下描述的那些。反应在适合采用的试剂和材料并且适用实施转化的溶剂或溶剂混合物中进行。有机合成领域技术人员应理解，在分子上存在的官能团应与打算的转化一致。有时需要判断来改变合成步骤的顺序或比起另一种选择一种特定的方法流程，以得到本发明的期望的化合物。

还应认识到，在本领域计划任何合成路线中另一个主要的考虑是正确选择用于保护在本发明描述的化合物中存在的反应性官能团的保护基团。为受过训练的专业人员描述许多备选的权威的解释为Wuts 等人(Greene's Protective Groups In Organic Synthesis(在有机合成中的Greene保护基团)，第4版，Wiley-Interscience (2006))。

本发明的式I的化合物可通过式III的胺与含有离去基团Z(例如溴化物、碘化物或甲苯磺酸酯(盐))和保护基团PG(例如苄基)的式IV的酮的缩合得到，如流程1所示。式III和IV的化合物二者市售可得或者可通过本领域技术人员已知的手段制备。该缩合通过加热促进，通过热方法或优选通过微波辐射。保护基团可通过本领域已知的方法除去，例如BCl₃，在-78℃下，在五甲基苯存在下。在Mitsunobu条件下使用醇VI或在碱(例如碳酸钾)存在下使用溴化物VII，随后烷基化，提供式I的化合物。醇和溴化物VI和VII市售可得或者可通过本领域已知的方法制备。

流程1

或者，如流程2所示，通过氧化为砜VII，当硫甲基活化后，式I的化合物可由式IX的化合物制备。在碱(例如碳酸钾或氢化钠)存在下，在纯的或在极性、质子惰性溶剂(例如二甲基甲酰胺)中，这允许作为基团R⁰引入多种亲核基团，例如醇、硫醇和胺，以得到化合物XI。如在流程1中讨论的，通过除去保护基团(PG)和烷基化，化合物XI可转化为式I的化合物。

流程2

可制备在2-位携带α-溴酮取代基的取代的苯并呋喃(XV)，如流程3所示。邻-羟基苯甲醛XII可通过有机合成领域技术人员已知的方法制备，并且可与携带离去基团Q(例如氯、溴或甲苯磺酰氧基)的式XIII的酮缩合，以得到苯并呋喃XIV。式XIV的化合物的溴化得到溴酮XV，其可根据流程1与取代的氨基杂环III缩合，以得到式I的化合物。溴酮XV为在流程1中化合物IV的特定的子集。

流程3

式I的苯并唑化合物可由取代的氨基杂环III和含有离去基团Z(例如溴化物、碘化物或甲苯磺酸酯基)的式XVI的丙酮酸酯起始制备，如流程4所示。式III和XVI的化合物均市售可得或者可通过本领域技术人员已知的方式得到。在缩合和酯的皂化以形成酸XVIII后，式XIX的氨基苯酚偶联以形成式XX的酰胺，其可在酸催化下环化，以形成式XXI的苯并唑化合物。这些化合物可如流程1所示脱保护和烷基化，以提供式I的化合物。

流程4

氨基杂环XXIV可经由硫代黄原酸酯中间体XXIII由二硫化碳(XXII)制备。这些氨基杂环可用于制备式I的化合物。

流程5

氨基杂环XXX(其为用于制备其中Y=-CH₂CH₂-的式I的化合物的有用中间体)可由酮酯XXV制备。与肼环合，接着用溴氧化，得到哒嗪酮XXVII。氯化，用肼置换，随后氢化，提供氨基杂环XXX，其为在流程I中的化合物III的特定的子集。因此，这些氨基杂环可用于制备式I的化合物。

流程6

实施例

使用本文公开的方法，已制备、分离和表征以下本发明的化合物。它们证明本发明的一部分范围，并且不是要限制本发明的范围。在实验程序中，除非另外说明，否则溶液比表述体积关系。NMR化学位移(δ)用百万分数(ppm)报道。使用以下方法，通过反相分析HPLC分析产物。

方法A：柱：ZORBAX® XDB-C18 3.5微米，4.6×30 mm；流动相：A=MeOH:H₂O:TFA (95:5:05)，B=MeOH:H₂O:TFA (5:95:05)。梯度：T=0：100%溶剂A；T=2:100%溶剂B；停止时间：4分钟。流量=3.0mL/分钟

方法B：柱：Agilent POROSHELL® 120；EC-C18，2.7um；2.1×30 mm；流动相：溶剂A：5% MeOH：95% H₂O+0.1% AcOH；溶剂B：95% MeOH：5% H₂O+0.1% AcOH；梯度：T=0：100%溶剂A；T=1:100%溶剂B；停止时间：4分钟。流量=1.0mL/分钟

方法C：SunfireC18 3.5微米柱(4.6×30 mm)，以3 mL/分钟洗脱，2分钟梯度从100% A到100% B (A：5%甲醇，94.95%水，0.05% TFA；B：5%水，94.95%甲醇，0.05% TFA，UV 220 nm)

方法D：Eclipse XDB-C18 3.5微米柱(4.6×30 mm)，以3 mL/分钟洗脱，2分钟梯度从100% A到100% B (A：5%甲醇，94.95%水，0.05% TFA；B：5%水，94.95%甲醇，0.05% TFA，UV 220 nm)

方法E：Eclipse XDB-C18 3.5微米柱(4.6×30 mm)，以3 mL/分钟洗脱，2分钟梯度从100% A到100% B (A：5%乙腈，94.95%水，0.05% TFA；B：5%水，94.95%乙腈，0.05% TFA，UV 220 nm)

方法F：ZORBAX® SB-苯基3.5微米柱(4.6×50 mm)，以3 mL/分钟洗脱，2分钟梯度从100% A到100% B (A：5%甲醇，94.95%水，0.05% TFA；B：5%水，94.95%甲醇，0.05% TFA，UV 220 nm)。

实施例1

2-甲氧基-6-(6-甲氧基-4-((2-甲基噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

1A. (2-甲基噻唑-4-基)甲醇

将2-甲基-噻唑-4-甲酸乙酯(1.26g，7.36 mmol)在乙醚(10 mL)中的溶液冷却至-78℃，并且用经10分钟逐滴加入的LAH (0.83g，21.9 mmol)在无水THF (30 mL)中的溶液处理。3小时后，在-78℃下，混合物用饱和Na₂SO₄ (约20 mL)猝灭。让混合物温热至高达22℃，用乙醚(4×50 mL)萃取。合并的萃取物用盐水洗涤，经无水MgSO₄干燥，浓缩，以得到油。在硅胶垫(3×7 cm)上过滤，用乙酸乙酯洗脱，得到油，将其蒸馏，以得到油状的标题物质(0.664g，70%)，其结晶。B.p. 60-70℃/0.2托。HRMS(ESI)计算值C₅H₈NOS [M+H]⁺ m/z 130.0321，实测值130.0342。¹H NMR (CDCl₃，600 MHz) δ 6.99 (d，J=0.8 Hz，1H)，4.70 (s，1H)，2.98 (br s，1H)，2.68 (s，3H)。

1B. 5-(苄氧基)-7-甲氧基-2,2-二甲基-4H-苯并[d][1,3]二氧杂环己烯-4-酮

5-羟基-7-甲氧基-2,2-二甲基-4H-苯并[d][1,3]二氧杂环己烯-4-酮(30.00 g，0.134 mol)在N,N-二甲基甲酰胺(400 mL)中的溶液用一次性加入的粉末状无水碳酸钾(19.41 g，0.14 mol)处理。将所得到的混合物真空搅拌10分钟，随后用氮气吹扫。将反应烧瓶放置在水浴(22℃)中，用经15分钟逐滴加入的苄基溴(24.03 g，0.14 mol)处理。随后将所得到的混合物在22℃下搅拌18小时(通过tlc没有原料剩下)。将固体过滤，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤。将滤液真空蒸发，残余的油用乙酸乙酯(500 mL)稀释，用冷0.1 N盐酸、饱和碳酸氢钠和盐水洗涤。经无水硫酸镁干燥后，蒸发溶剂，得到稠厚的浆状物。由乙酸乙酯(50 mL)和己烷(150 mL)结晶，得到35.17 g大的无色棱柱状的5-(苄氧基)-7-甲氧基-2,2-二甲基-4H-苯并[d][1,3]二氧杂环己烯-4-酮。母液在硅胶上层析(4×13 cm，洗脱甲苯-乙酸乙酯0-5%)，得到6.64 g另外的物质，以得到41.81 g的总产量(99%)。HRMS(ESI)计算值C₁₈H₁₉O₅ [M+H]⁺ m/z 315.1227，实测值315.1386。¹H NMR (CDCl₃，600 MHz) δ 1.68 (s，6H)，3.77 (s，3H)，5.19 (s，2H)，5.19 (s，2H)，6.04 (d，J=2.03 Hz，1H)，6.15 (d，J=2.03 Hz，1H)，7.27 (宽t，1H)，7.36 (宽t，2H)，7.52 (宽d，2H)。

1C. 2-(苄氧基)-6-羟基-4-甲氧基苯甲醛

将5-(苄氧基)-7-甲氧基-2,2-二甲基-4H-苯并[d][1,3]二氧杂环己烯-4-酮(实施例1B，6.76 g，21.5 mmol)在二氯甲烷(120 mL)中的溶液冷却至-78℃，用43 mL (64.5 mmol)经20分钟逐滴加入的1.5 M二异丁基氢化铝在甲苯中的溶液处理。随后将所得到的混合物在-78℃下搅拌3小时。通过小心加入经15分钟逐滴加入的甲醇(5 mL)，接着经15分钟逐滴加入的1N盐酸(50 mL)，猝灭反应混合物。随后移除冷却浴，经20分钟加入另外的150 mL 1N盐酸。随后将混合物在22℃下搅拌2小时，用二氯甲烷(400 mL)稀释。收集有机相，水相(pH ~1)用二氯甲烷(3×50 mL)萃取。合并的有机萃取物用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，真空浓缩。残余的油用四氢呋喃(70 mL)稀释，用10 mL 0.1N盐酸处理，并且在20℃下搅拌2小时。反应混合物用乙酸乙酯(300 mL)稀释，用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，真空蒸发，以得到澄清的油。在硅胶上层析(4×13 cm，洗脱甲苯)，得到4.08 g (73%收率)澄清的油状的标题醛，静置后固化。LC (方法C)：2.237分钟。HRMS(ESI)计算值C₁₅H₁₅O₄ [M+H]⁺ m/z 259.0965，实测值259.1153。¹H NMR (CDCl₃，600 MHz) δ 3.80 (s，3H)，5.07 (s，2H)，5.97 (d，J=2.1 Hz，1H)，6.01 (d，J=2.1 Hz，1H)，7.3-7.4 (m，5 H)，10.15 (s，1H)，12.49 (s，1H)。

1D. 1-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)乙酮

2-(苄氧基)-6-羟基-4-甲氧基苯甲醛(实施例1C，3.46 g，13.4 mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(50 mL)中的溶液用一次性加入的粉末状无水碳酸铯(4.58 g，14.05 mmol)处理。将所得到的混合物真空搅拌10分钟，随后用氮气吹扫。将反应烧瓶放置在水浴(22℃)中，用经5分钟逐滴加入的氯丙酮(1.74 g，18.7 mmol)处理。随后将所得到的混合物在22℃下搅拌18小时(通过tlc，没有起始醛剩下，并且形成中间体烷基化的醛)。将固体过滤，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤。将滤液真空蒸发，残余的油用乙酸乙酯(300 mL)稀释，用冷0.1 N盐酸、饱和碳酸氢钠和盐水洗涤。经无水硫酸镁干燥后，蒸发溶剂，得到稠厚的浆状物。该浆状物用四氢呋喃(50 mL)和乙酸乙酯(50 mL)稀释，用对甲苯磺酸一水合物(0.2 g)处理，并且在20℃下搅拌1小时(tlc指示中间体烷基化的醛完全环化为苯并呋喃)。反应混合物用乙酸乙酯(300 mL)稀释，用饱和碳酸氢钠和盐水洗涤。经无水硫酸镁干燥后，蒸发溶剂，得到稠厚的浆状物。在硅胶上层析(4×12 cm，洗脱甲苯-乙酸乙酯2-4%)，得到3.51 g (88%收率)黄色固体状的标题苯并呋喃。由乙酸乙酯(10 mL)和己烷(20 mL)重结晶，得到大的黄色棱柱状的标题物质(3.15 g)。LC (方法D)：2.148分钟。HRMS(ESI)计算值C₁₈H₁₇O₄ [M+H]⁺ m/z 297.1121，实测值297.1092。¹H NMR (CDCl₃，600 MHz) δ 2.51 (s，3H)，3.82 (s，3H)，5.13 (s，2H)，6.37 (d，J=1.77 Hz，1H)，6.63 (宽s，1H)，7.34 (宽t，1H)，7.39 (宽t，2H)，7.44 (宽d，2H)，7.55 (d，J=0.7 Hz，1H)。

1E. 1-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-2-溴乙酮

250-mL三颈烧瓶配备有磁力搅拌棒并且用氮气气氛吹扫，装入无水四氢呋喃(25 mL)，接着加入9.3 mL (9.3 mmol)二(三甲基甲硅烷基)氨基化锂在四氢呋喃中的1M溶液。将混合物冷却至-78℃，用经10分钟逐滴加入的1-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)乙酮(实施例1D，2.40 g，8.1 mmol)在四氢呋喃(20 mL)中的溶液处理。随后将所得到的混合物在-78℃下搅拌45分钟。随后经5分钟逐滴加入三甲基氯硅烷(1.18 mL，9.31 mmol)，将所得到的溶液在-78℃下搅拌另外的20分钟。随后移除冷却浴，经30分钟让混合物温热至室温。随后通过向乙酸乙酯(200 mL)的冷溶液中加入饱和碳酸氢钠(30 mL)和冰，猝灭反应混合物。有机相经无水硫酸镁快速干燥(磁力搅拌)，真空蒸发，以得到油状的甲硅烷基烯醇醚，将其与甲苯(20 mL)共蒸发。甲硅烷基烯醇醚随后溶解于无水四氢呋喃(40 mL)中，冷却至-20℃，用固体碳酸氢钠(0.10 g)，接着经15分钟以小份加入的N-溴代琥珀酰亚胺(1.44 g，8.1 mmol)处理。经2小时让反应混合物温热至0℃，随后通过加入乙酸乙酯(300 mL)和饱和碳酸氢钠而猝灭。有机相用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，蒸发，以得到橙色油。在硅胶上层析(4×12 cm，洗脱甲苯-乙酸乙酯0-5%)，得到2.62 g (86%收率)黄色固体状的标题溴甲基酮。由乙酸乙酯(10 mL)和己烷(20 mL)重结晶，得到黄色棱晶(2.30 g)。LC (方法E)：1.977分钟。HRMS(ESI)计算值C₁₈H₁₆BrO₄ [M+H]⁺ m/z 375.0226，实测值375.0277。¹H NMR (CDCl₃，600 MHz) δ 3.84 (s，3H)，4.33 (s，2H)，5.14 (s，2H)，6.38 (d，J=1.76 Hz，1H)，6.64 (宽s，1H)，7.35 (宽t，1H)，7.40 (宽t，2H)，7.44 (宽d，2H)，7.70 (s，1H)。

1F. 6-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-2-溴咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

将1-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-2-溴乙酮(实施例1E，3.00 g，8.0 mmol)和5-溴-1,3,4-噻二唑-2-胺(1.65 g，9.16 mmol)在异丙醇(100 mL)中的混合物在配备磁力搅拌棒的压力烧瓶中在78-80℃下加热18小时(20分钟后均匀，随后2小时后形成沉淀物)。随后将冷却的混合物转移至五个20 mL微波小瓶，随后在微波设备中加热至150℃，保持30分钟。每一个小瓶随后用二氯甲烷(250 mL)稀释，用饱和碳酸氢钠(25 mL)和盐水(25 mL)洗涤，经无水硫酸镁干燥。将级分合并，真空浓缩。橙褐色残余的固体在硅胶上层析(4×10 cm，由于溶解性差，用二氯甲烷缓慢洗脱)，得到2.96 g标题咪唑并噻二唑，被一些1-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)乙酮污染。固体物质用乙酸乙酯(20 mL)研磨，过滤，用乙酸乙酯(10 ml)洗涤，真空干燥，以得到2.34 g (64%收率)类白色固体状的纯的标题咪唑并噻二唑，其原样用于下一步。LC (方法E)：2.188分钟。HRMS(ESI)计算值C₂₀H₁₅BrN₃O₃S [M+H]⁺ m/z 456.00175，实测值456.00397。¹H NMR (CDCl₃，600 MHz) δ 3.82 (s，3H)，5.16 (s，2H)，6.38 (d，J=1.67 Hz，1H)，6.66 (宽s，1H)，7.15 (s，1H)，7.31 (宽t，1H)，7.38 (宽t，2H)，7.45 (宽d，2H)，8.02 (s，1H)。

1G. 6-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

在22℃下，6-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-2-溴咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑(实施例1F，2.30 g，5.04 mmol)在二氯甲烷(180 mL)和甲醇(45 mL)的混合物中的溶液用4.2 mL一份加入的25重量%甲醇钠在甲醇(0.2 mmol)中的溶液处理。加入更多的甲醇(45 mL)，将混合物搅拌1小时。通过加入25 mL 1N盐酸接着加入20 ml饱和碳酸氢钠，猝灭反应混合物。将溶剂减压蒸发，残余物用二氯甲烷(400 mL)稀释，用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，真空蒸发。残余物在硅胶上层析(3×10 cm，用二氯甲烷-乙酸乙酯0-4%洗脱)，得到1.70 g (83%收率)白色固体状的标题化合物。该物质由乙酸乙酯重结晶(30 mL/g，80%回收率)，以得到白色针状物。LC (方法D)：2.293分钟。HRMS(ESI)计算值C₂₁H₁₈N₃O₄S [M+H]⁺ m/z 408.1013，实测值408.1024。¹H NMR (CDCl₃，600 MHz) δ 3.81 (s，3H)，4.18 (s，3H)，5.16 (s，2H)，6.37 (d，J=1.75 Hz，1H)，6.67 (宽s，1H)，7.07 (s，1H)，7.31 (宽t，1H)，7.37 (宽t，2H)，7.45 (宽d，2H)，7.81 (s，1H)。

1H. 6-甲氧基-2-(2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-6-基)苯并呋喃-4-醇

在氮气气氛下，将6-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑(实施例1G，1.250 g，3.06 mmol)和五甲基苯(3.17 g，21.4 mmol)在二氯甲烷(200 mL)中的混合物冷却至-78℃，随后用8 mL (8 mmol)经3分钟逐滴加入的三氯化硼在二氯甲烷中的1 M溶液立即处理(以避免结晶)。将所得到的混合物在-78℃下搅拌1小时。随后，通过加入一份加入的碳酸氢钠(6 g)的水(100 mL)溶液，猝灭反应混合物。移除冷却浴，将所得到的混合物在室温下搅拌1小时。将形成的固体过滤，用水(50 m)和二氯甲烷(50 mL)连续洗涤。滤饼用无水乙醇(15 ml)浸泡，随后吸干。随后将得到的白色固体真空干燥24小时，以得到0.788 g (80%收率)纯的标题物质(通过hplc，> 95%)。合并的滤液和洗液用二氯甲烷(600 mL)稀释，在温水浴中搅拌，直至有机相澄清，在悬浮液中没有明显的固体。收集有机相，经无水硫酸镁干燥，在仍温热时快速过滤。将滤液蒸发，残余物(产物和六甲基苯)用甲苯(20 mL)研磨，收集固体，用甲苯(20 mL)洗涤，以得到0.186 g (19%收率，99%合并的收率)棕褐色固体状的标题物质(通过hplc，> 95%)。LC (方法E)：1.444分钟。HRMS(ESI)计算值C₁₄H₁₂N₃O₄S [M+H]⁺ m/z 318.0543，实测值318.0578。¹H NMR (DMSO-d₆，600 MHz) δ 3.71 (s，3H)，4.16 (s，3H)，6.21 (d，J=1.87 Hz，1H)，6.61 (宽s，1H)，6.95 (s，1H)，8.29 (s，1H)，9.96 (s，1H)。

实施例1. 2-甲氧基-6-(6-甲氧基-4-((2-甲基噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

将6-甲氧基-2-(2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-6-基)苯并呋喃-4-醇(实施例1H，0.100g，0.315 mmol)和三苯基膦(0.123g，0.47 mmol)的混合物在真空下保持10分钟。混合物用氮气吹扫，随后装入无水THF (8 mL)和(2-甲基噻唑-4-基)甲醇(实施例1A，0.049g，0.38 mmol)。将混合物温热至50℃，超声处理5分钟。冷却的混合物用经20分钟分三份逐滴加入的DIAD (0.096g，0.47 mmol)在无水THF (2 mL)中的溶液处理。40分钟后混合物均匀，并且在22℃下搅拌6小时。反应混合物用二氯甲烷(250 mL)稀释，用饱和碳酸氢钠、盐水洗涤，经无水MgSO₄干燥。蒸发，得到半固体残余物，其通过在硅胶上层析纯化(2.5×10 cm，二氯甲烷/EtOAc 8:2)，以提供白色立方体状的标题物质(0.103g，76%)。LC (方法A)：2.224分钟。HRMS(ESI)计算值C₁₉H₁₇N₄O₄S₂ [M+H]⁺ m/z 429.0686，实测值429.0605。¹H NMR (CDCl₃，600 MHz) δ 7.82 (s，1H)，7.17 (s，1H)，7.06 (s，1H)，6.67 (m，1H)，6.39 (d，J=1.89 Hz，1H)，5.25 (d，J=0.9 Hz，2H)，4.18 (s，3H)，3.82 (s，3H)，2.72 (s，3H)。

实施例2

2-甲氧基-6-(6-甲氧基-4-((2-(三氟甲基)噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

2A. 2-(三氟甲基)噻唑-4-甲酸乙酯

将2,2,2-三氟乙酰胺(7.12g，63 mmol)和Lawesson试剂(15.3g，37.8 mmol)在THF (60 mL)中的混合物加热回流18小时。随后将反应物冷却至室温，用溴丙酮酸乙酯(8.0 mL，63 mmol)处理。将反应物搅拌回流另外的18小时，随后真空浓缩，用乙酸乙酯稀释。该混合物用水(1×)和盐水(1×)洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。残余物通过硅胶层析法纯化(8×11 cm，甲苯，随后第二次用120g硅胶，己烷/乙酸乙酯)，以得到浅黄色固体状的标题物质(4.47g，32%)。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ 8.37 (s，1H)，4.45 (q，J=7.0 Hz，2H)，1.41 (t，J=7.0 Hz，1H)。

2B. (2-(三氟甲基)噻唑-4-基)甲醇

如实施例1A所描述的，使2-(三氟甲基)噻唑-4-甲酸乙酯(实施例2A，1.50g，6.66 mmol)反应，蒸馏(b.p.：55-65℃/0.2托)后，得到澄清的油状的期望的标题物质(0.95g，78%)。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ 7.47 (s，1H)，4.85 (s，2H)，2.25 (br s，1H)。

实施例2. 2-甲氧基-6-(6-甲氧基-4-((2-(三氟甲基)噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

如实施例1所描述的，使6-甲氧基-2-(2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-6-基)苯并呋喃-4-醇(实施例1H，0.100g，0.315mmol)和(2-(三氟甲基)噻唑-4-基)甲醇(实施例2B，0.075g，0.409 mmol)反应，在AcOEt中结晶后，得到标题物质(0.070，46%)。LC (方法B)：2.448分钟。HRMS(ESI)计算值C₁₉H₁₄F₃N₄O₄S₂ [M+H]⁺ m/z 483.0403，实测值483.0411。¹H NMR (CDCl₃，600 MHz) δ 7.82 (s，1H)，7.17 (s，1H)，7.06 (s，1H)，6.67 (m，1H)，6.39 (d，J=1.89 Hz，1H)，5.25 (d，J=0.9 Hz，2H)，4.18 (s，3H)，3.82 (s，3H)，2.72 (s，3H)。

实施例3

2-甲氧基-6-(6-甲氧基-4-((2-苯基噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

3A. 2-苯基噻唑-4-甲酸甲酯

苯并硫代酰胺(4.0g，29.2 mmol)在THF (80 mL)中的溶液用溴丙酮酸乙酯(7.6g，39 mmol)逐滴处理，加热回流18小时。随后将反应物真空浓缩，用乙酸乙酯稀释，用水(1×)、盐水(1×)洗涤，经无水硫酸镁干燥。浓缩后得到的残余物通过硅胶层析法纯化(4.5×11 cm，20% AcOEt/甲苯)，接着第二次用20% AcOEt/己烷纯化。浓缩后得到黄色油状的标题物质(5.25，77%)。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz)：8.14 (s，1H) 8.00 (m，2H) 7.46-7.42 (m，3H) 4.43 (q，J=7.0 Hz，2H) 1.42 (t，J=7.3 Hz，3H)。

3B. (2-苯基噻唑-4-基)甲醇

在250 mL圆底烧瓶中，将2-苯基噻唑-4-甲酸甲酯(实施例3A，1.50 g，6.43 mmol)溶解于乙醚(40 mL)中。将溶液冷却至-78℃，经20分钟分批用氢化铝锂(0.75g，19.76 mmol)处理。将反应物在-78℃下搅拌3.5小时，随后用20 mL饱和Na₂SO₄溶液处理。让反应物达到室温，用乙酸乙酯稀释，用1N HCl (1×)、盐水(1×)洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。残余物通过硅胶层析法纯化(3×12cm，30%乙酸乙酯/二氯甲烷)，以得到浅黄色油(1.06 g)，其随后蒸馏(鼓泡，bp：110-120℃/0.2托)，提供澄清的油状的标题物质(0.88 g，72%)。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz)：7.95-7.90 (m，2H) 7.45-7.40 (m，3H) 7.16 (s，1H) 4.82 (s，2H) 2.34 (br s，1H)。

实施例3. 2-甲氧基-6-(6-甲氧基-4-((2-苯基噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

在配备加料漏斗的200 mL烧瓶中，将6-甲氧基-2-(2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-6-基)苯并呋喃-4-醇(实施例1H，0.800 g，2.52 mmol)、三苯基膦(0.992 g，3.78 mmol)和(2-苯基噻唑-4-基)甲醇(实施例3B，0.555 g，2.90 mmol)的混合物在真空下保持10分钟。随后混合物用氮气吹扫，装入无水四氢呋喃(60 mL，经氢化铝锂蒸馏)。将溶液温热至~50℃，随后超声处理5分钟。随后将冷却的不均匀混合物在22℃下用经2.5小时逐滴加入的二异丙基偶氮二甲酸酯(0.663 g，3.28 mmol)在四氢呋喃(15 mL)中的溶液处理。在加入结束时反应物均匀(浅黄色)。随后混合物搅拌另外2.5小时(共5小时)。随后将反应混合物用二氯甲烷(400 mL)稀释，用饱和碳酸氢钠(20 mL)、盐水洗涤，干燥(无水硫酸镁)。蒸发，得到白色固体，将其在硅胶上层析(3×12 cm，洗脱二氯甲烷-乙酸乙酯98.5:1.5-97:3)。收集级分，蒸发，以得到白色固体状的期望的化合物(1.40 g)，通过tlc，被酰肼污染。在乙酸乙酯(40 mL)中结晶，得到白色固体状的纯的标题物质(0.838 g，68%)。母液(0.475 g)在硅胶上层析(3×12 cm，洗脱二氯甲烷-乙酸乙酯98.5:1.5-97:3)，由乙酸乙酯(30 mL)结晶后，以提供白色固体状的另外的期望的化合物(0.160 g，13%，共81%)。LC (方法C)：2.480分钟。HRMS(ESI)计算值C₂₄H₁₉N₄O₄S₂ [M+H]⁺ m/z 491.0842，实测值491.0865。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) 3.85 (s，3H) 4.21 (s，3H) 5.33-5.55 (m，2H) 6.48 (d，J=1.96 Hz，1H) 6.72 (dd，J=1.96，0.78 Hz，1H) 7.12 (s，1H) 7.36-7.39 (m，1H) 7.41-7.50 (m，3H) 7.86 (s，1H) 7.95-8.02 (m，2H)。

实施例4

2-甲氧基-6-(6-甲氧基-4-((4-苯基噻唑-2-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

4A. 2-氨基-2-硫代乙酸乙酯

2-氨基-2-氧代乙酸乙酯(5.00 g，42.7 mmol)在四氢呋喃(150 mL)中的溶液用粉末状(研钵和研杵) Lawesson试剂(9.50 g，23.49 mmol)处理，将所得到的橙色澄清的溶液加热回流(浴温85℃) 4小时(形成具有较高Rf的TLC产物，有一些原料剩余)。将冷却的混合物减压浓缩，残余物用乙酸乙酯(400 mL)稀释，用饱和碳酸氢钠、盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥。蒸发，得到橙色固体，将其在硅胶上层析(3×10 cm，洗脱甲苯-乙酸乙酯9 :1)，提供黄色固体状的标题物质(3.189 g，56%)。LC (方法C)：0.816分钟。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：1.41 (t，J=7.0 Hz，3H)，4.38 (q，J=7.0 Hz，2H)，7.69 (br s，1H) 8.24 (br s，1H)。

4B. 4-苯基噻唑-2-甲酸乙酯

将2-溴-1-苯基乙酮(1.790 g，8.99 mmol)和2-氨基-2-硫代乙酸乙酯(实施例4A，1.20 g，9.01 mmol)在苯(80 mL)和乙醇(10 mL)中的混合物在室温下搅拌18小时。将混合物在80℃下加热1小时。将溶剂减压蒸发，残余物在乙酸乙酯(300 mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(100 mL)之间分配。有机相用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，真空浓缩。残余的澄清的油在硅胶上层析(4×10 cm，洗脱甲苯-乙酸乙酯0-2-4%)，得到黄色油(1.588g)。将该油真空蒸馏(bp：105-115℃/0.1托，鼓泡蒸馏，空气浴温)，以提供浅黄色浆状的标题物质(1.409g，67%)，静置后固化为几乎无色固体。LC (方法C)：2.009分钟。HRMS(ESI)计算值C₁₂H₁₂NO₂S [M+H]⁺ m/z 234.0583，实测值234.0597。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：1.48 (t，J=7.2 Hz，3H)，4.52 (q，J=7.2 Hz，2H)，7.35-7.49 (m，3H)，7.75 (s，1H)，7.93-8.00 (m，2H)。

4C. 2-(羟甲基)-4-苯基噻唑

在500 mL烧瓶中，在氮气气氛下，将4-苯基噻唑-2-甲酸乙酯(实施例4B，1.300 g，5.57 mmol)在乙醚(60 mL)中的溶液冷却至-40℃ (干冰-水-氯化钙浴)，用一次性加入的固体LiAlH₄ (0.40 g，10.54 mmol)处理。将混合物在-40℃下搅拌2.5小时。通过逐滴加入乙酸乙酯(1 mL)、水(0.4 mL)、接着加入15%氢氧化钠水溶液(0.4 mL)和水(1.2 mL)，猝灭反应。随后移除浴，将混合物在室温下搅拌50分钟。将形成的固体过滤，用乙醚(50 mL)洗涤。合并的滤液和洗液用盐水(20 mL)洗涤，经无水硫酸镁干燥。蒸发，得到黄色油，其通过硅胶层析法纯化(2.5×8 cm，洗脱甲苯-乙酸乙酯9:1，8:2至7:3)。随后将所得到的浅黄色油(0.931g)真空蒸馏(bp：105-110℃/0.1托，鼓泡，空气浴温)，以提供无色浆状物的标题物质(0.918g，86%)。LC (方法C)：1.672分钟。HRMS(ESI)计算值C₁₀H₁₀NOS [M+H]⁺ m/z 192.0478，实测值192.0508。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：2.90 (br t，1H)，5.02 (d，J=4.30 Hz，2H)，7.31-7.38 (m，1H)，7.39-7.45 (m，2H)，7.46 (d，J=0.8 Hz，1H)，7.85-7.92 (m，2H)。

4D. 2-(溴甲基)-4-苯基噻唑

将(4-苯基噻唑-2-基)甲醇(实施例4C，0.530 g，2.77 mmol)在二氯甲烷(10 mL)中的溶液冷却至0℃(冰浴)，用经2分钟逐滴加入的PBr₃ (0.118 mL，1.247 mmol)处理。立即形成重质白色胶。10分钟后，移除浴，将溶液在22℃下搅拌4小时。反应混合物用冰(~10 g)猝灭，倒入乙酸乙酯(150 mL)和饱和碳酸氢钠(50 mL)的混合物中。有机相用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，真空浓缩。固体残余物在硅胶上层析(2.5×6 cm，洗脱甲苯)，以得到浅黄色油状的标题物质(0.561 g，80%)，其在冰箱中固化为浅黄色固体。LC (方法C)：2.062分钟。HRMS(ESI)计算值C₁₀H₉BrNS [M+H]⁺ m/z 253.9634，实测值253.9655。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：4.81 (s，2H)，7.34-7.39 (m，1H)，7.41-7.47 (m，2H)，7.52 (s，1H)，7.86-7.92 (m，2H)。

实施例4. 2-甲氧基-6-(6-甲氧基-4-((4-苯基噻唑-2-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

将6-甲氧基-2-(2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-6-基)苯并呋喃-4-醇(实施例1H，0.080 g，0.252 mmol)和2-(溴甲基)-4-苯基噻唑(0.128 g，0.504 mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(3 mL)中的悬浮液在真空(10毫巴)下保持5分钟。烧瓶随后用氮气吹扫，一次性加入无水新的粉末状(研钵和研杵)碳酸钾(0.105 g，0.756 mmol)。将所得到的混合物在室温下搅拌1小时，具有有点短的超声处理阶段(~1分钟)。10分钟后不均匀混合物变得几乎均匀(碳酸钾除外)，并且开始再次沉淀为膏状固体。反应混合物用1N盐酸(2 mL)猝灭，随后在二氯甲烷(150 mL)和饱和碳酸氢钠(20 mL)之间分配。有机相用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，真空浓缩。固体浅黄色残余物在硅胶上层析(2.5×6 cm，洗脱二氯甲烷-乙酸乙酯0-2-5%)，以得到浅黄色固体状的标题物质(0.116 g，94%)。在乙酸乙酯(12 mL)中结晶，得到浅黄色固体状的标题物质(0.086 g)。LC (方法C)：2.474分钟。HRMS(ESI)计算值C₂₄H₁₉N₄O₄S₂ [M+H]⁺ m/z 491.0842，实测值491.0864。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：3.86 (s，3H)，4.22 (s，3H)，5.54 (s，2H)，6.48 (d，J=1.96 Hz，1H)，6.75 (宽d，1H)，7.15 (s，1H)，7.32-7.39 (m，1H)，7.41-7.49 (m，2H)，7.53 (s，1H)，7.87 (s，1H)，7.90-7.95 (m，2H)。

实施例5

4-(4-(((6-甲氧基-2-(2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-6-基)苯并呋喃-4-基)氧基)甲基)噻唑-2-基)吗啉

5A. 2-吗啉代噻唑-4-甲酸甲酯

2-溴噻唑-4-甲酸甲酯(0.20 g，0.901 mmol)在THF (10 mL)中的溶液用吗啉(0.17 mL，1.94 mmol)处理，回流18小时。随后反应物用乙酸乙酯稀释，用饱和NaHCO₃ (1×)、盐水(1×)洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。残余物通过硅胶层析法纯化(2.5×10 cm，50% AcOEt/CH₂Cl₂)，以得到黄色固体状的标题物质(0.192 g，92%)。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：7.44 (s，1H) 3.82 (s，3H) 3.75 (m，4H) 3.45 (m，4H)。

5B. (2-吗啉代噻唑-4-基)甲醇

经10分钟，2-吗啉代噻唑-4-甲酸甲酯(0.76 g，3.33 mmol)在乙醚(20 mL)中的溶液用氢化铝锂(0.38 g，10.01 mmol)分批处理。将混合物在-78℃下搅拌4小时，随后用乙酸乙酯(10 mL)和饱和Na₂SO₄ (20 mL)缓慢处理。让混合物温热至高达室温，用乙酸乙酯稀释，用饱和NaHCO₃ (1×)、盐水(1×)洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。残余物经硅胶层析法纯化(3×10 cm，25% AcOEt/CH₂Cl₂至100% AcOEt)，以得到米色固体状的标题物质(0.458 g)，其随后蒸馏(鼓泡，135-145℃/0.2托)，得到白色固体状的期望的产物(0.455g，68%)。LC (方法F)：0.873分钟。HRMS(ESI)计算值C₈H₁₃N₂O₂S [M+H]⁺ m/z 201.07，实测值201.2。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：6.43 (s，1H) 4.53 (d，J=3.9 Hz，2H) 3.79 (m，4H) 3.44 (m，4H) 2.17 (s，1H)。

实施例5. 4-(4-(((6-甲氧基-2-(2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-6-基)苯并呋喃-4-基)氧基)甲基)噻唑-2-基)吗啉

在25 mL圆底烧瓶中加入6-甲氧基-2-(2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-6-基)苯并呋喃-4-醇(实施例1H，0.10g，0.315 mmol)、三苯基膦(0.124g，0.473 mmol)和(2-吗啉代噻唑-4-基)甲醇(实施例5B，0.086g，0.429 mmol)，在真空和氮气下吹扫。随后加入四氢呋喃(8 mL)，混合物用DIAD (0.083g，0.410 mmol)在四氢呋喃(10 mL)中处理。将混合物在22℃下搅拌1小时，用乙酸乙酯稀释。用饱和NaHCO₃ (1×)和盐水(1×)洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。残余物经硅胶柱层析法纯化(2.5×10 cm，40%乙酸乙酯/CH₂Cl₂)，将浓缩后得到的残余物在乙酸乙酯中结晶，以得到晶体状的标题物质(0.083g，53%)和从母液得到无定形不纯的固体(0.169g)。LC (方法F)：2.466分钟。HRMS(ESI)计算值C₂₂H₂₂N₅O₅S₂ [M+H]⁺ m/z 500.1057，实测值500.1075。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：7.82 (s，1H) 7.07 (s，1H) 6.67 (d，J=2 Hz，1H) 6.62 (s，1H) 6.40 (d，J=1.5 Hz，1H) 5.10 (s，2H) 4.19 (s，3H) 3.82 (s，3H) 3.81 (m，4H) 3.46 (m，4H)。

实施例6

2-甲氧基-6-(6-甲氧基-4-((2-((2-甲氧基乙氧基)甲基)噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

6A. 2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰胺

2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸(5.0g，37.3 mmol)在CH₂Cl₂ (50 mL)中的溶液用草酰氯(9.5 mL，109 mmol)和DMF (2滴)处理，将反应物搅拌3小时。真空蒸发后，使残余物与CH₂Cl₂ (2×)共蒸发，随后溶解于THF (10 mL)中，用氢氧化铵(12 mL)、THF (25 mL)和水(10 mL)的混合物逐滴处理5分钟。随后将反应物在0-5℃下搅拌30分钟。随后在22℃下搅拌1小时。反应物用CH₂Cl₂稀释，用水(1×)、1N HCl (1×)、饱和NaHCO₃ (1×)和盐水(1×)洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。当产物看起来可溶于水中时，真空蒸发水相，用CH₂Cl₂ (5×200 mL)萃取，经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，以得到油状的标题物质(3.59 g，72%)，其固化。将其蒸馏(鼓泡，105-115℃/0.2托)，以提供澄清的油状的纯的期望的产物(3.39g)，其固化为白色固体。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：6.93 (非常宽s，1H)，5.43 (非常宽s，1H)，3.99 (s，2H)，3.66-3.70 (m，2H)，3.53-3.56 (m，2H)，3.39 (s，3H)。

6B. 2-(2-甲氧基乙氧基)乙烷硫代酰胺

2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰胺(实施例6A，3.39g，25.5 mmol)在THF (40 mL)中的溶液用Lawesson试剂(6.55g，16.19 mmol)处理，将反应物回流18小时。随后让反应物冷却至室温，真空浓缩，用乙酸乙酯稀释，用饱和NaHCO₃ (1×)和盐水(1×)洗涤。水相用乙酸乙酯(2×200 mL)萃取，有机萃取物经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。残余物通过硅胶层析法纯化(3.5×11 cm，30% AcOEt/CH₂Cl₂)，以得到黄色油状的标题物质(3.26g，86%)。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：8.58 (非常宽s，1H)，7.50 (非常宽s，1H)，4.36 (s，2H)，3.66-3.69 (m，2H)，3.53-3.56 (m，2H)，3.39 (s，3H)。

6C. 2-((2-甲氧基乙氧基)甲基)噻唑-4-甲酸乙酯

向2-(2-甲氧基乙氧基)乙烷硫代酰胺(实施例6B，3.26g，21.85 mmol)在乙醇(60 mL)中的溶液中逐滴加入溴丙酮酸乙酯(3.7 mL，29.5 mmol)，将混合物回流18小时。随后将反应物真空浓缩，用乙酸乙酯稀释，用水(1×)、盐水(1×)洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。残余物通过硅胶柱层析法纯化(3.5×10cm，30%乙酸乙酯/CH₂Cl₂)，以得到油状的标题物质(4.36g，81%)。LC (方法F)：1.791分钟。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：8.16 (s，1H)，4.87 (s，2H)，4.41 (q，J=7.10 Hz，2H)，3.74-3.77 (m，2H)，3.57-3.60 (m，2H)，3.39 (s，3H)，1.39 (t，J=7.10 Hz，3H)。

6D. (2-((2-甲氧基乙氧基)甲基)噻唑-4-基)甲醇

在-78℃下，经10分钟，向2-((2-甲氧基乙氧基)甲基)噻唑-4-甲酸乙酯(实施例6C，2.27g，9.25 mmol)在乙醚(50 mL)中的溶液中分批加入氢化铝锂(1.06g，27.9 mmol)。随后将反应物在-78℃下搅拌1小时。随后向反应物中加入乙酸乙酯(10 mL)，接着加入水(20 mL)，让反应物达到室温。随后混合物用乙酸乙酯稀释，用1N HCl (1×)和盐水(1×)洗涤。合并的水相用乙酸乙酯(2×300 mL)萃取，经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。残余物通过硅胶层析法纯化(3.5×10 cm，乙酸乙酯)，以得到褐色油状的标题物质(0.357g，19%)。LC (方法F)：1.791分钟。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：7.16 (s，1H)，4.82 (s，2H)，4.74 (宽s，2H)，3.7-3.75 (m，2H)，3.54-3.61 (m，2H)，3.38 (s，3H)，2.28 (宽s，1H)。

6E. 4-(溴甲基)-2-((2-甲氧基乙氧基)甲基)噻唑

在室温下，(2-((2-甲氧基乙氧基)甲基)噻唑-4-基)甲醇(0.35 g，1.72 mmol)在乙醚(15 mL)中的溶液用PBr₃ (0.1 mL，1.06 mmol)处理。形成沉淀物。将反应物在室温下搅拌18小时，随后用乙酸乙酯稀释，用饱和NaHCO₃ (1×)和盐水(1×)洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。残余物通过硅胶层析法纯化(3×10 cm，20%乙酸乙酯/CH₂Cl₂)，以得到澄清的油状的标题物质(0.233 g，51%)。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：7.27 (s，1H)，4.83 (s，2H)，4.55 (s，2H)，3.73-3.76 (m，2H)，3.57-3.60 (m，2H)，3.39 (s，3H)。

实施例6. 2-甲氧基-6-(6-甲氧基-4-((2-((2-甲氧基乙氧基)甲基)噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

将6-甲氧基-2-(2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-6-基)苯并呋喃-4-醇(实施例1H，0.10g，0.315 mmol)和4-(溴甲基)-2-((2-甲氧基乙氧基)甲基)噻唑(实施例6E，0.10g，0.376 mmol)在DMF (5 mL)中的悬浮液在真空和氮气下吹扫10分钟。随后混合物用碳酸钾(0.10g，0.724 mmol)处理，将反应物在室温下搅拌2.5小时。随后反应物用二氯甲烷稀释，用水(1×)、盐水(1×)洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。残余物通过硅胶层析法纯化(2.5×10 cm，50%乙酸乙酯/CH₂Cl₂)，以得到标题物质，其在乙酸乙酯中结晶，提供期望的标题物质(0.055g，35%)以及非结晶物质(9 mg，6%)。LC (方法F)：2.476分钟。HRMS(ESI)计算值C₂₂H₂₃N₄O₆S₂ [M+H]⁺ m/z 503.1054，实测值503.1066。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：7.82 (s，1H)，7.35 (s，1H)，7.05 (s，1H)，6.68 (宽s，1H)，6.39 (d，J=1.9 Hz，1H)，5.28 (s，2H)，4.86 (s，2H)，4.19 (s，3H)，3.82 (s，3H)，3.74-3.77 (m，2H)，3.58-3.61 (m，2H)，3.39 (s，3H)。

实施例7

2-甲氧基-6-(6-甲氧基-4-((5-苯基-1,2,4-噻二唑-3-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

7A. 5-苯基-1,2,4-噻二唑-3-甲酸乙酯

将2-氧代-1,3,4-氧杂噻唑-5-甲酸乙酯(U.S.公布号2005/0096362) (1.5 g，8.56 mmol)和苄腈(4.37 ml，42.8 mmol)在1,2-二氯苯(15.42 ml，137 mmol)中的混合物加热至160℃，保持4天。随后将反应物冷却至室温，通过在最大真空下在75℃下加热反应物，蒸发溶剂。残余物经硅胶层析法纯化(100% CH₂Cl₂至3% EtOAc/CH₂Cl₂)，以提供标题物质(0.064g，3%)。LC (方法B)：2.021分钟。HRMS(ESI)计算值C₁₁H₁₁N₂O₂S [M+H]⁺ m/z 235.0541，实测值235。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：8.01-8.09 (m，1H)，7.49-7.59 (m，2H)，4.56 (q，J=7.17 Hz，1H)，1.50 (t，J=7.24 Hz，1H)。

7B. (5-苯基-1,2,4-噻二唑-3-基)甲醇

在0℃下，向5-苯基-1,2,4-噻二唑-3-甲酸乙酯(实施例7A，230 mg，0.982 mmol)在无水乙醇(3 mL，51.4 mmol)中的溶液中加入NaBH₄ (149 mg，3.93 mmol)。将反应混合物加热至80℃，保持30分钟，随后加入1N HCl (1 mL)，将乙醇蒸发。将二氯甲烷加入到反应物中，接着加入盐水，用二氯甲烷(3×)萃取。有机层经无水硫酸镁干燥，浓缩。残余物经硅胶柱层析法纯化(100% CH₂Cl₂，至高达10% EtOAc/CH₂Cl₂)，以提供标题物质(25 mg，13%)。LC (方法B)：1.858分钟。LCMS (APCI)计算值C₉H₉N₂OS [M+H]⁺ m/z 193.04，实测值193.0。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：7.89-8.03 (m，2H)，7.46-7.62 (m，3H)，4.99 (d，J=5.87 Hz，2H)，2.81 (t，J=6.06 Hz，1H)。

实施例7. 2-甲氧基-6-(6-甲氧基-4-((5-苯基-1,2,4-噻二唑-3-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

将6-甲氧基-2-(2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-6-基)苯并呋喃-4-醇(实施例1H，8.25 mg，0.026 mmol)和(5-苯基-1,2,4-噻二唑-3-基)甲醇(实施例7B，5 mg，0.025 mmol)放入烧瓶中，用N₂吹扫。加入无水THF (4 mL)，向该所得到的悬浮液中加入三正丁基膦(0.017 mL，0.065 mmol)，经2小时，经由注射器泵，逐滴加入1,1′-(偶氮二羰基)二哌啶(16.57 mg，0.065 mmol)在无水THF (2.5 mL)中的溶液。将所得到的悬浮液在室温下搅拌另外的2小时，此时LC显示没有原料剩余。混合物用EtOAc稀释，用0.2N HCl、饱和NaHCO₃水溶液和盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。残余物经硅胶层析法纯化(50%二氯甲烷/己烷至100%二氯甲烷至1% EtOAc/CH₂Cl₂至7% EtOAc/CH₂Cl₂)，在MeCN/水中冻干，以得到标题物质(6.2 mg，49%)。LC (方法B)：2.615分钟。HRMS(ESI)计算值C₂₃H₁₈N₅O₄S₂ [M+H]⁺ m/z 492.0795，实测值492.0828。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：8.00 (dd，J=8.02，1.37 Hz，2H)，7.85 (s，1H)，7.50-7.56 (m，3H)，7.14 (s，1H)，6.71-6.75 (m，1H)，6.51 (d，J=1.57 Hz，1H)，5.51 (s，2H)，4.21 (s，3H)，3.84 (s，3H)。

实施例8

2-甲氧基-6-(6-甲氧基-4-((5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

8A. 5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-甲酸乙酯

向2-(2-苯甲酰基肼基)-2-氧代乙酸乙酯(1g，4.23 mmol)在无水THF (5 ml，61.0 mmol)中的溶液中加入Lawesson试剂(1.079 g，2.67 mmol)。将反应物在室温下搅拌2小时，没有任何反应。随后将混合物加热至50℃，随后加热至回流。加入另外的Lawesson试剂(1.079 g，2.67 mmol)，回流16小时后，反应中途完成。将混合物蒸发至干，残余物通过硅胶柱层析法纯化(50% CH₂Cl₂/己烷至高达100% CH₂Cl₂)，以提供标题物质(0.35g，35%)。LC (方法B)：2.063分钟，LCMS (APCI)计算值C₁₁H₁₁N₂O₂S [M+H]⁺ m/z 235.05，实测值235.0。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：1.49 (t，J=1.00 Hz，3H)，4.55 (q，J=1.00 Hz，2H)，7.45-7.65 (m，3H)，8.02-8.07 (m，2H)。

8B. (5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基)甲醇

在0℃下，向5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-甲酸乙酯(350 mg，1.494 mmol)在无水甲醇(5 mL，124 mmol)中的溶液中加入NaBH₄(226 mg，5.98 mmol)。将反应混合物在环境温度下搅拌16小时。加入AcOH (2 mL)，将反应物浓缩至干。将残余物溶解于EtOAc、盐水和水中，用EtOAc (3×)萃取。合并的有机萃取物用饱和NaHCO₃水溶液和盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥。过滤和蒸发后，残余物用乙醚研磨，以得到标题物质作为第一收获物(150 mg，52%)。LC (方法B)：2.022分钟，LCMS (APCI)计算值C₉H₉N₂OS [M+H]⁺ m/z 193.04，实测值193.2。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：7.92-8.03 (m，2H)，7.44-7.59 (m，3H)，5.14 (br. d，J=3.90 Hz，2H)，2.63 (br. s.，1H)。

实施例8. 2-甲氧基-6-(6-甲氧基-4-((5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

在200 mL圆底烧瓶中，将苯加入到5-苯基-1,3,4-噻二唑-2-甲酸乙酯(实施例8B，80 mg，0.252 mmol)和6-甲氧基-2-(2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-6-基)苯并呋喃-4-醇(实施例1H，58.2 mg，0.303 mmol)中，将混合物超声处理30秒，真空浓缩，以除去原料中的痕量的水。加入三苯基膦(99 mg，0.378 mmol)，将混合物在高真空下干燥10分钟。加入THF (40 mL)，将混合物超声处理/加热5分钟。经约1小时，逐滴加入二异丙基偶氮二甲酸酯(68.6 µl，0.353 mmol)在THF (4 mL)中的溶液，LC/MS显示反应不完全。再次加入二异丙基偶氮二甲酸酯(2滴)，将混合物在CH₂Cl₂中稀释，用饱和NaHCO₃水溶液(1×)、盐水(1×)洗涤，经无水MgO₄干燥，浓缩。残余物经硅胶层析法纯化(100% CH₂Cl₂，至高达15% EtOAc/CH₂Cl₂)，以得到残余物，将其用MeCN研磨，得到标题物质(36 mg，29%)。LC (方法A)：2.901分钟。HRMS(ESI)计算值C₂₃H₁₇N₅O₄S₂ [M+H]⁺ m/z 492.0722，实测值492.0806。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：7.96-8.02 (m，2H)，7.87 (s，1H)，7.45-7.55 (m，3H)，7.10 (s，1H)，6.73-6.78 (m，1H)，6.48 (d，J=1.57 Hz，1H)，5.63 (s，2H)，4.22 (s，3H)，3.86 (s，3H)。

实施例9

2-甲氧基-6-(6-甲氧基-4-((1-苯基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

9A. 2-甲氧基-6-(6-甲氧基-4-(丙-2-炔-1-基氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

在室温下和在氮气气氛下，6-甲氧基-2-(2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-6-基)苯并呋喃-4-醇(实施例1H，205 mg，0.646 mmol)在THF (10 mL)中的溶液用炔丙醇(0.096 mL，1.615 mmol)、三正丁基膦(0.398 mL，1.615 mmol)处理，和经25分钟时间段，逐滴加入1,1′-(偶氮二羰基)二哌啶(408 mg，1.615 mmol)在THF (10 mL)中的溶液。将混合物在浴中超声处理30分钟，并且在室温下搅拌另外30分钟。随后将混合物溶解于二氯甲烷(50 mL)中，用饱和NaHCO₃水溶液、盐水洗涤，干燥(MgO₄)。蒸发溶剂，得到固体，其通过硅胶柱层析法ISCO纯化，以得到标题物质(180 mg，0.507 mmol，78%收率)。¹H NMR (DMSO-d₆，400 MHz) δ ppm：8.38 (s，1H)，6.92 (s，1H)，6.86 (dd，J=1.8，1.0 Hz，1H)，6.53 (d，J=1.6 Hz，1H)，4.94 (d，J=2.7 Hz，2H)，4.21 (s，3H)，3.77-3.84 (m，3H)，3.60-3.66 (m，1H)。

9B. 叠氮基苯

在冰浴中冷却苯胺(500 mg，5.37 mmol)在乙腈(10 mL，191 mmol)中的溶液，用亚硝酸叔丁酯(680 mg，6.59 mmol)处理，并逐滴加入TMS-N₃ (0.713 mL，5.37 mmol)。移除冰浴，在N₂下，将混合物在室温下搅拌过夜。将乙腈小心地蒸发(NB：叠氮基苯也是挥发性的)，将残余物(750 mg)通过硅胶垫(20g)，用石油醚(35-55℃)洗脱。蒸发溶剂，得到油状的标题物质(500 mg，4.20 mmol，78%收率)，通过¹H NMR显示仍含有一些痕量的溶剂。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：7.32-7.41 (m，2H)，7.12-7.19 (m，1H)，7.01-7.09 (m，2H)。

实施例9. 2-甲氧基-6-(6-甲氧基-4-((1-苯基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

在室温下和在氮气气氛下，2-甲氧基-6-(6-甲氧基-4-(丙-2-炔-1-基氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑(实施例9A，20 mg，0.056 mmol)和叠氮基苯(实施例9B，19 mg，0.159 mmol)在DMF (4 mL，51.7 mmol)中的溶液用(R)-2-((S)-1,2-二羟基乙基)-4-羟基-5-氧代-2,5-二氢呋喃-3-醇化钠(8 mg，0.040 mmol)和五水合硫酸铜(II) (5 mg，0.020 mmol)处理。将混合物搅拌2小时(通过HPLC跟踪反应)，随后用二氯甲烷(60 mL)稀释，用饱和NaHCO₃、盐水洗涤，干燥(MgO₄)。蒸发溶剂，固体残余物用乙腈(2×1 mL)研磨，冻干，以得到标题物质(13 mg，0.027 mmol，49%收率)。LC (方法A)：2.213分钟。HRMS(ESI)计算值C₂₃H₁₉N₆O₄S [M+H]⁺ m/z 475.1183，实测值475.1204。¹H NMR (DMSO-d₆，400 MHz) δ ppm：9.04 (s，1H)，8.37 (s，1H)，7.90-7.99 (m，2H)，7.58-7.67 (m，2H)，7.51 (tt，J=7.4，1.2 Hz，1H)，6.97-7.03 (m，1H)，6.83-6.88 (m，1H)，6.71 (d，J=1.6 Hz，1H)，5.38 (s，3H)，4.20 (s，3H)，3.83 (s，3H)。

实施例10

2-甲氧基-6-(6-甲氧基-4-((1-苯基-1H-1,2,3-三唑-5-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

在氮气气氛下，在5 mL微波小瓶中，加入2-甲氧基-6-(6-甲氧基-4-(丙-2-炔-1-基氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑(实施例9A，27 mg，0.076 mmol)、叠氮基苯(实施例9B，30 mg，0.252 mmol)、无水DMF (2.5 mL，32.3 mmol)和(Cp*RuCl)₄ (12 mg)。将小瓶封盖，在微波设备中在110℃下加热20分钟。蒸发溶剂，残余物通过硅胶层析法ISCO纯化，浓缩，用甲醇(2×1 mL)研磨两次。向固体中加入乙腈(2 mL)和水(4 mL)，将混合物冷冻干燥经过周末，以得到标题物质(5 mg，10.54 µmol，14%收率)。LC (方法F)：2.480分钟。HRMS(ESI)计算值C₂₃H₁₉N₆O₄S [M+H]⁺ m/z 475.1183，实测值475.1234。¹H NMR (DMSO-d₆，400 MHz) δ ppm：8.35 (s，1H)，8.12 (s，1H)，7.66-7.73 (m，2H)，7.53-7.63 (m，3H)，6.84 (dd，J=2.0，0.8 Hz，1H)，6.75 (d，J=0.8 Hz，1H)，5.40 (s，2H)，4.20 (s，3H)，3.79 (s，3H)。

制备醇

根据在实施例3-8中描述的程序制备以下醇。

制备溴化物

根据在实施例4中描述的程序制备以下溴化物。

实施例11-35

使用以上公开的方法，已制备、分离和表征以下另外的实施例。

实施例36

6-(6-氟-4-((2-苯基噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)-2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

36A. 4-氟-2-羟基-6-甲氧基苯甲醛和2-氟-6-羟基-4-甲氧基苯甲醛

将1:5的4-氟-2,6-二甲氧基苯甲醛和2-氟-4,6-二甲氧基苯甲醛(Helvetica Chim . Acta，81:1596-1607 (1998)，1 g，5.43 mmol)在30 mL二氯甲烷中的混合物冷却至0-5℃。经25分钟，向该混合物中逐滴加入三溴硼烷(7.33 mL，7.33 mmol)在10 mL二氯甲烷中的溶液，将反应物在0-5℃下搅拌约5-10分钟。随后将混合物倒入冰中，用二氯甲烷稀释，用二氯甲烷萃取两次。合并的有机层经MgO₄干燥，过滤，浓缩。残余物经ISCO硅胶柱层析法纯化(40g金柱，使用90%己烷和10%二氯甲烷，至高达80%己烷和10%二氯甲烷和10%乙酸乙酯)。同时收集两种异构体，以得到白色结晶固体状的标题物质(720 mg，78%)。

2-氟-6-羟基-4-甲氧基苯甲醛(主要异构体，不期望的)

¹H NMR (400 MHz、CDCl₃) δ ppm：11.91 (s，1H)，10.05 (s，1H)，6.17-6.25 (m，1H)，3.86 (s，3H)。

4-氟-2-羟基-6-甲氧基苯甲醛(次要异构体，期望的)

¹H NMR (400 MHz、CDCl₃) δ ppm：12.23-12.42 (m，1H)，10.22 (s，1H)，6.23-6.27 (m，1H)，6.13 (dd，J=10.96，2.35 Hz，1H)，3.90 (s，3H)。

36B. 1-(6-氟-4-甲氧基苯并呋喃-2-基)乙酮

向4-氟-2-羟基-6-甲氧基苯甲醛和2-氟-6-羟基-4-甲氧基苯甲醛(实施例36A，4.63 g，27.2 mmol)的混合物在乙腈(49.7 mL，952 mmol)中的溶液中加入碘化钾(0.903 g，5.44 mmol)、碳酸铯(9.75 g，29.9 mmol)和1-氯丙-2-酮(2.395 mL，28.6 mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时，用0.1当量的碳酸铯处理，加热至60℃，保持1小时，并且加热至80℃，保持另一小时。让反应物在室温下过夜，随后经小的二氧化硅垫过滤，用乙酸乙酯(约500 mL)漂洗。浓缩后得到的残余物通过硅胶层析法纯化(ISCO，120g二氧化硅，使用100%甲苯，使用在315 nm下的UV，随后极性随着时间提高至高达10%乙酸乙酯)。将级分蒸发，以得到期望的/不期望的异构体的7:1混合物，将其用乙酸乙酯重结晶过夜。得到无色晶体状的标题物质(216 mg，3.8%)。LC (方法B)：1.928分钟。LCMS (APCI)计算值C₁₁H₁₀FO₃ [M+H]⁺ m/z 209.06，实测值209.1。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：7.55-7.61 (m，1H)，6.78-6.99 (m，1H)，6.46-6.53 (m，1H)，3.96 (s，3H)，2.55-2.60 (m，3H)。

36C. 1-(6-氟-4-羟基苯并呋喃-2-基)乙酮

向1-(4,6-二甲氧基苯并呋喃-2-基)乙酮(实施例36B，216 mg，1.038 mmol)在氯苯(3.69 mL，36.3 mmol)中的搅拌溶液中加入三氯化铝(277 mg，2.075 mmol)。在85℃下加热3小时后，混合物用冰和1.0N HCl猝灭，用乙酸乙酯(4×)萃取。合并的有机层经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。残余物经硅胶层析法纯化(BIOTAGE® 24g，用己烷和乙酸乙酯的梯度洗脱)，以得到白色固体状的标题物质(0.191 g，95%)。LC (方法B)：1.794分钟。LCMS (APCI)计算值C₁₀H₈FO₃ [M+H]⁺ m/z 195.05，实测值195.9。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：7.58 (s，1H)，6.87-6.93 (m，1H)，6.46-6.53 (m，1H)，5.62 (s，1H)，2.60 (s，3H)。

36D. 1-(6-氟-4-((2-苯基噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)乙酮

将苯加入到1-(6-氟-4-羟基苯并呋喃-2-基)乙酮(实施例36C，178 mg，0.917 mmol)中，将混合物超声处理30秒，真空浓缩，以除去原料中的痕量的水。加入三苯基膦(373 mg，1.421 mmol)，将混合物在高真空下干燥10分钟。加入(2-苯基噻唑-4-基)甲醇(实施例3B，175 mg，0.917 mmol)和THF (15 mL)，将混合物超声处理/加热5分钟。经1小时逐滴加入二异丙基偶氮二甲酸酯(275 µL，1.412 mmol)在THF (2 mL)中的溶液，将所得到的黄色溶液超声处理15分钟，在室温下搅拌过夜。混合物在二氯甲烷中稀释，用饱和NaHCO₃、盐水洗涤，经MgO₄干燥，浓缩。残余物经硅胶层析法纯化(ISCO 24 g金柱，使用5%乙酸乙酯/己烷至40% (10%增量))，以得到白色固体状的标题物质(132 mg，32%)。LC (方法B)：2.613分钟。LCMS (APCI)计算值C₂₀H₁₅FNO₃S [M+H]⁺ m/z 368.07，实测值368.2。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：7.94-8.02 (m，2H)，7.62-7.67 (m，1H)，7.44-7.51 (m，3H)，7.38 (s，1H)，6.91-6.96 (m，1H)，6.64-6.72 (m，1H)，5.39 (d，J=0.78 Hz，2H)，2.58 (s，3H)。

36E. 2-溴-1-(6-氟-4-((2-苯基噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)乙酮

向1-(6-氟-4-((2-苯基噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)乙酮(实施例36D，132 mg，0.359 mmol)在乙酸乙酯(5 mL)中的悬浮液中加入溴化铜(II)(160 mg，0.719 mmol)，将混合物加热至80℃，保持48小时。将固体滤除，用冷EtOAc漂洗。固体经硅胶层析法纯化(ISCO 12g，使用二氯甲烷和乙酸乙酯(95:5))，提供类白色固体状的标题物质(55mg，34%)。LC (方法B)：2.424分钟。LCMS (APCI)计算值C₂₀H₁₄BrFNO₃S [M+H]⁺ m/z 445.99，实测值446.0。

36F. 2-溴-6-(6-氟-4-((2-苯基噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

在2-5 mL微波压力小瓶中加入2-溴-1-(6-氟-4-((2-苯基噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)乙酮(实施例36E，35 mg，0.078 mmol)在丙-2-醇(2 mL)中的溶液，接着加入5-溴-1,3,4-噻二唑-2-胺(16.2 mg，0.09 mmol)。在微波炉中，将反应物加热至80℃过夜，并且加热至150℃，保持1小时。随后将反应混合物倒入二氯甲烷(8 mL)和饱和NaHCO₃ (2 mL)的混合物中，用二氯甲烷萃取两次。有机萃取物经MgO₄干燥，过滤，浓缩。残余物通过硅胶层析法纯化(ISCO 12g金柱使用100%二氯甲烷，随后1%乙酸乙酯，随后2%乙酸乙酯/二氯甲烷)，以得到带黄色固体状的标题物质(18 mg，43%)。LC (方法B)：2.754分钟。LCMS (APCI)计算值C₂₂H₁₃BrFN₄O₂S₂ [M+H]⁺ m/z 526.96，实测值527.0。

实施例36. 6-(6-氟-4-((2-苯基噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)-2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

将2-溴-6-(6-氟-4-((2-苯基噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑(17 mg，0.032 mmol)溶解于二氯甲烷(1.3 mL)中(需要一些热量和超声处理)。随后加入甲醇 (0.3 mL)，接着一次性加入甲醇钠(14.74 µL，0.064 mmol)。将反应物在室温下搅拌25分钟，随后用1.0 N HCl猝灭，搅拌，直至反应颜色变为黄色。随后加入饱和NaHCO₃，用二氯甲烷(4×)萃取。合并的有机层经MgO₄干燥，过滤，浓缩。残余物通过硅胶柱层析法纯化(BIOTAGE® 12g柱，使用100%二氯甲烷至5%乙酸乙酯/二氯甲烷(1%的增量)，以得到带黄色固体状的标题物质(10 mg，64%)。LC (方法A)：2.488分钟。HRMS(ESI)计算值C₂₃H₁₅FN₄O₃S₂ [M+H]⁺ m/z 479.0570，实测值479.0661。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：7.94-8.03 (m，2H)，7.89 (s，1H)，7.43-7.53 (m，3H)，7.39 (s，1H)，7.19 (s，1H)，6.85-6.94 (m，1H)，6.59-6.68 (m，1H)，5.40 (s，2H)，4.23 (s，3H)。

实施例37

6-(6-氯-4-((2-苯基噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)-2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

37A. 4-氯-2,6-二甲氧基苯甲醛

在-78℃下，在N₂气氛下，使用注射器泵，经30分钟时间段，向1-氯-3,5-二甲氧基苯(5 g，29.0 mmol)和TMEDA (4.37 mL，29.0 mmol)在乙醚(100 mL，962 mmol)中的溶液逐滴加入BuLi (19.91 mL，31.9 mmol)。在-78℃下搅拌4小时后，加入DMF，将反应混合物继续搅拌1.5小时，随后加入1N HCl (~30 mL) (均在-78℃下)。将反应混合物温热至室温，用乙酸乙酯萃取。将有机相干燥(MgO₄)，过滤，浓缩至干。残余物通过ISCO纯化，使用己烷/EtOAc作为洗脱液。将含有期望的产物的级分浓缩至干，以得到浅黄色固体状的标题物质(1.97 g，9.82 mmol，33.9%收率)。LC (方法B)：1.924分钟。LCMS (APCI)计算值C₉H₁₀ClO₃ [M+H]⁺ m/z 201.03，实测值201.0。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：10.28 (s，1H)，6.87 (s，2H)，3.86 (s，6H)。

37B. 4-氯-2-羟基-6-甲氧基苯甲醛

在-78℃下，4-氯-2,6-二甲氧基苯甲醛(实施例37A，1.95 g，9.72 mmol)在DCM (20 mL，311 mmol)中的搅动的溶液中缓慢加入三溴化硼(9.72 mL，9.72 mmol)。将反应混合物在-78℃下搅拌10分钟，随后温热至室温，搅拌1小时，同时通过LCMS监测反应进程。一旦所有原料已消耗，用水猝灭反应，用DCM萃取。有机相用盐水洗涤，干燥(MgO₄)，过滤，浓缩至干，以得到紫色固体状的标题物质(1.79 g，9.59 mmol，99%收率)。LC (方法B)：2.199分钟。LCMS (APCI)计算值C₈H₈ClO₃ [M+H]⁺ m/z 187.02，实测值187.0。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：11.89 (s，1H)，10.20 (s，1H)，6.75 (t，J=2.0 Hz，1H)，6.66 (m，1H)，3.91 (s，1H)。

37C. 1-(6-氯-4-甲氧基苯并呋喃-2-基)乙酮

4-氯-2-羟基-6-甲氧基苯甲醛(实施例37B，1.79 g，9.59 mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(15 mL，9.59 mmol)中的搅动的溶液中装入碳酸铯(3.75 g，11.51 mmol)和1-氯丙-2-酮(0.975 mL，11.51 mmol)。反应混合物在可密封的容器中在65℃下加热7小时，经Whatman滤纸过滤，以除去不溶性物质，用DCM漂洗，随后用饱和NaHCO₃洗涤。将有机相干燥(MgO₄)，过滤，浓缩至干。残余物通过ISCO纯化，使用己烷/EtOAc作为洗脱液。将含有期望的产物的级分浓缩，以得到浅黄色固体状的标题物质(1.43 g，6.37 mmol，66%收率)。LC (方法A)：1.952分钟。LCMS (APCI)计算值C₁₁H₁₀ClO₃ [M+H]⁺ m/z 225.03，实测值225.0。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：7.94 (d，J=0.8 Hz，1H)，7.49 (dd，J=0.8，1.6 Hz，1H)，6.97 (d，J=1.6 Hz，1H)，3.97 (s，3H)。

37D. 1-(6-氯-4-羟基苯并呋喃-2-基)乙酮

经10分钟时间段，向1-(6-氯-4-甲氧基苯并呋喃-2-基)乙酮(实施例37C，1.43 g，6.37 mmol)在氯苯(15 mL，148 mmol)中的搅动的溶液中分批加入氯化铝(3.40 g，25.5 mmol)。随后将反应容器密封，在100℃下加热40分钟，随后冷却至室温，倒在碎冰上(用EtOAc漂洗搅拌棒)。搅拌30分钟，随后用乙酸乙酯萃取。将有机相干燥(MgO₄)，过滤，浓缩至干。残余物通过ISCO纯化，使用己烷/EtOAc作为洗脱液。将含有期望的产物的级分浓缩，以得到米色固体状的标题物质(1.18 g，5.60 mmol，88%收率)。LC (方法A)：1.783分钟。LCMS (APCI)计算值C₁₀H₈ClO₃ [M+H]⁺ m/z 211.02，实测值211.0。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：11.01 (s，1H)，7.89 (s，1H)，6.72 (s，1H)，2.52 (s，3H)。

37E. 1-(4-(苄氧基)-6-氯苯并呋喃-2-基)乙酮

在室温下，1-(6-氯-4-羟基苯并呋喃-2-基)乙酮(实施例37D，1.18 g，5.60 mmol)在无水DMF (10 mL，129 mmol)中的搅动的溶液中装入K₂CO₃ (0.774 g，5.60 mmol)和DMF。将反应混合物搅拌1.5小时，随后在乙酸乙酯和水之间分配。有机相用盐水洗涤，干燥(MgO₄)，过滤，浓缩至干。残余物通过ISCO纯化，使用己烷/EtOAc作为洗脱液。将含有期望的产物的级分浓缩，以得到琥珀色油状的标题物质(1.57 g，5.22 mmol，93%收率)。LC (方法B)：2.420分钟。LCMS (APCI)计算值C₁₇H₁₄ClO₃ [M+H]⁺ m/z 301.06，实测值301.0。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：8.00 (d，J=0.8 Hz，1H)，7.53 (m，3H)，7.44 (m，2H)，7.38 (m，1H)，7.10 (d，J=1.6 Hz，1H)，5.53 (s，2H)，2.54 (s，3H)。

37F. 1-(4-(苄氧基)-6-氯苯并呋喃-2-基)-2-溴乙酮

在配备搅拌棒并且在氮气气氛下的火焰干燥的200 ml圆底烧瓶中装入无水THF (12 mL)，接着装入二(三甲基甲硅烷基)氨基化锂(6.22 mL，6.22 mmol)。将混合物冷却至-78℃，用经由注射器泵经10分钟逐滴加入的1-(4-(苄氧基)-6-氯苯并呋喃-2-基)乙酮(实施例37E，1.56 g，5.19 mmol)在THF (6ml+2ml洗液)中的溶液处理。将所得到的混合物在-78℃下搅拌45分钟，随后装入通过注射器泵经5分钟逐滴加入的三甲基氯硅烷(0.769 mL，6.02 mmol)，随后搅拌另外20分钟。移除冷却浴，让混合物温热至+10℃，保持30分钟。反应混合物用冷乙酸乙酯(80 mL)、饱和NaHCO₃ (12 mL)和冰的混合物猝灭。将有机相干燥(MgO₄)，搅拌~5分钟，以除去所有痕量的水，过滤，浓缩至干，以得到黄色油状的甲硅烷基烯醇醚，将其与甲苯(4 mL)共蒸发。将甲硅烷基烯醇醚溶解于无水THF (20 mL)中，冷却至-30℃ (采用由1:1 CaCl₂:水制备的冷却浴，使用干冰，浴稳定在约-30至-45℃)，用NaHCO₃ (~50 mg)处理，接着经15分钟以小份加入N-溴代琥珀酰亚胺(0.923 g，5.19 mmol)。经2小时让反应混合物温热至0℃(通过LCMS监测)，随后通过加入乙酸乙酯(100 mL)和饱和NaHCO₃猝灭。有机相用盐水洗涤，干燥(MgO₄)，蒸发，以得到橙色固体，其通过ISCO纯化，使用己烷/EtOAc作为洗脱液。将含有期望的产物的级分浓缩，以得到黄色固体状的标题物质(1.48 g，3.51 mmol，67.6%收率)。LC (方法B)：2.528分钟。LCMS (APCI)计算值C₁₇H₁₃BrClO₃ [M+H]⁺ m/z 378.97，实测值379.0。

37G. 6-(4-(苄氧基)-6-氯苯并呋喃-2-基)-2-溴咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

可密封的容器中装入1-(4-(苄氧基)-6-氯苯并呋喃-2-基)-2-溴乙酮(实施例37F，1.48 g，3.51 mmol)、5-溴-1,3,4-噻二唑-2-胺(0.632 g，3.51 mmol)和IPA (25 mL，324 mmol)。将反应混合物在80℃油浴中加热6小时，随后在微波中在150℃下加热1小时。让反应混合物静置1小时，将不溶性物质滤除，用MeOH漂洗，以得到褐色固体状的期望的产物(1.19 g，2.58 mmol，73.6%收率)。LC (方法A)：2.549分钟。LCMS (APCI)计算值C₁₉H₁₂BrClN₃O₂S [M+H]⁺ m/z 459.95，实测值460.0。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：8.74 (s，1H)，7.55-7.50 (m，2H)，7.45-7.34 (m，4H)，7.17 (d，J=0.8 Hz，1H)，7.02 (d，J=1.6 Hz，1H)，5.32 (s，2H)。

37H. 6-(4-(苄氧基)-6-氯苯并呋喃-2-基)-2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

向6-(4-(苄氧基)-6-氯苯并呋喃-2-基)-2-溴咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑(实施例37G，1.18 g，2.56 mmol)在DCM (40 mL，622 mmol)和甲醇(10 mL，247 mmol)中的搅动的溶液中加入甲醇钠(1.164 mL，5.12 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时15分钟，同时通过TLC监测(7:3己烷:EtOAc)。反应混合物用1N HCl猝灭，用DCM萃取。有机相用盐水洗涤，干燥(MgO₄)，过滤，浓缩至干。残余物用MeOH研磨(超声处理)，将固体物质滤除，用MeOH漂洗，吸干，以得到褐色固体状的期望的化合物(859 mg，2.086 mmol，81%收率)。LC (方法A)：2.478分钟。LCMS (APCI)计算值C₂₀H₁₅ClN₃O₃S [M+H]⁺ m/z 412.05，实测值412.0。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：8.50 (s，1H)，7.52 (m，2H)，7.43 (m，2H)，7.36 (m，2H)，7.09 (d，J=0.8 Hz，1H)，7.00 (d，J=1.6 Hz，1H)，5.31 (s，2H)，4.21 (s，3H)。

37I. 6-氯-2-(2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-6-基)苯并呋喃-4-醇

在N₂气氛下，将6-(4-(苄氧基)-6-氯苯并呋喃-2-基)-2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑(实施例37H，0.85 g，2.064 mmol)和五甲基苯(2.142 g，14.45 mmol)在DCM中的搅动的溶液冷却至-78℃，随后经~4分钟逐滴加入三氯化硼(5.16 mL，5.16 mmol)。通过TLC监测反应，使用1:1己烷:EtOAc作为洗脱液。将反应混合物在-78℃下搅拌30分钟，随后加入(在-78℃下)水(40 mL)和饱和NaHCO₃ (5 mL)的混合物，搅拌混合物，直至达到环境温度(从冷却浴移除)。将固体沉淀物滤除，用乙醚漂洗，随后干燥过夜，以得到米色固体状的标题物质(441 mg，1.371 mmol，66.4%收率)。滤液用DCM萃取。有机相用盐水洗涤，干燥(MgO₄)，浓缩至干。残余物通过ISCO纯化，使用DCM/EtOAc作为洗脱液。将含有期望的产物的级分浓缩，以得到米色固体状的标题物质(25 mg，0.078 mmol，3.77%收率)。LC (方法A)：2.167分钟。LCMS (APCI)计算值C₁₃H₉ClN₃O₃S [M+H]⁺ m/z 322.00，实测值322.0。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：10.50 (br. S，1H)，8.45 (s，1H)，7.17 (dd，J=0.8，1.6 Hz，1H)，7.09 (d，J=0.8 Hz，1H)，6.67 (d，J=2.0 Hz，2H)，4.21 (s，3H)。

实施例37. 6-(6-氯-4-((2-苯基噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)-2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

向含有6-氯-2-(2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-6-基)苯并呋喃-4-醇(实施例37I，25 mg，0.078 mmol)和(2-苯基噻唑-4-基)甲醇(实施例3B，37.2 mg，0.194 mmol)在无水THF (4 mL)中的溶液的火焰干燥的100 mL圆底烧瓶中加入三丁基膦(0.050 mL，0.194 mmol)。向所得到的溶液中装入经由注射器泵经30分钟逐滴加入的ADDP (49.0 mg，0.194 mmol)在THF (1 mL)中的溶液。搅拌1.5小时后，反应混合物用EtOAc稀释，随后用1N HCl、饱和NaHCO₃、水和盐水洗涤。将有机相干燥(MgO₄)，随后浓缩至干。残余物通过ISCO纯化，使用0-10%乙醚/DCM。将含有期望的产物的级分浓缩，以得到米色固体状的标题物质(20 mg，0.040 mmol，52.0%收率)。LC (方法A)：2.534分钟。LCMS (APCI)计算值C₂₃H₁₆ClN₄O₃S₂ [M+H]⁺ m/z 495.03，实测值495.0。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：8.49 (s，1H)，7.99-7.96 (m，2H)，7.93 (s，1H)，7.55-7.50 (m，3H)，7.40 (dd，J=0.8，1.6 Hz，1H)，7.15 (dd，J=0.4，1.6 Hz，1H)，7.14 (d，J=0.8 Hz，1H)，5.43 (s，2H)，4.21 (s，3H)。

实施例38

2-甲氧基-6-(4-((2-苯基噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

38A. 5-(苄氧基)-2,2-二甲基-4H-苯并[d][1,3]二氧杂环己烯-4-酮

5-羟基-2,2-二甲基-4H-苯并[d][1,3]二氧杂环己烯-4-酮(6.00 g，30.9 mmol) (Hadfield，A.等人，Synthetic Communications(合成通讯)，24(7):1025-1028 (1994))在N,N-二甲基甲酰胺(35 mL)中的溶液用一次性加入的粉末状无水碳酸钾(5.15 g，37.26 mmol)处理。将所得到的混合物真空搅拌10分钟，随后用氮气吹扫。将反应烧瓶放置在水浴(22℃)中，用经15分钟逐滴加入的苄基溴(5.55 g，32.16 mmol)处理。随后将所得到的混合物在22℃下搅拌18小时。将形成的固体过滤，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤。将滤液真空蒸发，残余的油用乙酸乙酯(300 mL)稀释，用冷0.1 N盐酸、饱和碳酸氢钠和盐水洗涤。经无水硫酸镁干燥后，蒸发溶剂，得到稠厚的浆。在硅胶上层析(4×13 cm，洗脱甲苯-乙酸乙酯0-5%)，得到8.78 g (100%收率)白色固体状的标题物质。LC (方法A)：1.982分钟。¹H NMR (CDCl₃，600 MHz) δ ppm：1.69 (s，6H)，5.23 (s，2H)，6.53 (d，J=8.2 Hz，1H)，6.62 (d，J=8.4 Hz，1H)，7.24-7.3 (m，1H)，7.34-7.4 (m，3 H)，7.52 (宽d，J=7.4 Hz 2H)。

38B. 2-(苄氧基)-6-羟基苯甲醛

将5-(苄氧基)-2,2-二甲基-4H-苯并[d][1,3]二氧杂环己烯-4-酮(实施例38A，4.00 g，14.07 mmol)在二氯甲烷(80 mL)中的溶液冷却至-78℃，用经20分钟逐滴加入的二异丁基氢化铝(6.00 g，42.2 mmol)在甲苯(40 mL)中的溶液处理。随后将所得到的混合物在-78℃下搅拌3小时。通过小心加入经15分钟逐滴加入的甲醇(5 mL)，接着加入经15分钟逐滴加入的4 N盐酸(20 mL)，猝灭反应混合物。随后移除冷却浴，经10分钟加入另外的80 mL 4N盐酸，将混合物在22℃下剧烈搅拌4小时。反应混合物用乙酸乙酯(200 mL)稀释，用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，真空蒸发。所得到的油在硅胶上层析(4×10 cm，洗脱甲苯)，以得到2.25 g (70%收率)浅黄色固体状的标题物质。LC (方法A)：2.219分钟。HRMS(ESI)计算值C₁₄H₁₃O₃ [M+H]⁺ m/z 229.0859，实测值229.0859。¹H NMR (CDCl₃，600 MHz) δ ppm：5.12 (s，2H)，6.43 (d，J=8.25 Hz，1H)，6.52 (d，J=8.46 Hz，1H)，7.34-7.4 (m，6 H)，10.39 (s，1H)，11.95 (s，1H)。

38C. 1-(4-(苄氧基)苯并呋喃-2-基)乙酮

2-(苄氧基)-6-羟基苯甲醛(实施例38B，11.10 g，48.63 mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(120 mL)中的溶液用一次性加入的粉末状无水碳酸铯(15.8 g，48.63 mmol)处理。将所得到的混合物真空搅拌10分钟，随后用氮气吹扫。将反应烧瓶放置在水浴(22℃)中，用经10分钟逐滴加入的氯丙酮(4.65 mL，58.4 mmol)处理。随后将所得到的混合物在22℃下搅拌18小时(通过tlc，没有起始醛剩下，并且形成中间体烷基化的醛)。随后将反应混合物在真空(10毫巴)下保持15分钟，以除去任何未反应的氯丙酮，随后用氮气吹扫。随后加入无水碳酸铯(1.0 g，3.1 mmol)，将混合物在55℃下加热，搅拌40小时(24小时和32小时后，加入更多碳酸铯，1 g)，直至通过TLC监测，中间体烷基化的醛完全转化为苯并呋喃。将固体过滤，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤。将滤液真空蒸发，残余的油用乙酸乙酯(400 mL)稀释，用冷0.1 N盐酸、饱和碳酸氢钠和盐水洗涤。经无水硫酸镁干燥后，蒸发溶剂，得到稠厚的浆。在硅胶上层析(4.5×12 cm，洗脱甲苯-乙酸乙酯2-4%)，得到11.67 g (90%收率)浅黄色固体状的标题苯并呋喃。由乙酸乙酯(40 mL)和己烷(40 mL)的混合物重结晶，得到无色棱晶(10.50 g)。LC (方法A)：2.162分钟。HRMS(ESI)计算值C₁₇H₁₅O₃ [M+H]⁺ m/z 267.1016，实测值267.1022。¹H NMR (CDCl₃，600 MHz) δ ppm：2.56 (s，3H)，5.20 (s，2H)，6.73 (d，J=8.0 Hz，1H)，7.17 (d，J=8.4 Hz，1H)，7.3-7.5 (m，6H)，7.63 (s，1H)。

38D. 1-(4-(苄氧基)苯并呋喃-2-基)-2-溴乙酮

250-mL三颈烧瓶配备有磁力搅拌棒并且用氮气气氛吹扫，装入无水四氢呋喃(40 mL)，接着装入21.6 mL (21.6 mmol)二(三甲基甲硅烷基)氨基化锂在四氢呋喃中的1M溶液。将混合物冷却至-78℃，用经10分钟逐滴加入的1-(4-(苄氧基)苯并呋喃-2-基)乙酮 (实施例38C，5.00 g，18.77 mmol)在四氢呋喃(20 mL)中的溶液处理。随后将所得到的混合物在-78℃下搅拌45分钟。随后经5分钟逐滴加入三甲基氯硅烷(2.74 mL，21.6 mmol)，将所得到的溶液在-78℃下搅拌另外20分钟。随后移除冷却浴，经30分钟，让混合物温热至室温。随后，通过向乙酸乙酯(300 mL)的冷溶液中加入饱和碳酸氢钠(40 mL)和冰，猝灭反应混合物。有机相经无水硫酸镁快速干燥(磁力搅拌)，真空蒸发，以得到油状的甲硅烷基烯醇醚，将其与甲苯(20 mL)共蒸发。随后将甲硅烷基烯醇醚溶解于无水四氢呋喃(80 mL)中，冷却至-25℃，用固体碳酸氢钠(0.10 g)处理，接着经10分钟以小份加入N-溴代琥珀酰亚胺(3.34 g，18.8 mmol)。经2小时，让反应混合物温热至0℃，随后通过加入乙酸乙酯(350 mL)和饱和碳酸氢钠而猝灭。有机相用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，蒸发，以得到橙色油。在硅胶上层析(4.5×12 cm，洗脱甲苯-乙酸乙酯0-1%)，得到6.13 g黄色固体状的标题溴甲基酮。由乙酸乙酯(20 mL)和己烷(40 mL)重结晶，得到浅黄色棱晶(4.93 g，76%收率)。LC (方法A)：2.215分钟。HRMS(ESI)计算值C₁₇H₁₄BrO [M+H]⁺ m/z 345.0121，实测值345.0109。¹H NMR (CDCl₃，600 MHz) δ ppm：4.39 (s，2H)，5.20 (s，2H)，6.75 (d，J=7.86 Hz，1H)，7.17 (d，J=8.25 Hz，1H)，7.34-7.46 (m，6H)，7.78 (s，1H)。

38E. 6-(4-(苄氧基)苯并呋喃-2-基)-2-溴咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

在配备磁力搅拌棒的压力烧瓶中，将1-(4-(苄氧基)苯并呋喃-2-基)-2-溴乙酮(实施例38D，3.00 g，8.69 mmol)和5-溴-1,3,4-噻二唑-2-胺(1.80 g，10.0 mmol)在异丙醇(100 mL)中的混合物在80℃下加热20小时(20分钟后均匀，随后2小时后形成沉淀物)。随后将冷却的混合物转移至五个20 mL微波小瓶，随后在微波设备中加热至150℃，保持30分钟。每一个小瓶随后用二氯甲烷(250 mL)稀释，用饱和碳酸氢钠(25 mL)和盐水(25 mL)洗涤，经无水硫酸镁干燥。将级分合并，真空浓缩。橙褐色残余的固体在硅胶上层析(4×10 cm，用二氯甲烷缓慢洗脱)，得到2.82 g标题咪唑并噻二唑，被一些1-(4-(苄氧基)苯并呋喃-2-基)乙酮污染。固体物质用乙酸乙酯(15 mL)研磨，过滤，用乙酸乙酯(10 ml)洗涤，真空干燥，以得到2.37 g (64%收率)类白色固体状的纯的标题咪唑并噻二唑，其原样用于下一步。LC (方法A)：2.425分钟。HRMS(ESI)计算值C₁₉H₁₃BrN₃O₂S [M+H]⁺ m/z 425.9906，实测值425.9893。¹H NMR (CDCl₃，600 MHz) δ ppm：5.21 (s，2H)，6.72 (d，J=8.07 Hz，1H)，7.13 (d，J=8.26 Hz，1H)，7.18 (宽t，1H)，7.25 (s，1H)，7.32 (宽t，1H)，7.38 (宽t，2H)，7.47 (宽d，2H)，8.09 (s，1H)。

38F. 6-(4-(苄氧基)苯并呋喃-2-基)-2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

在22℃下，6-(4-(苄氧基)苯并呋喃-2-基)-2-溴咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑(实施例38E，3.22 g，7.55 mmol)在二氯甲烷(400 mL)和甲醇(50 mL)的混合物中的溶液用一份加入的6.3 mL 25重量%甲醇钠在甲醇中的溶液(30.2 mmol)处理。加入更多甲醇(45 mL)，将混合物搅拌40分钟。通过加入40 mL 1 N盐酸，接着加入10 ml饱和碳酸氢钠，猝灭反应混合物。将溶剂减压蒸发，残余物用二氯甲烷(400 mL)稀释，用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，真空蒸发。白色固体残余物由1,2-二氯乙烷(30 mL)结晶，得到2.19 g白色固体状的标题物质。母液在硅胶上层析(3×10 cm，用二氯甲烷-乙酸乙酯0-1%洗脱)，得到另外0.46 g产物(总产量2.65 g，93%)。LC (方法A)：2.379分钟。HRMS(ESI)计算值C₂₀H₁₆N₃O₃S [M+H]⁺ m/z 378.0907，实测值378.0911。¹H NMR (CDCl₃，600 MHz) δ ppm：4.18 (s，3H)，5.21 (s，2H)，6.71 (dd，J=7.4 Hz和J=0.95 Hz，1H)，7.12-7.17 (m，3H)，7.32 (宽t，1H)，7.38 (宽t，2H)，7.47 (宽d，2H)，7.88 (s，1H)。

38G. 2-(2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-6-基)苯并呋喃-4-醇

在氮气气氛下，将6-(4-(苄氧基)苯并呋喃-2-基)-2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑(实施例38F，2.640 g，6.99 mmol)和五甲基苯(7.25 g，48.9 mmol)在二氯甲烷(400 mL)中的混合物冷却至-78℃，随后用经3分钟逐滴加入的18.2 mL (8.2 mmol)三氯化硼在二氯甲烷中的1 M溶液立即处理。将所得到的混合物在-78℃下搅拌1小时。随后，通过加入一份加入的碳酸氢钠(10.6 g)在水(50 mL)中的溶液猝灭反应混合物。移除冷却浴，将所得到的混合物在室温下搅拌1小时。将形成的固体过滤，用水(50 mL)和二氯甲烷(25 mL)连续洗涤。让滤饼用无水乙醇(10 ml)浸泡，随后吸干。随后将得到的白色固体经五氧化磷真空干燥几天，直至恒重，以得到1.459 g (72%收率)标题物质。合并的滤液和洗液(得自脱保护步骤的有机相和水相)用二氯甲烷(500 mL)稀释，在温水浴中搅拌，直至有机相澄清，在悬浮液中没有明显的固体。收集有机相，经无水硫酸镁干燥，在仍温热时快速过滤。将滤液蒸发，残余物(产物和五甲基苯)用甲苯(20 mL)研磨。过滤收集固体，用甲苯(20 mL)洗涤，真空干燥后，以得到0.239 g (12%收率，84%合并的收率)棕褐色固体状的标题物质。LC (方法A)：1.908分钟。HRMS(ESI)计算值C₁₃H₁₀N₃O₃S [M+H]⁺ m/z 288.0437，实测值288.0446。¹H NMR (DMSO-d₆，600 MHz) δ ppm：4.46 (s，3H)，6.58 (d，J=7.8 Hz，1H)，6.97 (d，J=8.15 Hz，1H)，7.0-7.07 (m，3H)，8.40 (s，1H)。

实施例38. 2-甲氧基-6-(4-((2-苯基噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

在50 ml烧瓶中，将2-(2-甲氧基咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-6-基)苯并呋喃-4-醇(实施例38G，0.100 g，0.349 mmol)、三苯基膦(0.165 g，0.627 mmol)和(2-苯基噻唑-4-基)甲醇(实施例3B，0.080 g，0.418 mmol)的混合物在真空下保持10分钟，随后用氮气吹扫。加入无水四氢呋喃(10 mL)，将所得到的混合物稍微温热，在超声浴中保持5分钟。冷却的混合物(仍为不均匀的)在22℃下用经1小时逐滴加入的二异丙基偶氮二甲酸酯(0.113 g，0.558 mmol)在四氢呋喃(2 mL)中的溶液处理。随后将混合物在2℃下搅拌4小时。通过加入二氯甲烷(100 mL)和饱和碳酸氢钠(10 mL)，猝灭澄清的反应混合物。有机相用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，真空浓缩。残余物在硅胶上层析(2.5×12 cm，洗脱二氯甲烷-乙酸乙酯0-3%)，接着期望的级分由乙酸乙酯(8 mL)结晶，得到0.028 g (24%收率)白色固体状的标题物质。LC (方法A)：2.426分钟。HRMS(ESI)计算值C₂₃H₁₇N₄O₃S₂ [M+H]⁺ m/z 461.0737，实测值461.0926。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：4.22 (s，3H)，5.45 (d，J=0.78 Hz，2H)，6.80 (dd，J=7.04，1.57 Hz，1H)，7.15-7.21 (m，2H)，7.22 (s，1H)，7.38 (s，1H)，7.42-7.51 (m，3H)，7.92 (s，1H)，7.95-8.03 (m，2H)。

实施例39

4-(((6-甲氧基-2-(6-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-基)苯并呋喃-4-基)氧基)甲基)-2-苯基噻唑

39A. 2-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-6-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪

在150 mL压力烧瓶中，将6-甲基哒嗪-3-胺(1.52 g，13.93 mmol)、1-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-2-溴乙酮(实施例1E，5.00 g，13.33 mmol)和2-丙醇(110 mL)的混合物在65℃下加热。30分钟加热后，混合物几乎均匀，40分钟后，再次沉淀。将混合物加热共48小时。冷却的反应混合物用二氯甲烷(600 mL)稀释，用饱和碳酸氢钠、盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥。蒸发，得到橙褐色固体，将其在硅胶上层析(4×9 cm，洗脱二氯甲烷-乙酸乙酯0-5%)，以得到橙褐色固体状的标题物质(3.64 g)。固体用乙酸乙酯(30 mL，部分可溶)沸腾，在室温下静置2小时。过滤收集晶体，真空干燥过夜，以得到浅黄褐色针状的标题物质(3.440 g，67%)。LC (方法A)：2.279分钟。HRMS(ESI)计算值C₂₃H₂₀N₃O₃ [M+H]⁺ m/z 386.1499，实测值386.1532。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：2.59 (s，3 H)，3.86 (s，3 H)，5.21 (s，2 H)，6.43 (d，J=1.96 Hz，1 H)，6.75 (宽d，1 H)，6.94 (d，J=9.39 Hz，1 H)，7.31-7.38 (m，2 H)，7.38-7.45 (m，2 H)，7.50 (宽d，J=7.43 Hz，2 H)，7.82 (d，J=9.39 Hz，1 H)，8.19 (s，1 H)。

39B. 6-甲氧基-2-(6-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-基)苯并呋喃-4-醇

在1 L烧瓶中，将2-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-6-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪(实施例39A，1.00 g，2.59 mmol)在二氯甲烷(420 mL)和甲醇(150 mL)的混合物中的溶液经10%钯/碳(0.30 g，即，30 mg Pd)和在1大气压氢气下氢化6小时。将反应混合物在真空下保持2分钟，随后用氮气吹扫。将催化剂过滤，用温热的二氯甲烷-甲醇(8:2，100 mL)洗涤，将合并的滤液减压浓缩。黄色残余物与1,2-二氯乙烷(30 mL)一起沸腾，在室温下静置18小时。将固体过滤(通过NMR，含有甲醇)，在120℃下真空干燥12小时，以得到黄色固体状的标题物质(0.760 g，99%收率)。LC (方法A)：1.844分钟。¹H NMR (DMSO-d₆，400 MHz) δ ppm：2.54 (s，3H)，3.77 (s，3H)，6.28 (d，J=1.96 Hz，1H)，6.70 (dd，J=1.96，1.17 Hz，1H)，7.20 (d，J=9.39 Hz，1H)，7.24 (d，J=0.78 Hz，1H)，8.03 (d，J=9.78 Hz，1H)，8.50 (s，1H)，10.10 (br s，1H)。

实施例39. 4-(((6-甲氧基-2-(6-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-基)苯并呋喃-4-基)氧基)甲基)-2-苯基噻唑

在100 mL圆底烧瓶中，在真空和N₂下，将6-甲氧基-2-(6-甲基咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-基)苯并呋喃-4-醇(实施例39B，0.190 g，0.643 mmol)和4-(溴甲基)-2-苯基噻唑(溴化物的表，0.180 g，0.708 mmol)在DMF (5 mL)中的悬浮液吹扫10分钟。反应物用碳酸钾(0.24 g，1.737 mmol)处理，并且在22℃下搅拌18小时，随后用DCM稀释，用水(1×)、盐水(1×)洗涤。有机层经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。残余物通过硅胶层析法纯化(2.5×10 cm，0%-50% EtOAc/CH₂Cl₂)，以得到不纯的标题物质(0.198 g，66%)。将固体在热的乙酸乙酯中研磨，以提供纯的标题物质(0.176 g)。LC (方法A)：2.414分钟。HRMS(ESI)计算值C₂₆H₂₁N₄O₃S [M+H]⁺ m/z 469.1329，实测值469.1379。¹H NMR (CDCl₃，400 MHz) δ ppm：2.57 (s，3H)，3.84 (s，3 H)，5.39 (s，2 H)，6.46 (d，J=1.96 Hz，1 H)，6.74 (宽d，1 H)，6.91 (d，J=9.1 Hz，1 H)，7.34 (s，1 H)，7.36 (s，1 H)，7.39-7.46 (m，3 H)，7.80 (d，J=9.1 Hz，1 H)，7.90-8.0 (m，2 H)，8.19 (s，1 H)。

实施例40

(S)-2-(1-氟乙基)-6-(6-甲氧基-4-((2-苯基噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

40A. (S)-5-(1-氟乙基)-1,3,4-噻二唑-2-胺

在350 mL可密封的压力容器中装入硫代半卡巴肼(11.17 g，122.5 mmol)和无水二氧杂环己烷(100 mL)，在N₂气氛下，在0℃下冷却混合物。向该快速搅拌的混合物中缓慢加入(S)-2-氟丙酸(9.40 g，102.1 mmol，得自Fritz-Langhals，E.，Tetrahedron Asymmetry(四面体不对称性)，981 (1994))在二氧杂环己烷(10 mL)中的溶液。向所得到的混合物中逐滴加入POCl₃ (11.22 mL，122.5 mmol)，随后移除冷却浴，将稠厚的白色浆料在室温下搅拌1小时。随后密封容器，将混合物在90-95℃ (油浴温)下加热5小时。将冷却的混合物在室温下搅拌14小时(注意：这样做只是为了方便并且为任选的)，随后将上清液(两相混合物)倾析，减压浓缩。将下面的相缓慢倒入冰水(250 mL)中，随后也加入浓缩物。将该混合物快速搅拌，直至其基本上为均匀(浑浊的)溶液，随后使用40% NaOH水溶液碱化至pH 9-9.5。将所得到的浆料过滤，滤饼用水洗涤(注意：该米色固体的LC显示其含有仅痕量的期望的产物，因此不再进一步研究)。合并的滤液随后用EtOAc (3×)萃取，将有机相干燥(Na₂SO₄)，蒸发，以得到膏状固体(10.58 g，70%)，根据LC和LCMS，其基本上为纯的产物。该物质原样使用无需进一步纯化。通过快速层析法纯化分析样品[Isco/ 0-20% (MeOH-NH₄OH，9:1)-DCM]，以得到白色固体。LC (方法B)：0.608分钟。MS(ESI)计算值C₄H₆FN₃S m/z：147.03；实测值：148.05 [M+H]⁺。¹H NMR (600 MHz，DMSO-d₆) δ 7.38 (s，2H)，5.82 (dq，J=6.4，48.0 Hz，1H)，1.65 (dd，J=6.4，24.0 Hz，3H)。手性LC：S:R=95:5。

40B. (S)-6-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-2-(1-氟乙基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

在20 mL小瓶中，将1-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-2-溴乙酮(实施例1E，407 mg，1.085 mmol)和(S)-5-(1-氟乙基)-1,3,4-噻二唑-2-胺(实施例40A，202 mg，1.373 mmol)悬浮于2-丙醇(10 ml，130 mmol)中，在80℃下加热18小时。5分钟后，溶液变得均匀。过夜搅拌后，存在沉淀物。将冷却的混合物转移至20 mL微波小瓶，随后在150℃下加热30分钟。将混合物合并，在CH₂Cl₂ (200 mL)中稀释，用饱和NaHCO₃洗涤一次，用盐水洗涤一次，经无水Na₂SO₄干燥，浓缩。残余物在ISCO上纯化，使用REDISEP® Gold 40 g柱(CH₂Cl₂/EtOAc)。粗产物在SiO₂上吸附。收集级分，得到的橙色固体在ACN中研磨两次，以得到浅黄色固体标题物质。LC (方法B)：2.403分钟。MS(ESI)计算值C₂₂H₁₉FN₃O₃S [M+H]⁺ m/z：424.1126；实测值：424.1146。¹H NMR (400 MHz，DMSO-d₆) d ppm 8.61 (s，1H) 7.51 (d，J=7.4 Hz，2H) 7.42 (t，J=7.6 Hz，2H) 7.35 (t，J=7.0 Hz，1H) 7.08 (s，1 H) 6.83-6.85 (m，1H) 6.54 (d，J=1.2 Hz，1H) 6.16 (dq，J=47.1，6.4 Hz，1H) 5.26 (s，2H) 3.80 (s，3H) 1.79 (dd，J=24.5，6.8 Hz，3H)。

40C. (S)-2-(2-(1-氟乙基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-6-基)-6-甲氧基苯并呋喃-4-醇

在氮气气氛下，将(S)-6-(4-(苄氧基)-6-甲氧基苯并呋喃-2-基)-2-(1-氟乙基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑(实施例40B，0.152 g，0.359 mmol)和五甲基苯(0.374 g，2.52 mmol)在二氯甲烷(24 ml，373 mmol)中的混合物冷却至-78℃，随后用经3分钟逐滴加入的1.0M三氯化硼在二氯甲烷中的溶液(1 ml，1.000 mmol)立即处理(以避免结晶)。将所得到的混合物在-78℃下搅拌1小时。通过加入一份加入的碳酸氢钠(0.71 g)的水溶液(12 mL)，猝灭反应混合物。移除冷却浴，将所得到的混合物在室温下搅拌1小时。将形成的固体过滤，用水(8 mL)和二氯甲烷(8 mL)连续洗涤。滤饼用无水乙醇浸泡，吸干。将得到的白色固体在P₂O₅上真空干燥36小时。LC (方法B)：2.038分钟。MS(ESI)计算值C₁₅H₁₃FN₃O₃S [M+H]⁺ m/z：334.0656；实测值：334.0680。¹H NMR (400 MHz，DMSO-d₆) δ ppm 10.06 (s，1H) 8.56 (s，1H) 7.09 (s，1H) 6.67 (s，1H) 6.26-6.28 (m，1H) 6.16 (dq，J=46.9，6.4 Hz，1H) 3.76 (s，3H) 1.80 (dd，J=24.7，6.3 Hz，3H)。

实施例40. (S)-2-(1-氟乙基)-6-(6-甲氧基-4-((2-苯基噻唑-4-基)甲氧基)苯并呋喃-2-基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑

在N₂下，向(S)-2-(2-(1-氟乙基)咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑-6-基)-6-甲氧基苯并呋喃-4-醇(实施例40C，0.050 g，0.150 mmol)、(2-苯基噻唑-4-基)甲醇(实施例3B，0.086 g，0.450 mmol)和三苯基膦(0.118 g，0.450 mmol)的混合物中加入无水THF (3 mL)。向所得到的浅琥珀色溶液中加入经2小时逐滴加入的DIAD (0.087 mL，0.450 mmol)在无水THF (2 mL)中的溶液，以得到浅黄褐色溶液。在室温下搅拌另外的30分钟后，LC显示没有原料剩余。随后减压除去挥发物，以得到琥珀色胶。快速层析法(Isco/0-20%乙醚-DCM)得到几乎无色胶状的产物。该胶用最少体积的MeOH研磨，将所得到的浆料过滤，滤饼用最少体积的MeOH洗涤，随后真空干燥，以得到膏状固体的标题物质(0.048 g，63.2%收率)。将提交样品由MeCN-H₂O冻干，为膏状固体。LC (方法A)：2.453分钟。HRMS(ESI)计算值C₂₅H₂₀FN₄O₃S₂ [M+H]⁺ m/z 507.0955，实测值506.098。¹H NMR (DMSO-d₆，400 MHz) δ ppm：8.67 (s，1H)，8.05-8.02 (m，2H)，7.96 (s，1H)，7.60-7.56 (m，3H)，7.20 (d，J=0.8 Hz，1H)，6.93 (dd，J=0.8，2.0 Hz，1H)，6.73 (d，J=1.6 Hz，1H)，6.23 (dq，J=6.7，47.0 Hz，1H)，5.45 (s，2H)，3.89 (s，3H)，1.86 (d，J=6.7，24.6 Hz，3H)。

生物学

术语"PAR4拮抗剂"表示结合PAR4并且抑制PAR4裂解和/或发信号的血小板聚集的抑制剂。通常，与在对照细胞中的这样的活性相比，PAR4活性以剂量依赖性方式降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。对照细胞为未经化合物处理的细胞。PAR4活性通过本领域的任何标准方法测定，包括本文描述的那些(例如在表达PAR4的细胞中的钙转移、血小板聚集、血小板活化测定法测量，例如，钙转移、p-选择蛋白或CD40L释放，或者血栓形成和止血模式)。术语"PAR4拮抗剂"还包括抑制PAR1和PAR4二者的化合物。

期望发现与已知的抗血小板药物相比，在作为实例给出的以下种类中的一个或多个（但不打算局限于此）中具有有利和提高特性的化合物：(a) 药代动力学性质，包括口服生物利用度、半衰期和清除率；(b) 药物性质；(c) 剂量要求；(d) 降低血液浓度峰-谷特性的因素；(e) 提高在受体处活性药物的浓度的因素；(f) 降低临床药物-药物相互作用倾向的因素；(g) 降低不利的副作用的可能性的因素，包括相对其它生物靶的选择性；(h) 具有较少出血倾向的提高的治疗指数；和(h) 提高制备成本或可行性的因素。

本文使用的术语"化合物"指天然存在的或人工衍生的化学品。化合物可包括，例如，肽、多肽、合成的有机分子、天然存在的有机分子、核酸分子、肽核酸分子及其组分和衍生物。

本文使用的术语"患者"包括所有哺乳动物物种。

本文使用的术语"受试者"指可潜在地受益于用PAR4拮抗剂治疗的任何人或非人有机体。示例性受试者包括具有心血管疾病的风险因素的任何年龄的人，或者已经历一次心血管疾病事件的患者。常见的风险因素包括但不限于年龄、男性、高血压、吸烟或吸烟史、甘油三酯升高、总胆固醇或LDL胆固醇升高。

在一些实施方案中，受试者为具有双重PAR1/PAR4血小板受体功能的物种。本文使用的术语"双重PAR1/PAR4血小板受体功能"指受试者在血小板或它们的前体中表达PAR1和PAR4。具有双重PAR1/PAR4血小板受体功能的示例性受试者包括人、非人灵长类动物和豚鼠。

在其它实施方案中，受试者为具有双重PAR3/PAR4血小板受体功能的物种。本文使用的术语"双重PAR3/PAR4血小板受体功能"指受试者在血小板或它们的前体中表达PAR3和PAR4。具有双重PAR3/PAR4血小板受体功能的示例性受试者包括啮齿动物和兔子。

本文使用的"治疗"或"治疗"涵盖在哺乳动物(特别是人)中治疗疾病-状态，并且包括：(a) 抑制疾病-状态，即，阻止其发展；和/或(b) 减轻疾病-状态，即，引起疾病状态消退。

本文使用的"预防"或"预防"涵盖在哺乳动物(特别是人)中预防性治疗亚临床疾病-状态，目的是降低出现临床疾病-状态的可能性。基于与通常的群体相比，已知提高遭受临床疾病状态的风险的因素，选择患者用于预防性治疗。"预防" 疗法可分为(a)初级预防和(b)二级预防。初级预防定义为对还未呈现临床疾病状态的受试者的治疗，而二级预防定义为防止相同或类似的临床疾病状态的二次发生。

本文使用的"风险降低"涵盖降低临床疾病状态发展的发病率的疗法。因此，初级和二级预防疗法为风险降低的实例。

"治疗有效量"打算包括当单独或组合给予以抑制和/或拮抗PAR4和/或预防或治疗本文列举的病症时有效的本发明化合物的量。当适用于组合时，该术语指导致预防性或治疗效果的活性成分的合并的量，不管是组合给予、连续给予，还是同时给予。

本文使用的术语"血栓形成"指在可引起通过脉管供应的组织的局部缺血或梗塞形成的血管内形成或存在血栓(复数，血栓)。本文使用的术语"栓塞"指被凝块或外来物质突然阻断动脉，此类凝块或外来物质已通过血流被带至其沉积部位。本文使用的术语"血栓栓塞"指通过血流由起源部位携带的血栓形成物质堵塞血管，以堵塞另一个脉管。术语"血栓栓塞性疾病" 包括"血栓形成"和"栓子"病症(如上定义)二者。

本文使用的术语"血栓栓塞性疾病"包括动脉心血管血栓栓塞性疾病、静脉心血管或脑血管血栓栓塞性疾病和在心室中或在外周循环中的血栓栓塞性疾病。本文使用的术语"血栓栓塞性疾病"还包括选自但不限于以下的特定的病症：不稳定的心绞痛或其它急性冠状动脉综合征、房颤、第一次或复发性心肌梗塞、缺血性猝死、一过性缺血发作、中风、动脉粥样硬化、外周闭塞动脉疾病、静脉血栓形成、深静脉血栓形成、血栓性静脉炎、动脉栓塞、冠状动脉血栓形成、脑动脉血栓形成、脑栓塞、肾栓塞、肺栓塞和由其中血液暴露于促进血栓形成的人造表面的医疗植入物、装置或手术引起的血栓形成。医疗植入物或装置包括但不限于：修复阀、人造阀、留置导管、支架、血液氧合器、分流、脉管入口孔、室辅助装置和人造心脏或心室和脉管移植物。程序包括但不限于：心肺旁路、经皮冠状介入和血液透析。在另一个实施方案中，术语"血栓栓塞性疾病"包括急性冠状动脉综合征、中风、深静脉血栓形成和肺栓塞。

在另一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗血栓栓塞性疾病的方法，其中所述血栓栓塞性疾病选自不稳定的心绞痛、急性冠状动脉综合征、房颤、心肌梗塞、一过性缺血发作、中风、动脉粥样硬化、外周闭塞动脉疾病、静脉血栓形成、深静脉血栓形成、血栓性静脉炎、动脉栓塞、冠状动脉血栓形成、脑动脉血栓形成、脑栓塞、肾栓塞、肺栓塞和由其中血液暴露于促进血栓形成的人造表面的医疗植入物、装置或手术引起的血栓形成。在另一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗血栓栓塞性疾病的方法，其中所述血栓栓塞性疾病选自急性冠状动脉综合征、中风、静脉血栓形成、房颤和由医疗植入物和装置引起的血栓形成。

在另一个实施方案中，本发明提供一种用于初级预防血栓栓塞性疾病的方法，其中所述血栓栓塞性疾病选自不稳定的心绞痛、急性冠状动脉综合征、房颤、心肌梗塞、缺血性猝死、一过性缺血发作、中风、动脉粥样硬化、外周闭塞动脉疾病、静脉血栓形成、深静脉血栓形成、血栓性静脉炎、动脉栓塞、冠状动脉血栓形成、脑动脉血栓形成、脑栓塞、肾栓塞、肺栓塞和由其中血液暴露于促进血栓形成的人造表面的医疗植入物、装置或手术引起的血栓形成。在另一个实施方案中，本发明提供一种用于初级预防血栓栓塞性疾病的方法，其中所述血栓栓塞性疾病选自急性冠状动脉综合征、中风、静脉血栓形成和由医疗植入物和装置引起的血栓形成。

在另一个实施方案中，本发明提供一种用于二级预防血栓栓塞性疾病的方法，其中所述血栓栓塞性疾病选自不稳定的心绞痛、急性冠状动脉综合征、房颤、复发性心肌梗塞、一过性缺血发作、中风、动脉粥样硬化、外周闭塞动脉疾病、静脉血栓形成、深静脉血栓形成、血栓性静脉炎、动脉栓塞、冠状动脉血栓形成、脑动脉血栓形成、脑栓塞、肾栓塞、肺栓塞和由其中血液暴露于促进血栓形成的人造表面的医疗植入物、装置或手术引起的血栓形成。在另一个实施方案中，本发明提供一种用于二级预防血栓栓塞性疾病的方法，其中所述血栓栓塞性疾病选自急性冠状动脉综合征、中风、房颤和静脉血栓形成。

本文使用的术语"中风"指由在普通的颈动脉、颈动脉内部或脑内动脉中的闭塞血栓形成引起的栓子中风或动脉粥样血栓形成中风。

应注意，血栓形成包括脉管闭塞(例如，在旁路后面)和再闭塞(例如，在经皮经腔冠状血管成形术期间或之后)。血栓栓塞性疾病可由包括但不限于以下的状况引起：动脉粥样硬化、手术或手术并发症、延长的固定、动脉原纤化、先天性血栓形成倾向、癌症、糖尿病、药物治疗或激素的作用和怀孕并发症。

血栓栓塞性疾病通常与患有动脉粥样硬化的患者相关。动脉粥样硬化的风险因素包括但不限于男性、年龄、高血压、脂质病症和糖尿病。动脉粥样硬化的风险因素同时为动脉粥样硬化并发症(即，血栓栓塞性疾病)的风险因素。

类似地，动脉原纤化通常与血栓栓塞性疾病相关。动脉原纤化和随后的血栓栓塞性疾病的风险因素包括心血管疾病、风湿性心脏病、非风湿性二尖瓣疾病、高血压性心血管疾病、慢性肺病和各种各样的心脏异常以及甲状腺毒症。

糖尿病通常与动脉粥样硬化和血栓栓塞性疾病相关。更常见的2型糖尿病的风险因素包括但不限于家族史、肥胖、身体不活动、人种/种族、先前削弱的空腹葡萄糖或葡萄糖耐受测试、妊娠糖尿病史或分娩"大婴儿"、高血压、低HDL胆固醇和多囊卵巢综合征。

血栓形成已与多种肿瘤类型相关，例如，胰腺癌、乳腺癌、脑肿瘤、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃肠恶性肿瘤和霍奇金或非霍奇金淋巴瘤。近来的研究表明，患有血栓形成的患者癌症的频率反映在一般人群中特定癌症类型的频率。(Levitan，N.等人，Medicine (Baltimore)，78(5):285-291 (1999)；Levine M.等人，N. Engl. J. Med.，334(11):677-681 (1996)；Blom，J.W.等人，JAMA，293(6):715-722 (2005))。因此，在男性中，与血栓形成相关的最常见的癌症为前列腺癌、结肠直肠癌、脑癌和肺癌，而在女性中为乳腺癌、卵巢癌和肺癌。在癌症患者中观察到的静脉血栓栓塞(VTE)速率显著。在不同的肿瘤类型之间，VTE的不同速率最可能与患者群体的选择相关。处于血栓形成风险的癌症患者可具有任何或所有的以下风险因素：(i)癌症的阶段(即，存在转移)，(ii)存在中枢静脉导管，(iii)手术和抗癌疗法(包括化疗)和(iv)激素和抗血管生成药物。因此，常见的临床实践是给予具有晚期肿瘤的患者肝素或低分子肝素以预防血栓栓塞性疾病。多种低分子量肝素制剂物已由FDA批准用于这些指征。

本文使用的术语"药用组合物"指任何组合物，其含有至少一种治疗或生物活性剂并且适用于给予患者。任何这些制剂可通过本领域公知的和可接受的方法制备。参见，例如，Gennaro，A.R.编辑，Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Remington：药物科学与实践)，第20版，Mack Publishing CO. ，Easton，PA (2000)。

本发明包括给予受试者药用组合物，所述组合物包含与PAR4结合并且抑制PAR4裂解和/或发信号的化合物(本文中称为"PAR4拮抗剂"或"治疗化合物")。

使用本领域已知的方法给予药用组合物。优选，口服、直肠、经鼻、通过吸入、局部或肠胃外(例如，皮下、腹膜内、肌内和静脉内)给予化合物。化合物任选作为治疗药物的鸡尾酒的一种组分配制，以治疗血栓栓塞性疾病。在一个优选的实施方案中，口服给予药用组合物。

利用常规的方法将本文描述的治疗化合物配制成为药用组合物。例如，PAR4拮抗剂配制在用于口服给予的胶囊或片剂中。胶囊剂可含有任何标准药学上可接受的材料，例如明胶或纤维素。通过压缩治疗化合物与固体载体和润滑剂的混合物，可根据常规的程序配制片剂。固体载体的实例包括淀粉和糖膨润土。化合物以硬壳片剂或含有粘合剂(例如，乳糖或甘露糖醇)、常规的填冲剂和成片剂的胶囊形式给予。其它制剂包括软膏、栓剂、糊膏、喷雾剂、贴剂、膏霜、凝胶剂、可再吸收的海绵或泡沫。使用本领域公知的方法产生这样的制剂。本发明的组合物还可用于肠胃外给予，例如静脉内、皮下、肌内和腹膜内。适用于肠胃外给予的制剂的实例包括活性剂在等渗盐水溶液、5%葡萄糖溶液或另一种标准药学上可接受的赋形剂中的含水溶液。标准增溶剂(例如PVP或环糊精)也用作药物赋形剂，用于递送治疗化合物。

PAR4拮抗剂的优选的剂量为生物活性剂量。生物活性剂量为抑制PAR4的裂解和/或发信号并且具有抗血栓形成效果的剂量。期望地，PAR4拮抗剂能降低PAR4的活性，低于未经治疗的对照水平至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或多于100%。在血小板中PAR4的水平通过本领域已知的任何方法测量，包括，例如，使用PAR4裂解敏感抗体的受体结合测定法、血小板聚集、血小板活化测定法(例如，通过FACS®的p-选择蛋白表达)、蛋白质印迹或ELISA分析。或者，通过评定由PAR4引出的细胞发信号(例如，钙转移或其它第二信使测定法)，测量PAR4的生物活性。

在一些实施方案中，PAR4化合物的治疗有效量优选为约小于100 mg/kg，50 mg/kg，10 mg/kg，5 mg/kg，1 mg/kg或小于1 mg/kg。在一个更优选的实施方案中，PAR4化合物的治疗有效量小于5 mg/kg。在一个最优选的实施方案中，PAR4化合物的治疗有效量小于1 mg/kg。如本领域技术人员认识到的，有效剂量随着给予路径和赋形剂使用而变。

本发明的PAR4拮抗剂的活性可在多种体外测定法中测量。示例性测定法示于以下实施例。

FLIPR测定法为用于测量本发明的PAR4拮抗剂的活性的示例性体外测定法。在该测定法中，通过PAR4激动剂，在表达PAR4的细胞中诱导细胞内钙转移，并且监测钙转移。参见，例如，实施例A。FLIPR测定法也是用于测量PAR4激动剂肽的激动剂活性的示例性体外测定法。参见实施例H。

AYPGKF(SEQ ID NO：1)为已知的PAR4激动剂。备选的PAR4激动剂为H-Ala-Phe(4-F)-Pro-Gly-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-Gly-NH₂。如以下实施例B所示，在FLIPR测定法中H-Ala-Phe(4-F)-Pro-Gly-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-Gly-NH₂(SEQ ID NO：3)被验证为PAR4激动剂。使用AYPGKF(SEQ ID NO：1)，与H-Ala-Phe(4-F)-Pro-Gly-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-Gly-NH₂比较，进行~180种化合物的IC₅₀值的并列比较。结果证明在两种测定法之间的强相关。此外，与AYPGKF(SEQ ID NO：1)相比，H-Ala-Phe(4-F)-Pro-Gly-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-Gly-NH₂(SEQ ID NO：3)具有提高的激动剂活性，在FLIPR测定法中，其EC₅₀比AYPGKF(SEQ ID NO：1)的EC₅₀低，为十分之一。具有提高的效力的PAR4激动剂肽确保为更稳健的测定法，具有提高的灵敏度和特异性。使用本领域技术人员公知的方法可合成H-Ala-Phe(4-F)-Pro-Gly-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-Gly-NH₂(SEQ ID NO：3)，如实施例AA-DD所示。

FLIPR测定法还可用作反筛选，以在表达PAR1和PAR4二者的细胞系中测试激动剂活性或PAR1拮抗剂活性。通过化合物抑制PAR1激动剂肽SFFLRR (SEQ ID NO：35)或其它PAR1激动剂肽诱导的钙转移的能力，可测试PAR1拮抗剂活性。

可体外测试本发明的化合物抑制γ-凝血酶诱导的血小板聚集的能力，如实施例C所示。γ-凝血酶(一种不再与PAR1相互作用的α-凝血酶的蛋白水解产物)选择性解离和活化PAR4 (Soslau，G.等人，"Unique pathway of thrombin-induced platelet aggregation mediated by glycoprotein Ib (糖蛋白Ib介导的凝血酶-诱导的血小板聚集的独特的路径)"，J. Biol. Chem.，276:21173-21183 (2001))。血小板聚集可在96-孔微量板聚集测定形式中或使用标准血小板聚集仪监测。聚集测定法还可用于测试化合物抑制血小板聚集的选择性，该血小板聚集由PAR4激动剂肽、PAR1激动剂肽、ADP或凝血烷类似物U46619诱导。用于测量PAR4激动剂肽的激动剂活性的血小板聚集测定法示于实施例G。

实施例D为α-凝血酶-诱导的血小板聚集测定法。α-凝血酶活化PAR1和PAR4二者。使用标准光学聚集仪测量本发明的选择性PAR4拮抗剂(即，实施例3化合物)抑制血小板聚集的能力。通过实施例3化合物对α-凝血酶诱导的血小板聚集的抑制示于图1A和1B。这是本领域中第一次，数据显示单独的PAR4拮抗剂可有效抑制血小板聚集。PAR4拮抗剂的血小板抑制程度至少与先前对于PAR1拮抗剂所描述的相当。

实施例E为组织因子-诱导的血小板聚集测定法。在该测定法中的条件模仿在血栓形成期间的生理事件。在该测定法中，通过加入组织因子和CaCl₂，引发在人PRP中的血小板聚集。在人动脉粥样硬化斑中，组织因子(外来的凝聚级联的引发剂)高度升高。在动脉粥样硬化部位，血液暴露于组织因子触发凝血酶的稳健产生，和诱导阻塞性血栓的形成。

本发明的PAR4拮抗剂的活性还可在多种体内测定法中测量。可提供血栓形成和止血模式以测试本发明的PAR4拮抗剂作为抗血栓形成剂的有效性的示例性哺乳动物包括但不限于豚鼠和灵长类动物。相关的效力模式包括但不限于电-诱导的颈动脉血栓形成、FeCl₃-诱导的颈动脉血栓形成和动静脉-吻合流术血栓形成。肾出血时间、肾脏出血时间和其它出血时间测量的模式可用于评价在本发明中描述的抗血栓形成剂的出血风险。

测定法

材料

1) PAR1和PAR4激动剂肽

SFFLRR(SEQ ID NO：35)为已知的高亲和力PAR1选择性激动剂肽。(参考：Seiler，S. M.，" Thrombin receptor antagonists(凝血酶受体拮抗剂)"，Seminars in Thrombosis and Hemostasis，22(3):223-232 (1996))。合成PAR4激动剂肽AYPGKF(SEQ ID NO：1)和H-Ala-Phe(4-F)-Pro-Gly-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-Gly-NH₂(SEQ ID NO：3)。在FLIPR测定法中(H-Ala-Phe(4-F)-Pro-Gly-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-Gly-NH₂(SEQ ID NO：3)的EC₅₀为2.3μM，AYPGKF(SEQ ID NO：1)的EC₅₀为61μM)和在洗涤的血小板聚集测定法中(H-Ala-Phe(4-F)-Pro-Gly-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-Gly-NH₂(SEQ ID NO：3)的EC₅₀为0.86 μM，AYPGKF(SEQ ID NO：1)的EC₅₀为13 μM)，比起AYPGKF(SEQ ID NO：1)，H-Ala-Phe(4-F)-Pro-Gly-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-Gly-NH₂(SEQ ID NO：3)显示提高的PAR4激动剂活性。

2) 表达PAR4的细胞

通过转染人F2R23 cDNA表达载体的标准方法或通过得自Athersys Inc. (Cleveland，OH)的RAGE技术，产生稳定表达PAR4的HEK293细胞，并且基于mRNA表达的PAR4蛋白质表达来选择。使用FLIPR® (荧光成像板读数器；Molecular Devices Corp.)，那些细胞证明对PAR4激动剂肽-诱导的细胞内钙升高的功能应答。这些细胞表达内源性PAR1，并且当用PAR1激动剂肽刺激后，可引出钙信号。在37℃、5% CO₂下，细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM) (Invitrogen，Carlsbad，CA)、10% FBS、1% PSG、3 µg/ml嘌呤霉素和25 nM氨甲蝶呤)中生长。

3) 制备富含血小板的血浆(PRP)

以1 ml/9 ml血液的比率，在3.8%柠檬酸钠中收集人血液。通过在170 g下离心14分钟，将富含血小板的血浆分离。

4) 制备洗涤的血小板(WP)

以1.4 ml/10 ml血液的比率，在ACD (85 mM柠檬酸三钠、78 mM柠檬酸、110 mM D-葡萄糖，pH 4.4)中收集人血液。通过在170 g下离心14分钟，分离PRP，通过在1300 g下离心6分钟，使血小板进一步沉淀。血小板用含有1 mg/ml牛血清白蛋白的10 ml ACD洗涤一次。血小板以~2.5×10⁸/ml在Tyrode缓冲液(137 mM NaCl、2 mM KCl、1.0 mM MgCl₂、1 mM CaCl₂、5 mM葡萄糖、20 mM HEPES pH 7.4)中再悬浮。

实施例A

在表达PAR4的HEK293细胞中的FLIPR测定法

(拮抗剂活性的测试)

使用FDSS6000 (Hamamatsu Photonics，日本)，通过fluo-4，通过监测H-Ala-Phe(4-F)-Pro-Gly-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-Gly-NH₂(SEQ ID NO：3)-诱导的细胞内钙转移，在表达PAR4的细胞中测试本发明的PAR4拮抗剂的活性。还进行激动剂活性和PAR1拮抗剂活性的反筛选。简要地，将HEK293 EBNA PAR4克隆20664.1J细胞接种24小时，随后在384孔涂布聚-D-赖氨酸的黑色澄清的底部板(Greiner Bio-One，Monroe，NC)中进行试验。细胞以20,000个细胞/孔接种在20 µl生长培养基中，并且在37℃、5% CO₂下孵育过夜。在测定时，培养基用40 µl 1×Hank缓冲的盐水溶液(HBSS) (具有10 mM HEPES)更换，并且以各种浓度加入还在1×HBSS缓冲液中稀释的20 µl测试化合物，并且在FDSS上，0.67% DMSO最终浓度用于激动剂测量。细胞随后在室温下孵育30分钟，接着加入20 µl激动剂肽，用于在FDSS上的拮抗剂测量。常规测试用于PAR4拮抗剂筛选的激动剂肽H-Ala-Phe(4-F)-Pro-Gly-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-Gly-NH₂(SEQ ID NO：3) 或用于PAR1反筛选的SFFLRR，以确保在测定中在EC₅₀下应答(H-Ala-Phe(4-F)-Pro-Gly-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-Gly-NH₂(SEQ ID NO：3)为~2.3 µM，SFFLRR为600 nM)。

实施例B

H-Ala-Phe(4-F)-Pro-Gly-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-Gly-NH₂(SEQ ID NO：3)作为PAR4激动剂的验证

为了在FLIPR测定法中验证H-Ala-Phe(4-F)-Pro-Gly-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-Gly-NH₂(SEQ ID NO：3)作为PAR4激动剂，使用AYPGKF(SEQ ID NO：1)与H-Ala-Phe(4-F)-Pro-Gly-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-Gly-NH₂比较，进行~180种化合物的IC₅₀值的并列比较。结果证明两个测定法之间的强相关(Spearman秩相关系数rho=0.7760，p<0.0001)。通过与洗涤的血小板测定法的直接测定连通性，证实在HEK293细胞中FLIPR测定法的关联。~200种化合物来自AYPGKF FLIPR测定法的IC₅₀值与AYPGKF洗涤的血小板聚集测定法强相关(Spearman秩相关系数rho=0.836，p<0.001)。使用H-Ala-Phe(4-F)-Pro-Gly-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-Gly-NH₂，比较FLIPR和洗涤的血小板数据，得到类似的结果。

实施例C

γ凝血酶诱导的血小板聚集测定法

(拮抗剂活性的测试)

在96-孔微量板聚集测定形式中，测试本发明的化合物抑制γ-凝血酶诱导的血小板聚集的能力。简要地，将PRP或洗涤的血小板悬浮液(100 μl)在室温下与不同浓度的化合物一起预孵育5分钟。通过~10-50 nM γ凝血酶(Haematologic Technologies，Essex Junction，VT)引发聚集，每日滴定，以实现80%血小板聚集。将1 U/mL的来匹卢定(Berlex，Montville，NJ)加入到γ凝血酶样品中，以防止通过残余的α-凝血酶污染诱导的PAR1活化。随后将板放置在37℃的分子装置(Molecular Devices) (Sunnyvale，CA) SPECTRAMAX® Plus板读数器中。在405 nM下，将板混合10秒，随后第一次读数，在每一次读数之间混合50秒，持续高达15分钟。使用SOFTMAX® 4.71软件收集数据。板还包括用作ODmax的未经处理的对照样品，而不含血小板的缓冲液为ODmin。通过从100%聚集值的ODmin减去ODmax，确定血小板聚集。在实验样品中，从最小值减去观察到的透射率，随后与100%聚集值相比较，以确定聚集百分数。使用Excel Fit软件确定IC₅₀值。

通过使用SFFLRR(用于PAR1)、骨胶原(Chrono-Log，Havertown，PA) (用于骨胶原受体)、ADP(用于P2Y1和P2Y12)和U46619 (Cayman Chemical，Ann Arbor，MI) (用于凝血烷受体)，聚集测定法还用于测试化合物对其它血小板受体的选择性。

实施例D

α-凝血酶诱导的血小板聚集测定法

(拮抗剂活性的测试)

使用人洗涤的血小板测试PAR4拮抗剂抑制α-凝血酶诱导的血小板聚集的能力。实施例3用洗涤的血小板预孵育20分钟。在1000 rpm搅拌速度下，通过向300 μl洗涤的血小板中加入1.5 nM α-凝血酶 (Haematologic Technologies，Essex Junction，VT)，引发聚集。使用光学聚集仪(Chrono-Log，Havertown，PA)监测血小板聚集，并且测定在6分钟时的曲线下面积(AUC)。使用媒介物对照作为0%抑制计算IC₅₀。通过实施例3，抑制血小板聚集的IC₅₀计算为5 nM (n=3) (图1A和1B)。

实施例E

组织因子-诱导的血小板聚集测定法

(拮抗剂活性的测试)

在组织因子驱动的聚集测定法中，可测试PAR1或PAR4拮抗剂抑制内源性凝血酶诱导的血小板聚集的能力。通过加入CaCl₂和重组人组织因子，引发聚集，通过在血浆中凝聚路径的活化，这导致产生凝血酶。还向样品中加入抗凝血剂，例如50 μg/ml的玉米胰蛋白酶抑制剂(Haematologic Technologies，Essex Junction，VT)和PEFABLOC® FG (Centerchem，Norwalk、CT)，以防止在研究期间纤维蛋白凝块形成。使用标准仪器包括光学聚集仪或阻抗聚集仪，监测血小板聚集。

实施例F

下表描述在FLIPR测定法和血小板聚集测定法(PRP测定法)中，采用测试的各种本发明化合物所得到的结果。如上所示，FLIPR测定法(一种体外测定法)如在实施例A中所述测量测试的化合物的PAR4拮抗剂活性。PRP测定法(一种体外测定法)如在实施例C中所述，在血浆蛋白质和凝血酶激动剂的存在下，测量所测试化合物的PAR4拮抗剂活性(assay)。

实施例G

PAR4激动剂肽诱导的血小板聚集测定法

(PAR4激动剂肽的激动剂活性的测试)

在96-孔微量板聚集测定形式中，测试本发明的化合物诱导血小板聚集的能力。简要地，测定具有不同浓度的激动剂化合物的洗涤的血小板悬浮液。通过加入滴定的测试激动剂肽引发聚集。随后将板放置在37℃分子装置(Molecular Devices) SPECTRAMAX® Plus板读数器(Sunnyvale，CA)中。在405 nM下，将板混合10秒，随后第一次读数，在每一次读数之间混合20秒，保持高达15分钟。使用SOFTMAX® 4.71软件收集数据。板还包括用作ODmax的未经处理的对照样品，而不含血小板的缓冲液为ODmin。通过从100%聚集值的ODmin减去ODmax，确定血小板聚集。在实验样品中，从最小值减去观察到的透射率，随后与100%聚集值相比较，以确定聚集百分数。使用Excel Fit软件确定ED₅₀值。

实施例H

在表达PAR4的HEK293细胞中的FLIPR测定法

(PAR4激动剂肽的激动剂活性的测试)

使用FDSS6000 (Hamamatsu Photonics，日本)，通过fluo-4，通过监测PAR4-诱导的细胞内钙转移，在表达PAR4的细胞中测试本发明的PAR4激动剂肽的活性。简要地，将表达人PAR4的HEK293细胞接种24小时，随后在96孔或384孔涂布聚-D-赖氨酸的黑色澄清的底部板(Greiner Bio-One，Monroe，NC)中进行试验。细胞以40,000个细胞/孔(96孔)或20,000个细胞/孔(384孔)接种，并且在37℃、5% CO₂下孵育过夜。在测定时，对于96孔或384孔测定，培养基分别用1×Hank缓冲的盐水溶液(HBSS) (具有10 mM HEPES)更换。细胞随后在室温下孵育30分钟，接着加入不同浓度的激动剂肽，用于在FDSS上测量。

实施例I

下表描述当使用在以上实施例G和H中描述的方法，评价若干肽时得到的结果。

*未测试

PAR4激动剂肽的合成

实施例AA

使用Advanced ChemTech Model 90合成仪和Advanced ChemTech Model 396Ω多肽合成仪，进行肽的固相肽合成

使用以下程序制备肽-树脂Fmoc-Pro-Gly-Lys(Boc)-Phe-Rink酰胺MBHA树脂。将Fmoc-Rink酰胺MBHA树脂(6.3 g，0.66 mmol/g，共4.16 mmol)装入到200 mL反应器中，并且放置在Advanced ChemTech Model 90合成仪上。树脂经历以下循环：

1. DMF洗涤，1×60 mL×2分钟。

2. 20%哌啶的DMF溶液，1×60 mL×5分钟。

3. 20%哌啶的DMF溶液，1×60 mL×15分钟。

4. DMF洗涤，4×60 mL×1分钟。

5. NMP洗涤，4×60 mL×1分钟。

6. 偶联(参见以下)

7. NMP洗涤，4×60 mL×1分钟。

使用下表中的试剂进行偶联。将Fmoc-AA和HCTU溶解于NMP/DCM 3:1 (45 mL)中。搅拌下，向其中加入DIEA。随后将所得到的溶液加入到脱保护的树脂中，混合1-3.5小时，直至得到阴性Kaiser水合茚三酮测试结果。

使用以上步骤2-5，从Pro残基除去Fmoc基团。将Pro-Gly-Lys(Boc)-Phe-Rink酰胺MBHA树脂悬浮于NMP/DCM 1:1 (200 mL)中，在Advanced ChemTech Model 396Ω多肽合成仪上，将2 mL悬浮液加入到88个孔中。将0.3 M Fmoc-AA/0.3 M HOAt在DMF中的溶液(0.5 mL)加入到每一个孔中，接着加入0.2 mL 0.77 M DIC在DMF中的溶液。将反应单元涡旋25小时。如以下描述的，将肽基-树脂洗涤和脱保护。

如上所述，将Fmoc-Alanine或适当的Fmoc-AA与肽基-树脂偶联，接着如上所述洗涤和除去Fmoc保护基团。最终的洗涤为NMP，随后DCM，均为4×2 mL×1分钟。接着10分钟氮气吹扫肽基-树脂。

a. 裂解/脱保护

如下通过用TFA裂解混合物来处理，由它们的相应的肽基-树脂将期望的肽裂解/脱保护。在反应器单元中，将TFA/水/三异丙基硅烷(96:2:2)的溶液(1.0 mL)加入到每一个孔中，随后涡旋30分钟。该过程再重复一次，通过正压将来自孔的TFA溶液收集至位于在反应器底部上的匹配96-小瓶单元的预先称皮重的小瓶中。让小瓶静置，使得与混合物的总接触时间为80分钟。在SPEEDVAC® (Savant)中将小瓶浓缩至约1.0 mL体积，随后加入到二异丙基醚(10 mL)中，简要振动。将小瓶在-15℃下保持1小时。将析出物通过离心沉淀，将上清液倾析。将小瓶在SPEEDVAC® (Savant)中干燥30分钟，以得到粗品肽，通常为>100%收率(20-40 mg)。将粗品肽直接溶解于水(2.5 mL)和乙腈(0.5 mL)中，并且过滤至小瓶中。在SPEEDVAC® (Savant)中除去溶剂，以得到原样使用的粗品肽。

b. 肽的HPLC分析

在通过如上所述的制备HPLC纯化后，通过在Shimadzu LC-10AD或LC-10AT分析HPLC系统上的分析RP-HPLC分析每一个肽，该系统包括：SCL-10A 系统控制器、SIL-10A自动-注射器、SPD10AV或SPD-M6A UV/VIS检测器或SPD-M10A二极管阵列检测器。使用以下方法中的一种：使用PHENOMENEX® Luna C18(2) 5 µm (4.6×50 mm)柱，使用以下梯度进行洗脱：10-100% B/A，经10分钟，1.25 mL/分钟；流动相A：0.1% TFA/水；流动相B：0.1% TFA/乙腈。

c. 通过质谱法表征(参见以下)

实施例BB

在Advanced ChemTech Model 396Ω多肽合成仪上，进行肽的同时固相肽合成。

在DMF /DCM 1:1 (最终体积8 mL)中溶胀Rink酰胺树脂(0.6822 g 0.6 mmol/g取代)。在反应单元(1 mL/孔)中，将树脂悬浮液分布至8个孔中。使用20%哌啶在DMF中(1 mL/次处理)两次处理，每次分别5和15分钟，随后除去Fmoc基团。树脂用NMP洗涤(10×1.5 mL×1分钟)。将0.31 M Fmoc-氨基酸和0.31 M 6-Cl-HOBt在NMP (1 mL)中的溶液加入到树脂中，接着加入0.78 M DIC在NMP中的溶液(0.4 mL)中。将树脂涡旋2小时，随后将树脂排水，用NMP (7×1.5 mL×1分钟)洗涤。重复该循环，直至如通过事先程序化的序列合成表那样测定装配相应的肽序列所需的自动化的偶联循环的数量。

以下描述用于肽的典型的0.05 mmol/孔同时合成的详细的分步合成方案。该方案适于在4-96个/单次运行范围的类似物阵列的同时合成。

PAR4激动剂肽的自动化的合成

在开始合成前，按需制备以下试剂溶液并且放置在仪器上：20%哌啶的DMF溶液；0.78 M DIC的NMP溶液。作为在0.31 M 6-Cl-HOBt/NMP中的0.31 M溶液制备所需的Fmoc-保护的氨基酸，并且在32-位氨基酸支架(rack)中放置在适当的位置中。

最后，如上所述，使用20%哌啶的DMF溶液除去Fmoc基团，用NMP (3×1.5 mL)和DCM (6×1.5 mL)洗涤肽基-树脂。

a. 裂解/脱保护

如下通过用TFA裂解混合物处理，由它们的相应的肽基-树脂将期望的肽裂解/脱保护。在反应器单元中，将TFA/水/三异丙基硅烷(96:2:2)的溶液(1.0 mL)加入到每一个孔中，随后涡旋30分钟。该过程再重复两次，通过正压将来自孔的TFA溶液收集至位于在反应器底部上的匹配96-小瓶单元的预先称皮重的小瓶中。在SPEEDVAC® (Savant)中将小瓶浓缩至约0.2 mL体积。随后通过加入二异丙基醚(4 mL)并简要涡旋，析出粗品肽。将析出物通过离心沉淀，将上清液倾析。将小瓶在SPEEDVAC® (Savant)中干燥，以得到粗品肽，通常为>100%收率(20-40 mg)。将粗品肽直接溶解于2 mL水中，按需加入乙腈，以完全溶解。通过制备HPLC纯化肽。

b. 粗品肽的制备HPLC纯化

在Waters Model 4000或Shimadzu Model LC-8A液相色谱仪上进行制备HPLC。将每一个粗品肽的溶液注入YMC S5 ODS-A (250×20 mm)柱，使用MeCN在水中的线性梯度洗脱，均使用0.1% TFA缓冲。使用的典型的梯度为从0%到50% 0.1% TFA/MeCN在0.1% TFA/水中，经40分钟，以15 mL/分钟的流速，其中在217 nm下进行流出物UV检测。在级分收集器上收集级分(5-10 mL)。将通过HPLC和MS分析测定的含有期望的肽的那些汇合，冻干，以得到无定形白色粉末。

c. 纯化的肽的HPLC分析

在通过如上所述的制备HPLC纯化后，通过在Shimadzu LC-10AD或LC-10AT分析HPLC系统上的分析RP-HPLC分析每一个肽，该系统包括：SCL-10A 系统控制器、SIL-10A自动-注射器、SPD10AV或SPD-M6A UV/VIS检测器或SPD-M10A二极管阵列检测器。使用以下方法中的一种：方法A：使用YMC ODS-AQ S3 (4.6×150 mm)柱，使用以下梯度进行洗脱：0-60% B/A，经30分钟，1.0 mL/分钟；方法B：使用YMC ODS-AQ S3 (4.6×150 mm)柱，使用以下梯度进行洗脱： 0-60% B/A，经60分钟，1.0 mL/分钟；流动相A：0.1% TFA/水；流动相B：0.1% TFA/乙腈。

d. 通过质谱法表征

采用流动注射或LC/MS模式，每一个肽通过电喷雾质谱法(ES-MS)表征。在正和负离子电喷雾模式中，Finnigan SSQ7000单一四极质谱仪(ThermoFinnigan，San Jose，CA)用于所有的分析。在300-2200原子质量的质量范围内，扫描时间为1.0秒，获得全扫描数据。四极以单位分辨率操作。对于流动注射分析，质谱仪与Waters 616 HPLC泵(Waters Corp.，Milford，MA)对接，并且配备有HTS PAL自动取样器(CTC Analytics，Zwingen，瑞士)。将样品注入具有0.1%氢氧化铵的含有50:50水:乙腈的流动相中。用于分析的流速为0.42 mL/分钟，注射体积为6 µl。ThermoSeparations Constametric 3500液相色谱仪(ThermoSeparation Products，San Jose，CA)和HTS PAL自动取样器用于LC/MS分析。采用Luna C₁₈，5微米柱，2×30 mm (Phenomenex，Torrance，CA)实现色谱分离。用于分析的流速为1.0 mL/分钟，将柱流出物分开，使得进入电喷雾界面的流量为400 µl/分钟。经4分钟，运行线性梯度从0%到100% B/A，其中流动相A为具有10 mM乙酸铵的98:2 水:乙腈，流动相B为具有10 mM乙酸铵的10:90 水:乙腈。在220 nm下监测UV响应。将样品溶解于200 µl 50:50 H₂O:MeCN (0.05% TFA)中。注射体积为5 µl。

在所有情况下，通过实验测量的分子量在计算的单同位素分子量的0.5道尔顿内。

实施例CC

合成H-Ala-Phe(4-F)-Pro-Gly-Trp-Leu-Val-Lys-Asn-Gly-NH₂

(SEQ ID NO：3)

使用Advanced ChemTech Model 90肽合成仪，通过固相合成，合成SEQ ID NO:3的肽。每一个偶联循环包括以下步骤：

1. 20%哌啶的DMF溶液，1×30 mL×5分钟。

2. 20%哌啶的DMF溶液，1×30 mL×15分钟。

3. NMP洗涤：8×30 mL×1分钟。

4. 偶联适当的Fmoc-氨基酸。

5. DMF洗涤：4×30 mL×1分钟。

Fmoc-Gly-OH与Sieber酰胺树脂偶联

Sieber酰胺树脂(4.02 g，0.66 mmol/g)用DMF (1×40 mL×5分钟)洗涤，使用以上步骤1-3除去Fmoc基团。向Fmoc-Gly-OH(1.58 g，5.31 mmol)和HCTU (2.62 g，6.33 mmol)在NMP (18 mL)中的溶液中加入DIEA (1.68 g，13.0 mmol)。将所得到的溶液简要涡旋，随后加入到脱保护的树脂中。将DCM (6 mL)加入到反应器中，将混合物混合共3小时。树脂随后用DMF和DCM (均为4×30 mL×1分钟)连续洗涤，用10%乙酸酐在DCM (1×60 mL)中处理，用DCM (4×30 mL×1分钟)洗涤。将树脂真空干燥过夜。树脂的产量为4.40 g。树脂样品经历Fmoc测定程序(Green等人，Tetrahedron，49(20):4141-4146 (1993))。取代测定为0.60 mmol/g。在树脂上的总mmol数为2.64 mmol。

偶联Fmoc-Asn(Trt)-OH

树脂用DMF (1×40 mL×5分钟)洗涤，随后如上所述处理以除去Fmoc基团。向Fmoc-Asn(Trt)-OH (3.17 g，5.31 mmol)和HCTU (2.63 g，6.36 mmol)在NMP (18 mL)中的溶液中加入DIEA (1.68 g，13.0 mmol)。将所得到的溶液简要涡旋，并且加入到脱保护的树脂中。将DCM (6 mL)加入到反应器中，将整个混合物混合4小时，随后用DMF和DCM (均为4×30 mL×1分钟)连续洗涤。肽-树脂的Kaiser水合茚三酮测试为阴性。

偶联Fmoc-Lys(Boc)-OH

如上所述除去Fmoc基团。向Fmoc-Lys(Boc)-OH (2.50 g，5.34 mmol)和HCTU (2.66 g，6.43 mmol)在NMP (18 mL)中的溶液中加入DIEA (1.68 g，13.0 mmol)。将所得到的溶液简要涡旋，并且加入到脱保护的树脂中。将DCM (6 mL)加入到反应器中，将混合物混合共3小时。肽-树脂随后用DMF和DCM (均为4×30 mL×1分钟)连续洗涤。肽-树脂用10%乙酸酐在DCM中处理20分钟，随后用DCM (6×30 mL×1分钟)洗涤。

偶联Fmoc-Val-OH

肽-树脂用DMF (1×30 mL×5分钟)洗涤，并且如上所述除去Fmoc基团。向Fmoc-Val-OH (1.81 g，5.33 mmol)和HCTU (2.64 g，6.38 mmol)在NMP (18 mL)中的溶液中加入DIEA (1.63 g，12.6 mmol)。将所得到的溶液简要涡旋，并且加入到脱保护的树脂中。将DCM (6 mL)加入到反应器中，将混合物混合4小时，随后用DMF和DCM (均为4×30 mL×1分钟)连续洗涤。

偶联Fmoc-Leu-OH

肽-树脂用DMF (1×30 mL×5分钟)洗涤，并且如上所述除去Fmoc基团。向Fmoc-Leu-OH (1.87 g，5.29 mmol)和HCTU (2.66 g，6.43 mmol)在NMP (18 mL)中的溶液中加入DIEA (1.71 g，13.2 mmol)。将所得到的溶液简要涡旋，并且加入到脱保护的树脂中。将DCM (6 mL)加入到反应器中，将混合物混合2.5小时，随后用DMF和DCM (均为4×30 mL×1分钟)连续洗涤。

偶联Fmoc-Trp(Boc)-OH

如上所述除去Fmoc基团。向Fmoc-Trp(Boc)-OH (2.80 g，5.32 mmol)和HCTU (2.66 g，6.43)在NMP (18 mL)中的溶液中加入DIEA (1.67 g，12.92 mmol)。将所得到的溶液简要涡旋，并且加入到脱保护的树脂中。将DCM (6 mL)加入到反应器中，将混合物混合1小时。树脂样品经历两次Kaiser水合茚三酮测试，在两种情况下结果为阳性。肽-树脂随后用DMF和DCM (均为4×30 mL×1分钟)连续洗涤。使用TFA/TIS/H₂O 96:2:2 (1 mL)，将肽-树脂样品(~4 mg)裂解/脱保护 1小时。分离的产物指示偶联大半不完全。

向Fmoc-Trp(Boc)-OH (7.00 g，13.29 mmol)和6-Cl-HOBt (2.21 g，13.03 mmol)在NMP (30 mL)中的溶液中加入DIC (1.69 g，13.39 mmol)。将所得到的溶液简要涡旋，随后加入到脱保护的树脂中。将DCM (10 mL)加入到反应器中，将整个混合物混合16小时，随后用DMF和DCM (均为4×30 mL×1分钟)连续洗涤。肽-树脂样品得到阴性Kaiser水合茚三酮测试结果，表明偶联完全。

偶联Fmoc-Gly-OH

如上所述除去Fmoc基团。向Fmoc-Gly-OH (1.60 g，5.38 mmol)和HCTU (2.66 g，6.43 mmol)的溶液中加入DIEA (1.65 g，12.77 mmol)。将所得到的溶液简要涡旋，随后加入到脱保护的树脂中。将DCM (10 mL)加入到反应器中，将混合物混合4小时，随后用DMF和DCM (均为4×30 mL×1分钟)连续洗涤。肽-树脂样品得到阳性Kaiser水合茚三酮测试结果。

向Fmoc-Gly-OH (2.36 g，7.94 mmol)和6-Cl-HOBt (1.36 g，8.02 mmol)在NMP (18 mL)中的溶液中加入DIC (1.02 g，8.08 mmol)。将所得到的溶液简要涡旋，随后加入到脱保护的树脂中。将DCM (6 mL)加入到反应器中，将混合物混合80分钟。肽-树脂样品得到阴性Kaiser水合茚三酮测试结果。肽-树脂用DMF (4×30 mL×1分钟)洗涤。

偶联Fmoc-Pro-OH

如上所述除去Fmoc基团。向Fmoc-Pro-OH (2.71 g，8.03 mmol)和6-Cl-HOBt (1.37 g，8.08 mmol)在NMP (18 mL)中的溶液中加入DIC (1.02 g，8.08 mmol)。将所得到的溶液简要涡旋，随后加入到脱保护的树脂中。将DCM (6 mL)加入到反应器中，将混合物混合4小时，随后用DMF和DCM (均为4×30 mL×1分钟)连续洗涤。肽-树脂样品得到阴性Kaiser水合茚三酮测试结果。

偶联Fmoc-Phe(4-F)-OH

如上所述除去Fmoc基团。向Fmoc-Phe(4-F)-OH (1.83 g，4.51 mmol)和6-Cl-HOBt (0.78 g，4.60 mmol)在NMP (18 mL)中的溶液中加入DIC (0.57 g，4.52 mmol)。将所得到的溶液简要涡旋，随后加入到脱保护的树脂中。将DCM (6 mL)加入到反应器中，将混合物混合20小时。肽-树脂随后用DMF和DCM (均为4×30 mL×1分钟)连续洗涤。肽-树脂样品(~4 mg)用TFA/TIS/H₂O 96:2:2 (1 mL)处理1小时。分离的产物指示偶联完全。

偶联Boc-Ala-OH

如上所述除去Fmoc基团。向Boc-Ala-OH (1.50 g，7.93 mmol)和6-Cl-HOBt (1.34 g，7.90 mmol)在NMP (18 mL)中的溶液中加入DIC (1.02 g，8.08 mmol)。将所得到的溶液简要涡旋，随后加入到脱保护的树脂中。将DCM (6 mL)加入到反应器中，将混合物混合16小时。肽-树脂随后用DMF和DCM (均为4×30 mL×1分钟)连续洗涤。肽-树脂样品经历Kaiser水合茚三酮测试，得到阴性结果，表明偶联完全。

由树脂裂解和脱保护

使用DMF，将肽-树脂从ACT 90反应器转移至250 mL手动反应器。肽-树脂用DCM (6×40 mL×1分钟)洗涤，随后用TFA/TIS/水96:2:2 (1×40 mL×20分钟和2×15 mL×20分钟)处理，随后用DCM (1×30 mL×20分钟)处理。连续收集滤液，合并，随后减压浓缩。将所得到的残余物用二异丙基醚(75 mL)研磨，过滤收集沉淀物，用二异丙基醚(2×10 mL)洗涤，真空干燥，以得到粗品肽(3.58 g)。粗品肽的分析显示存在Nim-COOH Trp。因此，将肽溶解于2%乙酸的水溶液(50 mL)中，让所得到的溶液在室温下静置1小时。将肽溶液过滤，冷冻和冻干，以得到期望的粗品肽(3.16 g)。

制备HPLC

在Waters Model 4000制备HPLC上进行制备HPLC。将粗品肽注入PHENOMENEX® Luna C18(2) 5 µm 250×30 mm柱，使用线性梯度洗脱，从10%B到40%B，经60分钟，以15 mL/分钟的流速，其中在217 nm下进行流出物UV检测。缓冲液A为0.1% TFA/水。缓冲液B为0.1% TFA/MeCN。将含有来自三个制备HPLC运行的期望的产物的级分汇合，减压浓缩，冷冻和冻干，以得到1.68 g纯化的肽。将含有期望的肽但是不足够纯度的级分合并，浓缩，冷冻和冻干。如所描述的将这些物质经历进一步纯化，并且与1.68 g纯化的肽合并，以得到2.20 g最终肽(通过分析HPLC，99%纯)。

实施例DD

上述程序用于合成以下肽：

Claims

1.一种PAR4激动剂肽，所述肽包含式I的氨基酸序列，

Ala-Xaa1-Pro-Gly-Xaa₂-Leu-Val (式I)

其中，

所述肽的氨基末端为游离的；

X_aa1选自Tyr和Phe(4-F)；

C-末端被酰胺化。

2.权利要求1的PAR4激动剂肽，其中X_aa1为Phe(4-F)。

3.权利要求2的PAR4激动剂肽，其中X_aa2为Trp。

4.一种PAR4激动剂肽，所述肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

5.权利要求1的PAR4激动剂肽，所述肽在Val之后还包含Lys。

6.权利要求1的PAR4激动剂肽，所述肽在Val之后还包含Lys-Asn。

7.权利要求1的PAR4激动剂肽，所述肽在Val之后还包含Lys-Asn-Gly。

8.一种肽，所述肽包含式I的氨基酸序列，

Ala-Xaa₁-Pro-Gly-Xaa₂-Leu-Val (式I)

其中，

所述肽的氨基末端不与氨基酸稠合；

X_aa1选自Tyr和Phe(4-F)；

所述肽具有PAR4激动剂活性。

9.权利要求8的肽，其中X_aa1为Phe(4-F)。

10.权利要求8的肽，其中X_aa2为Trp。

11.一种肽，所述肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

12.权利要求8-10中任一项的肽，其中所述氨基酸序列在Val之后还包含Lys。

13.权利要求8-10中任一项的肽，其中所述氨基酸序列在Val之后还包含Lys-Asn。

14.权利要求8-10中任一项的肽，其中所述氨基酸序列在Val之后还包含Lys-Asn-Gly。

15.权利要求8-14中任一项的肽，其基本上由或由氨基酸序列组成。

16.权利要求8-15中任一项的肽，其中C-末端被酰胺化。

17.权利要求1-7中任一项的PAR4激动剂肽或权利要求8-16中任一项的肽，其激活PAR4受体。

18.权利要求17的PAR4激动剂肽或肽，其中所述PAR4受体激活通过血小板聚集测定法、FLIPR测定法或二者测量。

19.权利要求17或18的PAR4激动剂肽或肽，其中所述PAR4受体激活高于通过由SEQ ID NO：1组成的肽的PAR4受体激活。

20.权利要求19的PAR4激动剂肽或肽，其中所述PAR4受体激活比通过由SEQ ID NO：1组成的肽的PAR4受体激活高至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、或者至少约110倍。