CN104406946A - 一种直观检测蛋白棒贮藏稳定性变化的方法 - Google Patents

一种直观检测蛋白棒贮藏稳定性变化的方法 Download PDF

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周鹏
李娟�
贾晓戈
陆乃彦
张轩
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Abstract

本发明涉及一种直观检测蛋白棒贮藏稳定性变化的方法，采用的技术方案是：1)蛋白棒模型体系的制备；2)样品荧光染色；3)利用激光共聚焦扫描显微镜进行样品荧光漂白恢复测定。本发明具有可在线监测乳蛋白棒在贮藏过程中质地发生变化的程度，进而可预测蛋白棒等高蛋白产品的品质以及货架期，最终从分子水平揭示蛋白棒在贮藏初期质地发生硬化的内在机理原因。

Description

一种直观检测蛋白棒贮藏稳定性变化的方法
技术领域
本发明涉及一种直观检测蛋白棒贮藏稳定性变化的方法，特别是利用荧光漂白恢复技术监测蛋白棒贮藏稳定性变化的方法。
背景技术
蛋白棒以其蛋白质含量高和营养丰富等优点，受到军人、运动员等特殊人群以及越来越多大众的青睐。但是，目前市场上影响蛋白棒等产品发展的一个重要瓶颈原因是蛋白棒在贮藏过程中发生质地硬化的现象，严重影响了蛋白棒的贮藏稳定性和食用品质，限制了蛋白棒等产品的发展。而针对蛋白棒在贮藏过程中质地发生硬化的内在机理原因尚存在争议。
荧光漂白恢复技术(FRAP)是通过采用激光共聚焦扫描显微镜的高强度脉冲式激光照射生物体(例如：细胞)的某一区域，使得该区域的荧光分子淬灭。再利用低强度的激光扫描，来检测该区域周围非淬灭荧光分子向荧光漂白区域的扩散过程。
在本发明中，通过借助荧光漂白恢复技术对蛋白棒模拟体系进行实时动态监测，从分子水平更直观准确的来观测蛋白质分子的迁移过程(包括迁移路径、扩散速度等信息)，进而揭示造成蛋白棒尤其是在贮藏初期产品质地发生硬化的内在机理原因。
发明内容
针对目前市售蛋白棒等产品在贮藏过程中发生质地硬化及其硬化机理尚不明确等问题，本申请人经过研究，通过利用荧光漂白恢复技术，提供一种直观监测蛋白棒在贮藏过程中稳定性发生变化的方法，为今后解决有关蛋白棒质地硬化以及预测产品货架期等问题提供理论依据和数据支持。
本发明的技术方案如下：
一种直观检测蛋白棒贮藏稳定性变化的方法，其特征在于步骤如下：
(1)蛋白棒模型体系的制备。蛋白棒模型体系的配方如表1所示：
表1 蛋白棒模型体系制备配方
在本发明中，具体实验步骤为：将2.5g山梨醇溶解于1.25g超纯水中，再加入1.75g甘油进行搅拌。搅拌均匀后，使其混合物与4.5g乳蛋白粉混合2min，并揉制成均匀的面团。最后，将揉制好的面团用封口膜密封以防止水分蒸发并放入装有Mg(NO3)2过饱和溶液的干燥器中(aw＝0.53)以待测定。将密闭容器在室温下平衡0.5h后，进行第0d的取样。
(2)样品荧光染色
配制0.1～0.4mg/mL的异硫氰酸荧光素(FITC)/丙酮染色液，将4～8μg该染色液滴加于0.5～1.0g的样品中并进行混合；混合均匀后，将其中0.3g样品转移至玻底培养皿中，盖上盖玻片，并用AB胶封边；最后，将染色好的样品置于25℃恒温培养箱中并避光储存；此后，分别于第1、3、7d进行取样测定。
(3)荧光漂白恢复测定
观测时，将染色好的待测样品置于激光扫描显微镜的载物台上，并设定样品激发波长为485～495nm，发射波长为500～530nm，在1～20倍目镜下进行样品观测；在观察区域内选择边长为20～50μm的正方形区域作为漂白范围；设定荧光漂白强度100％，漂白程度为80％～100％；之后，实时监测漂白区域FITC-蛋白体系的荧光恢复情况，每隔一段时间进行图像采集记录荧光恢复情况。
本发明的有益技术效果如下：
1.利用荧光漂白恢复技术能更直观准确的展现蛋白棒模拟体系内部在贮藏过程中微观结构和分子迁移的变化，进而可预测蛋白棒产品的品质以及货架期。
2.揭示了蛋白棒质地发生硬化的原因是由于分子迁移聚集造成的，为解释蛋白棒产品质地发生硬化的现象提供了理论依据和数据支撑。
附图说明
图1A为实施例1中酪蛋白棒模拟体系贮藏第0天荧光漂白恢复结果图；
图1B为实施例1中酪蛋白棒模拟体系贮藏第1天荧光漂白恢复结果图；
图1C为实施例1中酪蛋白棒模拟体系贮藏第3天荧光漂白恢复结果图；
图1D为实施例1中酪蛋白棒模拟体系贮藏第7天荧光漂白恢复结果图；
图2A为实施例2中乳清蛋白棒模拟体系贮藏第0天荧光漂白恢复结果图；
图2B为实施例2中乳清蛋白棒模拟体系贮藏第1天荧光漂白恢复结果图；
图2C为实施例2中乳清蛋白棒模拟体系贮藏第3天荧光漂白恢复结果图；
图2D为实施例2中乳清蛋白棒模拟体系贮藏第7天荧光漂白恢复结果图；
图3A为实施例3中浓缩乳蛋白棒模拟体系贮藏第0天荧光漂白恢复结果图；
图3B为实施例3中浓缩乳蛋白棒模拟体系贮藏第1天荧光漂白恢复结果图；
图3C为实施例3中浓缩乳蛋白棒模拟体系贮藏第3天荧光漂白恢复结果图；
图3D为实施例3中浓缩乳蛋白棒模拟体系贮藏第7天荧光漂白恢复结果图。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明进一步详细说明，但不限于下述实施例。
实施例1
一种直观检测蛋白棒贮藏稳定性变化的方法，采用的技术方案是：
1)酪蛋白棒模型体系的制备
将2.5g山梨醇溶解于1.25g超纯水中，再加入1.75g甘油进行搅拌。搅拌均匀后，使其混合物与4.5g酪蛋白酸钠混合2min，并揉制成均匀的面团。最后，将揉制好的面团用封口膜密封以防止水分蒸发并放入装有Mg(NO3)2过饱和溶液的干燥器中(aw＝0.53)以待测定。将密闭容器在室温下平衡0.5h后，进行第0d的取样。
2)样品荧光染色
配制0.2mg/mL的异硫氰酸荧光素(FITC)/丙酮染色液，将6μg该染色液滴加于0.5g的酪蛋白酸钠面团中并进行混合。混合均匀后，将其中0.3g染色好的酪蛋白酸钠面团转移至玻底培养皿中，盖上盖玻片，并用AB胶封边。最后，将染色好的酪蛋白酸钠面团置于25℃恒温培养箱中并避光储存。此后，分别于第1、3、7d进行取样测定。
3)荧光漂白恢复测定
观测时，将染色好的酪蛋白酸钠面团置于激光扫描显微镜的载物台上，并设定样品激发波长为488nm，发射波长为510nm，在20倍目镜下进行样品观测。在观察区域内选择边长为20μm的正方形区域作为漂白范围。设定荧光漂白强度100％，漂白程度为80％～100％。之后，实时监测漂白区域FITC-蛋白体系的荧光恢复情况，每隔一段时间进行图像采集记录荧光恢复情况。实验结果如图1所示：图1A所示的酪蛋白棒模型体系在第0天时在30min完成了荧光漂白恢复；图1B所示的酪蛋白棒模型体系在第1天时在240min基本完成了荧光漂白恢复；图1C、D所示的酪蛋白棒模型体系在第3、7天时在240min都未完成荧光漂白恢复。实验结果表明，酪蛋白棒模型体系在贮藏3天以后质地开始发生硬化。
实施例2
一种直观检测蛋白棒贮藏稳定性变化的方法，采用的技术方案是：
1)乳清蛋白棒模型体系的制备
将2.5g山梨醇溶解于1.25g超纯水中，再加入1.75g甘油进行搅拌。搅拌均匀后，使其混合物与4.5g乳清蛋白混合2min，并揉制成均匀的面团。最后，将揉制好的面团用封口膜密封以防止水分蒸发并放入装有Mg(NO3)2过饱和溶液的干燥器中(aw＝0.53)以待测定。将密闭容器在室温下平衡0.5h后，进行第0d的取样。
2)样品荧光染色
同实施例1。
3)荧光漂白恢复测定
同实施例1。实验结果如图2所示。图2A所示的乳清蛋白棒模型体系在第0天时在44min完成了荧光漂白恢复；图2B所示的乳清蛋白棒模型体系在第1天时在240min尚未完成荧光漂白恢复；图2C、D所示的乳清蛋白棒模型体系在第3、7天时在240min都未完成荧光漂白恢复，且荧光漂白恢复的程度不及贮藏第3天的荧光恢复程度。实验结果表明，乳清蛋白棒模型体系在贮藏1天以后质地开始发生硬化。
实施例3
一种直观检测蛋白棒贮藏稳定性变化的方法，采用的技术方案是：
1)浓缩乳蛋白棒模型体系的制备
将2.5g山梨醇溶解于1.25g超纯水中，再加入1.75g甘油进行搅拌。搅拌均匀后，使其混合物与4.5g浓缩乳蛋白混合2min，并揉制成均匀的面团。最后，将揉制好的面团用封口膜密封以防止水分蒸发并放入装有Mg(NO3)2过饱和溶液的干燥器中(aw＝0.53)以待测定。将密闭容器在室温下平衡0.5h后，进行第0d的取样。
2)样品荧光染色
同实施例1。
3)荧光漂白恢复测定
同实施例1。实验结果如图3所示。图3A所示的浓缩乳蛋白棒模型体系在第0天时在15min完成了荧光漂白恢复；图3B所示的浓缩乳蛋白棒模型体系在第1天时在15min完成荧光漂白恢复；图3C所示的浓缩乳蛋白棒模型体系在第3天时在15min完成了荧光漂白恢复；图3D所示的浓缩乳蛋白棒模型体系在第7天时在60min完成了荧光漂白恢复。实验结果表明，浓缩乳蛋白棒模型体系在前3天贮藏稳定性较好，在第7天以后开始发生轻微的质地硬化。

Claims (3)

1.一种直观检测蛋白棒贮藏稳定性变化的方法，其特征是将荧光染色的蛋白棒模型体系采用荧光漂白恢复技术测定其分子迁移情况。
2.如权利要求1所述的一种直观检测蛋白棒贮藏稳定性变化的方法，其特征是样品荧光染色具体工艺为：配制0.1～0.4mg/mL的异硫氰酸荧光素(FITC)/丙酮染色液，将4～8μg该染色液滴加于0.5～1.0g的样品中并进行混合；混合均匀后，将其中0.3g样品转移至玻底培养皿中，盖上盖玻片，并用AB胶封边；最后，将染色好的样品置于25℃恒温培养箱中并避光储存；此后，分别于第1、3、7d进行取样测定。
3.如权利要求1所述的一种直观检测蛋白棒贮藏稳定性变化的方法，其特征是荧光漂白恢复技术具体操作为：将染色好的待测样品置于激光扫描显微镜的载物台上，并设定样品激发波长为485～495nm，发射波长为500～530nm，在1～20倍目镜下进行样品观测；在观察区域内选择边长为20～50μm的正方形区域作为漂白范围；设定荧光漂白强度100％，漂白程度为80％～100％；之后，实时监测漂白区域FITC-蛋白体系的荧光恢复情况，每隔一段时间进行图像采集记录荧光恢复情况。
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