CN104406936A - 一种基于多孔硅的阵列生物芯片及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于多孔硅的阵列生物芯片的制备方法及其用途,步骤1:单晶硅片单面抛光,采用电化学方法制备出多孔硅Bragg多层结构,硅片未抛光面称为待光刻层;步骤2:在前述待光刻层上,进行高能激光刻蚀、聚焦电子或离子束刻蚀,得到表面为阵列光子晶体的器件;步骤3:对得到的硅片进行后处理:硅烷化;步骤4:步骤3得到的硅片进行戊二醛化学修饰;即得一面为层状Bragg反射器,另一面为光子晶体的基于多孔硅的阵列生物芯片。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于多孔硅的阵列生物芯片及其制备方法。
背景技术
多孔硅作为基底材料用于生物检测已经被广泛的作为实验研究和应用。多孔硅通过电化学腐蚀的时候交替使用不同电流,可以制备出各种多孔硅多层结构,电化学腐蚀技术配合光刻等技术还可以制备出多孔硅波导、多孔硅光栅等各种结构。无论哪种类型的多孔硅生物传感器归根到底原理都是生物分子进入了多孔硅层的多孔结构后增大了多孔硅层的折射率,折射率增大的多少和进入生物分子的多少有关,因此利用多孔硅层的折射率的改变,就可以通过计算机模拟加入生物的实验。
目前报道的基于多孔硅微腔的生物传感器很多,检测方法包括:反射光谱的检测和拉曼、荧光光谱的检测。
CN101710118A公开了一种基于多孔硅三元结构微腔的光学免疫检测方法,该方法采用基于计算机精确控制的电化学腐蚀方法制备多孔硅微腔,其中多孔硅微腔内上、下的Bragg结构由三种电流密度交替进行电化学腐蚀而形成,其特征在于对于不同条件制备的多孔硅微腔进行编码可以实现多元检测,如果是一元检测则不需要编码,使抗体或抗原在多孔硅三元结构微腔的孔洞里结合,多元检测中抗原或抗体的种类利用多孔硅微腔的编码进行标识,而通过生物反应前后的光谱峰位变化进行检测样品中相应的抗原或抗体浓度,所述检测方法包括以下步骤:
1)抗原或抗体固定在多孔硅微腔的孔洞里,如果是需要编码的多元检测,那么一种编码的多孔硅微腔对应固定一种待测生物分子的特异性抗原或抗体,冲洗未结合的分子并封闭多孔硅微腔里的未结合生物分子的空白键位,记录测定固定有抗原或抗体的多孔硅微腔光谱;
2)不同多孔硅微腔与不同浓度待测溶液发生反应,使抗原-抗体在多孔硅微腔的孔洞里特异性结合,反应后进行冲洗,记录多孔硅微腔光谱及编码确定种类和浓度。
这种光学免疫检测方法不仅兼具多孔硅和光子带隙结构传感器的诸多优异性能,而且结构稳定性很好,通过编码检测技术更是可以实现多元检测。此外,由于采用的制备方法较为简单,价格相对低廉,有一定的商业应用前景。
CN1922486A公开了一种用于分析生物样品中内含物的方法,包括:a)在合适的结合条件下,使所述生物样品与纳米多孔半导体传感器接触,所述纳米多孔半导体传感器包括纳米多孔半导体结构和连接到所述多孔半导体结构上的一个或多个第一探针,所述纳米多孔半导体结构包括置于上层和下层之间的中心层,所述上层和下层都包括5至20层交替多孔性层;所述一个或多个第一探针特异性结合所述样品中的至少一个分析物,形成一个或多个结合复合物;b)在适合促进它们的特异性结合的条件下,使所述一个或多个结合复合物与拉曼活性探针接触;c)照射所述传感器,以便从所述传感器引发荧光发射,所述发射产生来自所述结合复合物的拉曼光谱;和d)检测由所述结合复合物产生的拉曼信号;其中,与所述结合分析物有关的拉曼信号表明所述样品中所述分析物的存在以及类型。
该方法提供用级联拉曼传感用于分析生物样品例如血清中内含物的方法。使具有特异性结合已知分析物的探针的、产生荧光的纳米多孔生物传感器与生物样品接触,形成连接于多孔半导体结构的一个或多个结合复合物。将结合复合物与拉曼活性探针接触,该拉曼活性探针特异性结合该结合复合物,照射生物传感器,从生物传感器产生荧光发射。检测结合复合物产生的拉曼信号,与结合的含蛋白质分析物有关的拉曼信号表明样品中含蛋白质化合物的存在。
CN103979543A公开了一种多孔硅的修饰方法及其用作生物传感器的用途,通过电化学刻蚀方法制备多孔硅,刻蚀液为氢氟酸:无水乙醇体积比为3:1;优选地电流密度为600mA/cm2,蚀刻时间为20秒;⑵将步骤⑴得到的多孔硅进行烷氧基硅烷修饰;⑶将步骤⑵得到的烷氧基硅烷修饰的多孔硅与4-(二乙氨基)水杨醛反应,得到带有芳叔胺基团的多孔硅;⑷将步骤⑶得到的带有芳叔胺基团的多孔硅浸泡在离子交换水中,去除残存的有机物。通过对多孔硅进行修饰,得到了制备工艺简单,价格低廉的修饰多孔硅,检测灵敏度达到8400±100nm/折射率单位以上,能够进行实时在线非标记光学检测生物分子。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于多孔硅的阵列生物芯片及其制备方法,及其用于生物检测的方法。
首先,单晶硅片单面抛光,采用电化学方法制备出多孔硅多层结构;硅片未抛光的一面称为待光刻层;其次,在待光刻层上进行高能激光刻蚀、聚焦电子或离子束刻蚀,得到表面为阵列光子晶体的硅片;最后,对得到的阵列硅片进行后处理:硅烷化和戊二醛化学修饰;即得一面为层状Bragg反射器,另一面为光子晶体的基于多孔硅的阵列生物芯片。
将该阵列生物芯片用于折射率检测,功能化器件后添加生物分子,造成折射率增加,通过FDTD法计算可知,这种结构的反射谱中出现非常尖锐且反射率极强的峰值,并对光子晶体折射率变化极为敏感,具有极高的探测灵敏度。
步骤1.多孔硅的制备:
P型单晶硅的电化学阳极腐蚀制备多孔硅。
采用 P 型<100>单面抛光单晶硅片,厚度为 500±10μm。实验前分别用丙酮、无水乙醇、去离子水对硅片进行超声洗 15 分钟。对经过清洗后的单晶硅片进行电化学腐蚀。腐蚀液是由 40%的氢氟酸和 99%的乙醇按照体积比HF:CH3CH2OH=1:1 比例混合而成。腐蚀过程分别由电流密度为 100-150mA/cm2和300-400mA/cm2的恒流源引导。首先用电流密度为 100-150mA/cm2, 腐蚀时间为 10-20s,暂停5-10s,再用电流密度为 300-400 mA/cm2, 腐蚀时间为 10-20 s,再暂停 5-10 s,以此交替腐蚀8-10个周期。硅片未抛光的一面称为待光刻层。
步骤2. 表面光子晶体的制备
使用高能激光刻蚀、聚焦电子或离子束刻蚀等手段,在待光刻层上按预定设计制出阵列凹槽,凹槽宽度可通过选择合适的激光束斑尺寸、电子或离子束能量来控制。
步骤3.将得到的硅片进行烷氧基硅烷修饰
将步骤2得到的硅片以质量比1:20-30分散于有机溶剂中,超声处理1-2h,滴加烷氧基硅烷,90-100oC反应2-4h,反应结束后过滤除去溶剂,用无水乙醇洗涤数次,真空干燥,即得烷氧基硅烷修饰的硅片。
步骤4.将得到的烷氧基硅烷修饰的硅片与戊二醛反应:
将步骤3得到的烷氧基硅烷修饰的硅片分散到无水乙醇中,超声处理10-20min,加入戊二醛,搅拌回流6-8h后倾出上层悬浮液,过滤除去溶剂后用无水乙醇洗涤数次,真空干燥;烷氧基硅烷修饰的硅片与戊二醛的质量比为1:5-10;将得到的硅片浸泡在离子交换水中,去除残存的有机物。
优选地,步骤3中有机溶剂为甲苯或二甲苯或THF或DMF,溶剂的选择对于最终得到的硅片的灵敏度影响不大;烷氧基硅烷优选为γ-氨丙基三甲氧基硅烷或γ-氨丙基三乙氧基硅烷,其中,烷氧基硅烷与硅片的质量比为1:0.1-1:0.5。
优选地,通过刻蚀技术得到的表面光子晶体层的厚度与层状Bragg反射器的厚度比值为1:2-3:4,更加优选地为2:3.
本发明中通过电化学和刻蚀技术相结合的方法,得到一面为层状Bragg反射器,另一面为光子晶体的基于多孔硅的阵列生物芯片,产品的检测灵敏度可以高达10000±100nm/折射率单位以上。
具体实施方式
实施例1:
⑴通过电化学刻蚀方法制备多孔硅:采用 P 型<100>单面抛光单晶硅片,厚度为 500±10μm。实验前分别用丙酮、无水乙醇、去离子水对硅片进行超声洗 15 分钟。对经过清洗后的单晶硅片进行电化学腐蚀。腐蚀液是由 40%的氢氟酸和 99%的乙醇按照体积比HF:CH3CH2OH=1:1 比例混合而成。腐蚀过程分别由电流密度为 120mA/cm2和350mA/cm2的恒流源引导。首先用电流密度为 120mA/cm2, 腐蚀时间为 15s,暂停6s,再用电流密度为 350 mA/cm2, 腐蚀时间为 15 s,再暂停 6 s,以此交替腐蚀10个周期。硅片未抛光的一面称为待光刻层。
⑵使用聚焦电子束刻蚀手段,在待光刻层上按预定设计制出阵列凹槽,凹槽宽度可通过选择合适的电子束能量来控制。
⑶将步骤2得到的硅片以质量比1:20分散于有机溶剂甲苯中,超声处理1h,滴加烷氧基硅烷,90oC反应2h,反应结束后过滤除去溶剂,用无水乙醇洗涤数次,真空干燥,即得烷氧基硅烷修饰的硅片。
⑷将步骤3得到的烷氧基硅烷修饰的硅片分散到无水乙醇中,超声处理10min,加入戊二醛,搅拌回流6h后倾出上层悬浮液,过滤除去溶剂后用无水乙醇洗涤数次,真空干燥;烷氧基硅烷修饰的硅片与戊二醛的质量比为1:5;将得到的硅片浸泡在离子交换水中,去除残存的有机物。
经测试,通过电子束刻蚀技术得到的表面光子晶体层的厚度与层状Bragg反射器的厚度比值为1:2。
制备的经修饰的多孔硅阵列生物芯片的稳定性检测:修饰的多孔硅阵列生物芯片试样放入聚甲基丙烯酸甲酯制成的流式槽中,不同的pH值的磷酸盐缓冲液依次通过微流泵送入流式槽中,每次送入缓冲液前用pH7.4,0.01M磷酸盐缓冲液洗涤流式槽5分钟。光学反射干涉光谱通过γ型光纤拾取光学信号,实时监控薄膜光学厚度变化。结果发现经修饰的多孔硅阵列生物芯片的光学厚度在pH2-12范围变化的磷酸盐缓冲液中,变化很稳定。
灵敏度检测:将10uL不同折射率的有机化合物滴在硅片的表面,检测光学厚度的变化,以折射率为横轴,光学厚度为纵轴绘制线性关系图,以折射率改变1个单位的光学厚度变化量为试样的灵敏度。本发明实施例1中多孔硅阵列生物芯片的灵敏度为10850±90nm/折射率单位。
实施例2:
步骤3中的有机溶剂选用THF,其它同实施例1.所得的灵敏度达到11800±80nm/折射率单位。
实施例3:
步骤3中的有机溶剂选用DMF,其它同实施例1.所得的灵敏度达到11500±50nm/折射率单位。
实施例4:
步骤3中的有机溶剂选用二甲苯,其它同实施例1.所得的灵敏度达到10810±50nm/折射率单位。
实施例5:
调整工艺参数,使得通过电子束刻蚀技术得到的表面光子晶体层的厚度与层状Bragg反射器的厚度比值为2:3. 所得的灵敏度达到13000±50nm/折射率单位。
实施例6:
调整工艺参数,使得通过电子束刻蚀技术得到的表面光子晶体层的厚度与层状Bragg反射器的厚度比值为3:4. 所得的灵敏度达到10750±50nm/折射率单位。
对比例1:
按照CN103979543A的方法制备多孔硅片,测试所得到的灵敏度为8600±110nm/折射率单位。
对比例2:
基本同实施例1,区别在于:过电子束刻蚀技术得到的表面光子晶体层的厚度与层状Bragg反射器的厚度比值为1:3. 测试所得到的灵敏度为8700±75nm/折射率单位。
对比例3:
基本同实施例1,区别在于:通过电子束刻蚀技术得到的表面光子晶体层的厚度与层状Bragg反射器的厚度比值为4:5. 测试所得到的灵敏度为8800±90nm/折射率单位。
通过实施例1与比较例1对比可见,本发明的步骤2处理均对最终多孔硅阵列生物芯片的灵敏度有重要影响。本发明的灵敏度均在10000nm/折射率单位以上,而现有技术均在9000 nm/折射率单位以下,这是因为表面光子晶体增强了对生物分子的激发强度,而层状光子晶体阻止向下辐射的自由空间模,增强表面的岀射光强度。
实施例1与2-4的比较可见,步骤3中溶剂的选择对最终产品的灵敏度没有太大影响,THF和DMF作为溶剂的灵敏度稍高,原理尚不清楚。
实施例1与实施例5-6,比较例2-3的对比可见,通过步骤2刻蚀技术得到的表面光子晶体层的厚度与通过步骤1得到的层状Bragg反射器的厚度比值为1:2-3:4为佳, 其中2:3为最佳,若厚度比值不在此数值范围内,则起不到灵敏度增高的效果,原理尚不明确。
Claims (10)
1.一种基于多孔硅的阵列生物芯片的制备方法,其特征在于:步骤1:单晶硅片单面抛光,采用电化学方法制备出多孔硅Bragg多层结构,硅片未抛光的一面称为待光刻层;步骤2:在前述待光刻层上,进行高能激光刻蚀、聚焦电子或离子束刻蚀,得到表面为阵列光子晶体的硅片;步骤3:对得到的硅片进行后处理:硅烷化;步骤4:步骤3得到的硅烷化的硅片进行戊二醛化学修饰;即得一面为层状Bragg反射器,另一面为光子晶体的基于多孔硅的阵列生物芯片;通过步骤2的刻蚀技术得到的表面光子晶体层的厚度与通过步骤1得到的层状Bragg反射器的厚度比值为1:2-3:4。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:通过步骤2的刻蚀技术得到的表面光子晶体层的厚度与通过步骤1得到的层状Bragg反射器的厚度比值为2:3。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤1中多孔硅的制备方法为P型单晶硅的电化学阳极腐蚀制备方法,包括步骤:采用 P 型<100>单面抛光单晶硅片,厚度为 500±10μm,实验前分别用丙酮、无水乙醇、去离子水对硅片进行超声洗 15 分钟,对清洗后的单晶硅片进行电化学腐蚀,腐蚀液是由 40%的氢氟酸和 99%的乙醇按照体积比HF:CH3CH2OH=1:1 比例混合而成,腐蚀过程分别由电流密度为 100-150mA/cm2和300-400mA/cm2的恒流源引导,首先用电流密度为 100-150mA/cm2的电流腐蚀10-20s,暂停5-10s,再用电流密度为 300-400 mA/cm2的电流腐蚀 10-20 s,再暂停 5-10 s,以此交替腐蚀8-10个周期。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤2中使用高能激光刻蚀、聚焦电子或离子束刻蚀,在待光刻层上按预定设计制出阵列凹槽,凹槽宽度可通过选择合适的激光束斑尺寸、电子或离子束能量来控制。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:将步骤2得到的表面为阵列光子晶体的阵列硅片以质量比1:20-30分散于有机溶剂中,超声处理1-2h,滴加烷氧基硅烷,90-100oC反应2-4h,反应结束后过滤除去溶剂,用无水乙醇洗涤数次,真空干燥,即得烷氧基硅烷修饰的硅片;烷氧基硅烷与硅片的质量比为1:0.1-1:0.5。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:所述有机溶剂为THF或DMF;烷氧基硅烷优选为γ-氨丙基三甲氧基硅烷或γ-氨丙基三乙氧基硅烷。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:将步骤3得到的烷氧基硅烷修饰的硅片分散到无水乙醇中,超声处理10-20min,加入戊二醛,搅拌回流6-8h后倾出上层悬浮液,过滤除去溶剂后用无水乙醇洗涤数次,真空干燥;烷氧基硅烷修饰的硅片与戊二醛的质量比为1:5-10;将得到的硅片浸泡在离子交换水中,去除残存的有机物。
8.根据权利要求1所述的方法制备得到的基于多孔硅的阵列生物芯片。
9.权利要求8所述的芯片作为生物传感器用于光学非标记生物检测的用途。
10.根据权利要求9所述的用途,其特征在于:待测样品是各种可溶性受体分子,优选是血清、组织液、毒品或兴奋剂。
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Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |