CN104402051A - 一种单层荧光纳米二硫化钼的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及的是一种简单“绿色”的方法合成单层荧光纳米二硫化钼，属于生物医药领域。其特征是通过溶剂将粒径为微米级别的二硫化钼粉末分散，借助于超声的手段，使二硫化钼粉末分层断裂，接着离心、真空干燥、纯化从而制得纳米二硫化钼，为了增加纳米二硫化钼的溶解性，在溶剂中加入氢氧化钠。制得的纳米二硫化钼材料单层率好，荧光稳定性好，量子产率高。本方法不产生对环境有害的物质，合成过程简单，制备得到的荧光纳米二硫化钼，与其它纳米载体相比，它的优点有：载药量大、毒性小、细胞中示踪，受外界干扰小等。由于其较高的比表面积和自身的荧光，可以广泛的应用于生物医药领域。

Description

一种单层荧光纳米二硫化钼的制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及的是一种简单“绿色”的方法制备单层荧光纳米二硫化钼。
背景技术
近年来，随着microRNA(miRNA)在生物体中所起的重要调控作用逐渐地引起广大研究者的兴趣，对miRNA在细胞内的分析检测要求也越来越高。常见病毒载体对人体有一定的危害，而大多数非病毒载体转载量少，且缺少靶细胞定向能力。以无机非金属纳米材料为载体，与其它基因载体相比较在靶向运输和细胞毒性上具有较大的优势因而受到各研究领域的广泛关注。
介孔二氧化硅载体作为现今研究比较热门的纳米材料，各种不同的方法探索合成均匀性好，纯度高，成本低，方法简单的介孔二氧化硅。介孔二氧化硅由于其球体上大量的介孔存在，比表面积增加，大大增加了其负载量。而这种纳米材料主要有二氧化硅组成，其对生物体的毒性大大降低，在药物控制释放等领域得到了大量的应用。
虽然介孔二氧化硅载体具有诸多优点，但是仍然存在一些待解决的问题限制了其在实际中的应用。介孔二氧化硅载体在转载药物和基因时，需用封堵剂封堵介孔，这增加了实验步骤，且封堵剂有时对生物体也是有害的。类石墨烯纳米材料，由于其极高的比表面积，有报道称其负载量高达400％，与传统的脂质体和介孔二氧化硅载体负载量的4倍多。
本发明旨在制备一种多功能基因运输载体。采用液相超声法制备的单层荧光纳米二硫化钼作为类石墨烯纳米材料中新的一员，其自身的荧光，可以在细胞中定位，较小的尺寸对细胞的毒性也几乎可以不计，高的负载量以提高运输效率，是一种较好的基因载体，在生物医药领域能得到广泛的引用。
发明内容
本发明的目的在于克服现如今应用的基因载体的缺陷，发明了一种具有准零维结构的单层荧光纳米二硫化钼载体，其细胞毒性小，负载量高，自身在细胞中定位，可以用于细胞成像，细胞内miRNA检测时的多功能基因载体。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种单层荧光纳米二硫化钼材料，其特征在于以微米级别的二硫化钼粉末为原料，液相超声法得到荧光纳米二硫化钼，粒径大小为30-40nm，荧光发射峰在450-550nm范围内，其中最大荧光发射峰在470nm处。
本发明方法具体步骤为：
a.将二硫化钼粉末溶解到溶剂中，配成1-10mg/mL的悬浊液A；
b.在步骤a所得的悬浊液A中加入适量氢氧化钠，使氢氧化钠的浓度为1mg/mL，得到悬浊液B；
c.将步骤b所得的悬浊液B在超声破碎仪(功率大于100W)中超声10小时以上，得到悬浊液C；
d.将步骤c制得的悬浊液C离心取上清，放入真空干燥箱中干燥，得到粉末；
e.将一定体积的去离子水加入步骤d所得的粉末中，配成1mg/mL溶液，超声辅助溶解，用0.22μm的过滤膜过滤得到溶液；
f.用分子量为1000的透析袋去透析步骤e所得的溶液，去除杂质小分子，最终得到荧光纳米二硫化钼材料。
根据权利要求2所述的荧光纳米二硫化钼材料的制备方法，其特征在于步骤a中的溶剂最好为N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。
其中步骤c中超声时间最好为20小时。
为了测试所制备多功能材料作为基因载体的实用性，本发明将单层荧光纳米二硫化钼载体以不同的浓度与HeLa细胞温浴，并用浓度为100μg/mL的载体与带有荧光集团标记的DNA共同孵育后，转染进入HeLa细胞，最后用激光共聚焦显微镜观察转染之后的细胞。本发明所制备纳米二硫化钼载体在浓度高达200μg/mL时，细胞存活率仍然在90％以上，而激光共聚焦显微镜观察到的图像显示出载体与DNA在细胞中存在于不同的地方。
同其他的无机非金属纳米载体相比，我们制备的基因载体具备以下的特点，本发明制备方法的特点在于：
(1)制备工艺简单，二硫化钼载体通过一步法制得，制备周期短，效率高；合成过程不产生任何对环境有害的物质。
(2)应用这种简单的方法制备的单层荧光纳米二硫化钼单层率高，量子差率高，均一性好。
(3)应用这种简单的方法制备的单层荧光纳米二硫化钼应用于细胞成像和细胞内miRNA分析时，细胞毒性小，负载量大。
附图说明
图1NMP为溶剂超声剥离制备单层荧光纳米二硫化钼TEM图片。
图2NMP为溶剂超声剥离制备单层荧光纳米二硫化钼AFM图片。
图3NMP为溶剂超声剥离制备单层荧光纳米二硫化钼荧光图谱。
图4NMP为溶剂超声剥离制备单层荧光纳米二硫化钼细胞毒性图。
图5NMP为溶剂超声剥离制备单层荧光纳米二硫化钼/DNA转染细胞激光共聚焦显微镜图片。
图6以乙醇水为溶剂超声剥离制备单层荧光纳米二硫化钼AFM图片。
具体实施方式
实施例对本发明作进一步说明，本发明的保护内容不限于以下实例。在不背离发明构思的范围下，本领域技术人员能够想到的变化都包括在本发明中，并以权利要求书为保护范围。
实施例1
以NMP为溶剂超声剥离制备单层荧光纳米二硫化钼，具体操作步骤如下：
将100mg粒径为1.5μm的二硫化钼粉末溶解到10mL NMP中，制备10mg/mL的二硫化钼悬浊液；在悬浊液中加入10mg氢氧化钠，使氢氧化钠的浓度为1mg/mL，再将悬浊液放在功率为200W的超声破碎仪中间断累积超声20h；接着将超声得到的溶液放入5mL的离心管中，4500rpm，离心30min，收集取上清液放入真空干燥箱中，120℃干燥过夜；然后将一定体积的去离子水加入干燥所得的粉末中，超声辅助溶解，用0.22μm的过滤膜过滤；最后用分子量为1000的透析袋透析过滤后的溶液，去除杂质小分子，最终得到荧光纳米二硫化钼材料。
将制备好的荧光二硫化钼纳米粒子100μg/mL与带有荧光集团标记的DNA共同孵育后，转染进入HeLa细胞，转染12小时后用激光共聚焦显微镜观察转染之后的细胞。
将制备好的荧光纳米二硫化钼溶液按不同的浓度与HeLa细胞孵育，使二硫化钼纳米粒子的最终浓度分别为10、50、100、200μg/mL，检测荧光纳米二硫化钼粒子的毒性。
产物的TEM见图1与AFM见图2所示，由图可知我们成功制备了单层荧光纳米二硫化钼，纳米粒子粒径在30-40nm之间，粒径分布均匀，且单层率较高。图3是制备的纳米粒子的荧光光谱，随着激发光波长的不同，纳米粒子的发射光的波长也不同，其中最大激发波长为370nm，最大发射波长为470nm。图4与图5为细胞毒性试验图与激光共聚焦显微镜图片，二硫化钼纳米粒子在浓度高达200μg/mL时，细胞存活率仍然在90％以上，说明其对细胞的毒性可以忽略不计，而激光共聚焦显微镜观察到的图像显示出二硫化钼纳米粒子与DNA在细胞中存在于不同的地方。
实施例2
以乙醇水为溶剂超声剥离制备单层荧光纳米二硫化钼，具体操作步骤如下：
10mL45％的乙醇水溶液加入到100mg的二硫化钼粉末中，并添加氢氧化钠(1mg/mL)，超声剥离20小时，离心、真空干燥、过滤后得到产物。如图6所示，制备的纳米粒子单层率较低，且粒径分布不均匀。
实施例3
以异丙醇为溶剂超声剥离制备单层荧光纳米二硫化钼，具体操作步骤如下：
10mL异丙醇加入到100mg的二硫化钼粉末中，并添加氢氧化钠(1mg/mL)，超声剥离20小时，离心、真空干燥、过滤后得到产物。制备的纳米粒子产率较低。

Claims (4)

1.一种单层荧光纳米二硫化钼材料，其特征在于以微米级别的二硫化钼粉末为原料，液相超声法得到荧光纳米二硫化钼，粒径大小为30-40nm，荧光发射峰在450-550nm范围内，其中最大荧光发射峰在470nm处。
2.根据权利要求1所述的一种单层荧光纳米二硫化钼材料的制备方法，其特征在于具体步骤为：
a.将二硫化钼粉末溶解到溶剂中，配成1-10mg/mL的悬浊液A；
b.在步骤a所得的悬浊液A中加入适量氢氧化钠，使氢氧化钠的浓度为1mg/mL，得到悬浊液B；
c.将步骤b所得的悬浊液B在功率大于100W的超声破碎仪中超声10小时以上，得到悬浊液C；
d.将步骤c制得的悬浊液C离心取上清，放入真空干燥箱中干燥，得到粉末；
e.将一定体积的去离子水加入步骤d所得的粉末中，配成1mg/mL溶液，超声辅助溶解，用0.22μm的过滤膜过滤得到溶液；
f.用分子量为1000的透析袋去透析步骤e所得的溶液，去除杂质小分子，最终得到荧光纳米二硫化钼材料。
3.根据权利要求2所述的荧光纳米二硫化钼材料的制备方法，其特征在于步骤a中的溶剂为N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。
4.根据权利要求2所述的荧光纳米二硫化钼材料的制备方法，其特征在于步骤c中超声时间为20小时。
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