CN104397035A - 一种含有甲基营养型芽孢杆菌与叶枯唑的杀细菌组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杀细菌组合物，所述组合物含有活性成分甲基营养型芽孢杆菌和叶枯唑，其中二者的重量比为30:1-1:30。本发明还涉及一种杀细菌剂，其含有1～90重量％所述的杀细菌组合物，余量为农药上可接受的载体和助剂。进一步地，本发明还涉及所述杀细菌组合物或杀细菌剂用于防治烟草青枯病、水稻白叶枯病或大白菜软腐病的应用。相比单剂而言，甲基营养型芽孢杆菌和叶枯唑组合后的增效系数均在130以上，具有良好的增效作用；本发明的杀细菌组合物能良好地延缓单剂的抗药性。

Description

一种含有甲基营养型芽孢杆菌与叶枯唑的杀细菌组合物及其应用

技术领域

本发明涉及农药领域，特别是杀细菌剂领域，具体地说是含有甲基营养型芽孢杆菌和叶枯唑的杀细菌组合物及其应用。

技术背景

甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)是芽孢杆菌属中的一个种。革兰氏阳性，葡萄糖、阿拉伯糖、接触酶、脂肪酶、脲酶及氧化酶均呈阳性、好氧，杆状，具备运动能力。

研究发现芽孢杆菌菌株中不存在常见的毒素基因(HBL、BcET、NHE、entFM)、鞘磷脂酶(Sph)、磷脂酶(PI-PLC)；也不与NHE、HBL抗体反应。认为分离自传统发酵食品芽孢杆菌菌株在安全性上是有保证的。

在我国农业快速发展过程中，病虫危害是制约我国农业持续稳定发展的重要因素。近年来，我国农作物病害年平均发生面积超过1亿公顷，每年粮食的病虫危害损失约为3000多万吨，致使我国经济损失高达300多亿。据统计，我国被农药污染的农田达933万hm2以上，每年死于农药污染食品的为0.83万人，每年因农药污染造成的直接经济损失就高达160多亿元人民币。利用无公害农药防治植物病害，减少化学农药使用量和减轻农药污染，保证食品安全和发展有机农业已成为本世纪我国发展现代农业和有机农业当务之急。

另一方面，近年来，随着作物品种、种植条件的改变，原有的一些并未引起太多重视的细菌性病害逐渐成为重要病害。例如，烟草青枯病、水稻白叶枯病、大白菜软腐病等细菌性病害危害越来越严重。

芽孢杆菌因其安全性和能产生多种抗菌物质及酶的特性而受到生物防治工作者的偏爱。而且经培养发酵可加工成生物菌剂，开发应用潜力大。目前已有一些优良的芽孢杆菌菌株应用于生产实践。

甲基营养型芽孢杆菌是芽孢杆菌的一种，具有高杀细菌活性、杀菌谱广及具有促生作用的环境友好型生物菌株。

叶枯唑，又称噻枯唑，主要用来防治植物细菌性病害，对水稻白叶枯病和细菌性条斑病、柑桔溃疡病有较好的防治效果。内吸杀细菌剂。具有良好治疗和预防作用。对细菌病害有较好的防效。抗雨水冲刷，喷药后4小时遇雨对药效无影响。本品属低毒性杀细菌剂。无致癌、致畸、致突变作用。对鱼类安全。急性口服LD50：原药小鼠为3180-6200mg/kg，原药大鼠急性经口LD50为3160-8250mg/kg。大鼠以含0.25mg/kg饲养一年无不良影呐。

近年来的大田应用中发现，上述两种已知杀细菌剂在应用过程中出现了杀菌活性不够高，同时个别病害也逐渐出现了抗药性。

发明内容

本发明旨在提供一种有效防治烟草青枯病、水稻白叶枯病、水稻细菌性条斑病、柑橘溃疡病、大白菜软腐病等细菌性病害的杀细菌组合物。该杀细菌组合物相比单剂具有良好的增效作用，且能延缓单剂的抗药性，同时安全无毒、环境友好。

本发明是这样实现的：

本发明涉及一种杀细菌组合物，其特征在于，所述组合物含有活性成分甲基营养型芽孢杆菌和叶枯唑，其中二者的重量比为30:1-1:30。

优选地，该杀细菌组合物中甲基营养型芽孢杆菌和叶枯唑的重量比为10:1～1:10。

更优选地，该杀细菌组合物中甲基营养型芽孢杆菌和叶枯唑的重量比为5:1～1:5。

本发明涉及一种杀细菌剂，其特征在于，该杀细菌剂含有1～90重量％的如上所述的杀细菌组合物，余量为农药上可接受的载体和助剂。

优选地，该杀细菌剂含有3～80重量％的如上所述的杀细菌组合物。

更优选地，该杀细菌剂含有15～70重量％的如上所述的杀细菌组合物。

所述载体和助剂为分散剂1-10％、润湿剂0.5-5％、崩解剂1-15％、粘结剂1-4％、载体加至100％。

所述分散剂可以为工业副产物分散剂，如木质素及其衍生物等；阴离子型表面活性剂的分散剂烷基硫酸盐类，烷基酚聚氧乙烯基醚甲醛缩合物硫酸盐等；非离子型表面活性剂的分散剂，如烷基酚聚氧丙烯基醚嵌段共聚物，烷基酚聚氧乙烯磷酸酯等；水溶性高分子物质分散剂和无机分散剂；或者是上述一种和几种的混合；

所述润湿剂可以为烷基硫酸盐类，烷基酚聚氧乙烯基醚甲醛缩合物硫酸盐，拉开粉，SOPA，十二烷基苯磺酸钠，净洗剂，农乳2000系列，润湿渗透剂T，LS94、LWET/F、聚氧乙烯基醚类等；或者是上述一种和几种的混合；

所述崩解剂可以为硫酸铵、硫酸钠，碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸铵、氯化铵等；或者是上述一种和几种的混合；

所述粘结剂可以为淀粉、聚乙二醇、吡咯烷酮、聚乙烯醇、尿素等；或者是上述一种和几种的混合；

所述载体可以为高岭土，活性白土，硅藻土，泥煤，轻质碳酸钙，白碳黑，叶腊石，滑石粉，方解石等；或者是上述一种和几种的混合。

除非另有说明，本发明所涉及的“％”均为“重量百分比”。

本发明之制备方法是：将计量好的甲基营养型芽孢杆菌母药、叶枯唑原药、分散剂、润湿剂、崩解剂和载体投入混合机中，混合均匀后粉碎，将粉碎后的物料与粘结剂的水溶液(2％的水溶液)捏合；捏合后的物料经造粒机造粒；去除大于5mm和小于0.5mm的颗粒，烘干即可。不合适的颗粒经重新捏合后再造粒。

进一步地，本发明还涉及将上述杀细菌组合物或杀细菌剂用于防治烟草青枯病(Pseudomonassolanacearum(E.F.Smith)Smith)、水稻白叶枯病(Xanthomonas oryzae Swing et al.pv.oryzlcola(Fang et al)Swing et al)或大白菜软腐病(Erwinia carotovora subsp.carotovora(Jones)Bergey et al.)的应用。

所述甲基营养型芽孢杆菌母药的制备和提取方法是按照中国专利201210579899、发明名称为“一种甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂及其制备方法和应用”中所记载的方法来制得的。

关于本发明技术方案的效果，具体如下：

(1)相比单剂而言，甲基营养型芽孢杆菌和叶枯唑组合后的增效系数均在130以上，具有良好的增效作用；

(2)本发明的杀细菌组合物能良好地延缓单剂的抗药性。

具体实施方式

下面叙述本发明的四个实施例

本发明的甲基营养型芽孢杆菌按照中国专利201210579899、发明名称为“一种甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂及其制备方法和应用”中所记载的方法来制得的。

实施例1.制备水分散粒剂杀菌药物(1000公斤)

主成分甲基营养型芽孢杆菌为1％，即10公斤。叶枯唑为10％，即10公斤。并含有下述各种助剂，分散剂T36为5％、即50公斤，分散剂27002％，即20公斤；润湿剂十二烷基硫酸钠3％,即30公斤；崩解剂硫酸胺3％,即30公斤；粘结剂聚乙二醇3％,即30公斤；载体白炭黑为140公斤，载体高岭土余量为590公斤。

配制工艺为：将计量好的甲基营养型芽孢杆菌母药、叶枯唑原药分散剂T36、分散剂2700、润湿剂十二烷基硫酸钠、崩解剂硫酸铵、载体白炭黑和高岭土投入混合机中，搅拌均匀，经气流粉碎机粉碎。将粉碎后的物料与粘结剂聚乙二醇的水溶液捏合，捏合成膏状后经造粒机造粒；用筛子将大于5mm和小于0.5mm的颗粒去除；合适的颗粒经干燥，检测合格后包装。不合适的颗粒经捏合机重新捏合后再造粒。

实施例2.制备水分散粒剂杀菌药物(1000公斤)

主成分甲基营养型芽孢杆菌为20％，即200公斤。叶枯唑原药为20％，即200公斤。并含有下述各种助剂，分散剂MNS9010％、即100公斤；润湿剂LS940.5％,即5公斤；崩解剂氯化铵10％,即100公斤；粘结剂尿素4％,即40公斤；载体滑石粉余量为355公斤。

配制工艺同实施例1

实施例3.制备可湿性粉剂杀菌药物(1000公斤)

主成分甲基营养型芽孢杆菌为12％，即120公斤。叶枯唑为20％，即200公斤。即并含有下述各种助剂，分散剂NWO 8％、即80公斤；润湿剂4896为5％,即50公斤；载体白炭黑为15％，即150公斤公斤。高岭土余量为400公斤。

配制工艺

按照配方要求，投入分散剂NNO、MF—5、高岭土，开动搅拌机，投入甲基营养型芽孢杆菌母药和叶枯唑原药，白炭黑，最后缓慢加入润湿剂，料投完后在前混合机混合15—30min，开启粉碎机，分机转速38—45，加料速度180—250Kg/h，粉碎毕后在后混合机混合15—30min，包装，即可制成甲基营养型芽孢杆菌和叶枯唑可湿性粉剂。

实施例4.制备可湿性粉剂杀菌药物(1000公斤)

主成分甲基营养型芽孢杆菌为20％，即200公斤。叶枯唑20％，即200公斤。即并含有下述各种助剂，分散剂NWO 8％、即80公斤；润湿剂4896为5％,即50公斤；载体白炭黑为15％，即150公斤公斤。高岭土余量为320公斤。

配制工艺同实施例3

生物测定：

甲基营养型芽孢杆菌与叶枯唑组合对烟草青枯病的毒力测定

1.试验条件

1.1供试病原菌：

烟草青枯病菌Pseudomonas solanacearum(E.F.Smith)Smith，由西北农林科技大学植保学院植物病理研究室保存和提供。

供试菌种在TTC培养基上培养，温度17-22℃，相对湿度90％。

1.2供试植物：在灭菌土培育烟苗至4～5叶期。

2.试验设计

2.1供试药剂：

内含100亿/克甲基营养型芽孢杆菌LW-6母液(Bacillus methylotrophilus)，由西北农林科技大学植保学院植物病理研究室保存和提供。

叶枯唑(Bismerthlazol)97％原药，由浙江龙湾化工公司提供。

2.2药剂浓度和配比设计及溶液配制：

甲基营养型芽孢杆菌溶液：称取0.01g内含100亿/克甲基营养型芽孢杆菌LW-6母液，加入含0.1％Tween80乳化剂的无菌水98.5ml，搅拌均匀，配制成100mg/L母液，再用含0.1％Tween80乳化剂的无菌水稀释成10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/L浓度备用；

叶枯唑溶液：称取0.01g97％叶枯唑原药，用0.2mlDMF溶解，加入含0.1％Tween80乳化剂的无菌水96.8ml配制成100mg/L母液，再用含0.1％Tween80乳化剂的无菌水稀释成10、5、1、0.5、0.1、0.05mg/L浓度备用；

各混配溶液：分别取5、9、10、14、9ml10mg/L甲基营养型芽孢杆菌溶液分别加入到5、6、4、4、29ml10mg/L叶枯唑溶液中制成10mg/L甲基营养型芽孢杆菌·叶枯唑1:1、3:2、5:2、7:2和9:2溶液，再用含0.1％Tween80乳化剂的无菌水稀释成100、50、12.5、6.25mg/L5个质量试验浓度，每个质量浓度设4个重复。

对照溶液：0.2mlDMF加95ml含0.1％Tween80乳化剂的无菌水。

3.测定方法：

选取在灭菌土上培育长势好的4～5叶期烟苗，喷雾处理后自然晾干，24h左右将幼苗取出接种烟草青枯病，接种量为5ml/株。

每处理设3次重复，每重复10株烟苗，处理后移栽至装有灭菌土的苗钵中，处理放置于温室28～36℃条件下，每天观察烟苗生长情况，3天后空白对照重复发病时调查防治效果，15天后调查烟草植株发病情况，统计发病率和病情指数，计算防效。

4.数据统计分析

参照生测标准方法NY/T1156.6-2006，根据Sun&Johnson(1996)的共毒系数法(CTC)来评价药剂混配的增效作用，即CTC≤80为拮抗作用，80＜CTC＜120为相加作用，CTC≥120为增效作用。

以病情指数计算出各个处理防效，所有数据均采用SAS6.12系统软件进行分析，求出毒力回归方程式、相关系数(r)和EC₅₀(95％置信度)。

5.结果与分析：

采取5点法取5个代表性的配比，并将这5个配比和标准药剂进行毒力测定。甲基营养型芽孢杆菌和叶枯唑复配对烟草青枯病的毒力测定结果见表₁。由表₁可见，甲基营养型芽孢杆菌与叶枯唑以1:1、3:2、5:2、7:2和9:2的比例混配对烟草青枯病菌均表现出增效作用，其EC₅₀值分别为0.40、0.47、0.51、0.62和0.72mg/L，共毒系数分别为138.18、135.95、152.48、142.62和134.55，其中以5:2的比例混配增效作用最好。

表₁ 甲基营养型芽孢杆菌和叶枯唑复配对烟草青枯病的毒力测定结果

注：所述的芽孢杆菌即为甲基营养型芽孢杆菌，所述的叶枯即为叶枯唑。

甲基营养型芽孢杆菌与叶枯唑杀菌组合大田药效试验实施：

(1)、烟草药效试验：

试验地：选在陕西宝鸡，供试地面积1.36亩，土质为轻壤土，有机质含量为1.01％，pH值7.7，所有试验小区栽培条件及管理措施一致。

药剂及处理：

A.40％甲基营养型芽孢杆菌·叶枯唑(20:20)水分散粒剂2000倍液；

B.72％农用硫酸链霉素可湿性粉剂2000倍液；

C.100亿/克的甲基营养型芽孢杆菌水剂200倍液；

D.20％叶枯唑可湿性粉剂2000倍液；

E.CK,清水对照。

共5个处理，每个处理4个重复，共20个小区，各小区随机排列，每个小区40m²小区间，试验地周围设置0.6m宽的隔离带。

供试烟草种植：2013年5月5日进行播种，平均株距8cm。

施药方法：播种后分别于2013年6月5日、15日和25日灌根一次，亩用药液500kg，喷药器械为工农——16型喷雾器，将喷头取下喷灌。

当地气象条件：

第一次施药(6月5日)晴，风力2级，气温18-29℃，相对湿度为80％。第二次施药(6月15日)阴，风力3级，气温19-29℃，相对湿度为80％。第三次施药(6月25日)多云，风力5级，最高气温22-32℃，相对湿度为80％。

试验结果调查方法：最后一次施药后7天进行调查，每小区采用4点取样法，每点查20株，记录总株数和各级病株数。

结果及分析：如下表₃所示。

表₃ 甲基营养型芽孢杆菌水分散粒剂对烟草青枯病田间试验防治情况

田间药效试验结果表明，甲基营养型芽孢杆菌和叶枯唑水分散粒剂对烟草青枯病的平均防效达85％以上。试验过程中未发现供试药剂甲基营养型芽孢杆菌和叶枯唑水分散粒剂对烟草作物生长有任何不良影响。

(2)、水稻药效试验：

试验地：

选在陕西洋县，试验用地800m²(1.21亩)，土质为轻壤土，有机质含量为1.2％，pH值7.5，所有试验小区栽培条件及管理措施一致；

药剂及处理：

A.32％甲基营养型芽孢杆菌·叶枯唑水(12:20)分散粒剂1500倍液；

B.咪鲜胺500倍液；

C.100亿/克的甲基营养型芽孢杆菌水剂200倍液；

D.20％叶枯唑可湿性粉剂2000倍液；

E.CK,清水对照。

共5个处理，每个处理4个重复，共20个小区，各小区随机排列，每个小区60m²小区间及试验地周围设置0.5m宽的隔离带。

水稻种植情况：2010年3月进行播种，平均株距7cm。

施药方法：播种出苗后分别于2010年5月15日、6月5日和25日分别根灌一次，亩用药液500kg，喷药器械为工农——16型喷雾器，将喷头取下喷灌。

当地气象条件：

第一次施药(5月15日)当日少云，风力3级，最高气温14℃，最低气温1℃，相对湿度为30％。第二次施药(6月15日)当日阴，风力3级，最高气温19℃，最低气温3℃，相对湿度为30％。第三次施药(6月25日)当日少云，风力5级，最高气温23℃，最低气温10℃，相对湿度为20％。

试验结果调查：最后一次施药后7天进行调查，每小区采用4点取样法，每点查20株，记录总株数和各级病株数。

结果及分析：

如下表₄所示，其中，所有取样点都没有药害发生，经过田间小区试验表明，甲基营养型芽孢杆菌和叶枯唑水分散粒剂对水稻白叶枯病的平均防效达92.3％，高于咪鲜胺乳油及各对照药剂的防效。

表₄ 甲基营养型芽孢杆菌和叶枯唑水分散粒剂对水稻白叶枯病田间试验防治情况

(3)、白菜药效试验：

试验地：

选在陕西杨凌，试验用地800m²(1.21亩)，土质为轻壤土，有机质含量为1.07％，pH值7.2，所有试验小区栽培条件及管理措施一致。

药剂处理：

A.28％甲基营养型芽孢杆菌·叶枯唑水(20:8)分散粒剂2000倍液、

B.农用链霉素2000倍液；

C.100亿/克的甲基营养型芽孢杆菌水剂200倍液；

D.20％叶枯唑可湿性粉剂2000倍液；

E.CK,清水对照。

F.共5个处理，每个处理4个重复，共20个小区，各小区随机排列，每个小区40m²小区间及试验地周围设置0.6m宽的隔离带。

大白菜种植情况：2010年7月进行播种，平均株距8cm。

施药方法：播种后分别于2010年8月5日、15日和25日根灌一次，亩用药液500kg，喷药器械为工农——16型喷雾器，将喷头取下喷灌。

当地气象条件：

第一次施药(8月5日)当日少云，风力3级，最高气温25℃，最低气温15℃，相对湿度为80％。第二次施药(8月15日)当日阴，风力3级，最高气温23℃，最低气温15℃，相对湿度为80％。第一次施药(8月25日)当日少云，风力5级，最高气温25℃，最低气温14℃，相对湿度为80％。

试验结果调查：最后一次施药10天后进行调查，每小区采用4点取样法，每点查20株，记录总株数和各级病株数。

调查结果如下表₅所示，结果表明甲基营养型芽孢杆菌和叶枯唑水分散粒剂对大白菜软腐病的平均防效达89.6％，高于农用链霉素2000倍液及各对照药剂的防效。

表₅ 甲基营养型芽孢杆菌好叶枯唑水分散粒剂对大白菜软腐病的田间试验防治情况

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (8)

1.一种杀细菌组合物，其特征在于，所述组合物含有活性成分甲基营养型芽孢杆菌和叶枯唑，其中二者的重量比为30:1-1:30。

2.根据权利要求1所述的杀细菌组合物，其特征在于，二者的重量比为10:1～1:10。

3.根据权利要求1所述的杀细菌组合物，其特征在于，二者的重量比为5:1～1:5。

4.一种杀细菌剂，其特征在于，该杀细菌剂含有1～90重量％权利要求1至3任一所述的杀细菌组合物，余量为农药上可接受的载体和助剂。

5.根据权利要求4的杀细菌剂，其特征在于，该杀细菌剂含有3～80重量％的杀细菌组合物。

6.根据权利要求4的杀细菌剂，其特征在于，该杀细菌剂含有15～70重量％的杀细菌组合物。

7.根据权利要求4至6任一所述的杀细菌剂，其特征在于，所述载体和助剂为分散剂1-10％、润湿剂0.5-5％、崩解剂1-15％、粘结剂1-4％、载体加至100％。

8.根据权利要求1至3任一所述的杀细菌组合物或权利要求4-7任一所述的杀细菌剂用于防治烟草青枯病、水稻白叶枯病或大白菜软腐病的应用。