CN104394903A - 生物流体的净化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过改变该物质对蛋白质的亲和力从体外生物流体中去除蛋白质结合的有害物质。本发明涉及置换物质用于去除有害物质的用途。本发明还涉及去除方法，系统，包含用于去除有害物质的置换物质的净化液。

Description

生物流体的净化
技术领域
本发明涉及通过改变蛋白质结合的有害物质对蛋白质的亲和力从生物流体中去除该物质。此外，本发明涉及C5-C10-脂肪酸或其盐，或水杨酸或其衍生物或其盐作为有害物质的置换物质的用途。本发明还涉及去除方法，系统，包含用于去除有害物质的置换物质的净化液(cleaning fluid)。
背景技术
人体的肾功能可能因不同原因而衰竭。肾脏具有对生存至关重要的不同功能，如从生物流体例如血液中分离和传送废物、平衡体内电解质水平和平衡体内的酸碱状态。
肾衰竭可以是急性或慢性的，并可以通过不同方法治疗，例如器官移植或通过透析治疗。在透析治疗中，生物流体与人体分离，并以体外流体形式在人体外处理。存在不同的可用透析方法，例如血液透析、血液滤过和血液透析滤过。通常，它们会清除身体的废物如尿素和有害化合物如尿毒症毒素。
有害化合物，如蛋白质结合的毒素，可以存在于不同的生物流体中，例如血液、血浆、腹腔液。一部分有害化合物结合到存在于血液中的蛋白质，如白蛋白。尿毒症毒素在正常情况下通过肾功能以及通过肝功能从生物流体中除去。但是，可能存在其中有害物质须从生物流体中除去并且该去除过程发生在人体外部的情况。例如，在透析治疗期间从人体抽取的血液也应当清除有害化合物。
存在可用于去除有害化合物的方法与装置。一种用于净化体外血液的设备由WO 2007/046757已知。在该装置中，血液分成第一净化级分和第二净化级分。第二净化级分通过除去结合在蛋白质上的毒素和/或溶解在血浆中的毒素制得。
在US 7,615,158B2中，描述了一种从血液中部分去除载体结合物质的方法。该专利中描述的方法包括跨膜施加压力梯度以产生超滤。
除去患者血液中结合白蛋白的尿毒症毒素的方法描述在US 8,206,591B2中。该方法包括向血液中引入置换物质，使得置换物质置换结合白蛋白的有害物质。在将血液返回患者之前，未结合的尿毒症毒素随即通过体外肾置换治疗去除。该置换物质是例如胆红素。当要从血液中除去药物如水杨酸盐时建议采用这种方法。
但是，需要改善从生物流体中除去有害化合物的可能性。因此，需要进一步的手段分离和净化体外生物流体的尿毒症毒素。
发明内容
本发明的一个目的是提供从体外生物流体中去除有害物质的用途与方法。有害物质是当存在于人体内时对人体的生理功能产生负面影响的物质，理想的是除去这些物质。
本发明的另一个目的是提供一种系统，用于通过本文中定义的方法从生物流体中去除有害物质。
本发明的一个目的是提供包含一种或多种本文中描述的置换物质的净化液。
在本发明的一个实施方案中，提供了选自C5-C10-脂肪酸、或其衍生物、或其盐；和水杨酸、其衍生物或其盐；或其组合的物质作为置换物质用于在体外生物流体中去除结合蛋白质的有害物质的用途。
置换物质用于去除结合蛋白质的有害物质的用途是改变有害物质对蛋白质的亲和力，其中该置换物质选自C5-C10-脂肪酸、或其衍生物、或其盐，水杨酸、或其衍生物、或其盐，或乙酰水杨酸、或其盐；或其组合。
另一实施方案是用于处理体外生物流体的置换物质，其中该处理是通过使用置换物质去除存在于生物流体中的结合蛋白质的有害物质，所述置换物质选自C5-C10-脂肪酸、或其衍生物、或其盐，水杨酸、或其衍生物、或其盐，或乙酰水杨酸、或其盐；或其组合。
另一实施方案是使用置换物质C5-C10-脂肪酸、或其衍生物、或其盐。再一实施方案是使用置换物质水杨酸、其衍生物或其盐。
在本发明的一个实施方案中，描述了使用水杨酸及其衍生物或其盐作为去除结合蛋白质的有害物质的置换物质。
使用水杨酸及其衍生物和盐的优点在于其结合白蛋白不同位点的能力，并具有竞争结合与变构结合效果。因此，通过改变蛋白质的同形度(conformity)来改变有害物质的亲和力，允许用置换物质取代或置换有害物质。
该置换物质通过竞争性结合蛋白质和/或通过变构结合作用于蛋白质并由此改变对蛋白质的亲和力。由此，通过用结合蛋白质的分子亲和力来阐释，已经显示有害物质的亲和力被降低并被置换物质置换或替代。当有害物质包含尿毒症毒素时，这尤其是有用的。
在一个实施方案中，待去除的有害物质是尿毒症毒素，其选自如下化合物：对甲酚；硫酸对甲酚；硫酸吲哚酚；CMPF；及其组合。
在一个实施方案中，有害物质结合的蛋白质是白蛋白，如血清白蛋白。
在例示本发明的一个实施方案中，该置换物质是与一种或多种C5-C10-脂肪酸组合的水杨酸、其衍生物或其盐的组合。
在本发明的另一实施方案中，该置换物质选自水杨酸、其衍生物或其盐，例如乙酰水杨酸。
在本发明的一个实施方案中，提供了从体外生物流体中去除有害物质的方法。该有害物质结合了蛋白质。该方法包括下列步骤：
a)在置换物质置换或替代结合蛋白质的有害物质的条件下将置换物质引入到生物流体中，由此在生物流体中产生其它的未结合的有害物质；和
b)从该生物流体中去除该未结合的有害物质；其中所述置换物质选自C5-C10-脂肪酸、或其衍生物、或其盐；和水杨酸、其衍生物或其盐；或其组合；优选选自水杨酸或其盐，乙酰水杨酸或其盐，和C8-脂肪酸或其盐，或其组合，更优选水杨酸和C8-脂肪酸的组合或其盐。
该生物流体可以是包含能够结合蛋白质的有害物质的任何生物流体。该生物流体是体外生物流体，所述体外生物流体通过去除有害物质来经受处理。生物流体的实例是血液、血浆和腹腔液。该名单并非穷举的。
在方法的一个实施方案中，步骤a)和步骤b)在30至60℃、优选35至50℃的温度下进行。
例示的发明的另一实施方案是如上所述的方法，其中步骤a)和步骤b)在5至8的pH，优选在5至6的pH下进行。
在本发明的另一实施方案中，去除有害物质的步骤b)通过透析、电渗析或血浆置换来进行。
此外，本发明的另一实施方案是包含一种或多种置换物质的净化液。该置换物质可以选自C5-C10-脂肪酸或其盐，或水杨酸、或其衍生物、或其盐；或其组合，优选选自水杨酸或其盐，乙酰水杨酸或其盐，和C8-脂肪酸或其盐，或其组合。
本发明的再一实施方案是配置为从血液中去除有害物质的系统。该系统包括血液回路，流体回路和血液处理单元，所述血液处理单元包含过滤器系统，所述过滤器系统包括一个或多个将流体隔室与血液隔室分隔开的半透膜，具有用于混合血液和净化液并引导该获得的混合物穿过所述血液隔室的装置，其中该净化液包含用于去除结合蛋白质的所述有害物质的置换物质。该置换物质选自C5-C10-脂肪酸或其盐；水杨酸、或其衍生物、或其盐；或其组合。例如，置换物质选自C5-C10-脂肪酸或其盐；水杨酸或其盐；和乙酰水杨酸或其盐；或其组合。
任选地，该系统装有附加的单元，在该单元中，该生物流体例如血液分离为血液细胞的第一级分和血浆的第二级分。向该第二级分中加入置换物质以便去除该有害物质。
本发明的置换物质可以选自C5-C10-脂肪酸、或其衍生物、或其盐；或水杨酸、或其衍生物、或其盐；或其组合。该置换物质优选选自水杨酸钠、乙酰水杨酸钠和辛酸钠(C8-脂肪酸的钠盐)，或其组合。
使用水杨酸及其衍生物和盐作为从生物流体如血液中去除有害分子的置换物质的附加优点在于它们具有抗血栓和抗凝血性质。否则，当该生物流体是血液时，必须单独加入抗凝血剂以避免血液的凝固与凝结。该抗血栓与抗凝血效果可以作为单独的效果，或作为之前效果的附加效果。
公知的是，水杨酸、其衍生物及其盐具有抗氧化和抗炎性质。这些物质还具有对抗疾病和综合征如慢性炎症、动脉硬化和动脉粥样硬化的效果。
令人惊讶地发现，水杨酸、其衍生物及其盐以及C5-C10-脂肪酸可有效用于从体外生物流体中去除有害物质。
置换物质对白蛋白的结合位点有作用的令人惊讶的发现对于在透析治疗和血浆置换中使用这些物质来说是有利的。抗凝血效果是有利的，因为在这些系统中传统抗凝血物质如肝素和柠檬酸盐可以被本文中所述的置换物质取代。
定义
术语“有害物质”在本文中指的是对身体的生理功能产生负面影响的物质。该有害物质例如是尿毒症毒素。
术语“置换物质”在本文中指的是一种物质，该物质结合蛋白质例如白蛋白并且该结合亲和力与有害物质是竞争性的和/或变构的。由此该置换物质可以具有比有害物质更强的对蛋白质的亲和力，并由此置换有害物质。
附图说明
图1a-e显示了用不同置换物质置换对甲酚的结果。在图1a中，显示了当水杨酸钠用作置换剂分子时置换的对甲酚的测量量。在图1b中，显示了当乙酰水杨酸钠用作置换物质时置换的对甲酚的测量量。在图1c中，显示了当辛酸钠用作置换物质时置换的对甲酚的测量量。图1d和1e显示了当分别使用置换物质的组合——辛酸钠与水杨酸钠和辛酸钠与乙酰水杨酸钠——时置换的对甲酚的测量量。
图2a-d显示了在不同的温度与pH下通过添加透析溶液或水置换对甲酚的结果。
具体实施方式
人体由大约60％的水组成，该水平对维持其生存至关重要。在健康的身体内，水的含量是经由例如穿过肾脏来自行调节的。正常肾脏的一个任务是从血液中除去多余液体如水、尿素和其它废物。所得尿液转移到膀胱并最终在排尿时离开身体。肾脏第二个任务是调节例如身体内电解质和酸与碱的平衡。当肾脏发生故障时，疾病可能在大多数主要身体器官中发展，一种称为尿毒症的综合征。如果尿毒症不能得到治疗，会导致死亡。尿毒症通过肾移植或某种形式的体外血液净化，例如血液滤过、血液透析滤过或腹膜透析来治疗。
所述废物是源于身体细胞新陈代谢的大量物质。尿素是最为丰富的废物，当蛋白质代谢时产生尿素。肌酐是源于肌肉代谢的另一种重要的废物。除了这些废物外，其它化合物如蛋白质结合的化合物和异物均被排泄到尿液中。
在急性肾衰竭中，肾脏停止发挥作用并停止去除所述废物，肾脏功能快速丧失，并且肾脏失去其去除废物的能力。在大多数情况下这仅仅是临时的症状，但是会保持并转为慢性症状。
尿毒症毒素构成一组物质，该物质保留在患有肾衰竭的患者体内并参与尿毒症综合征的发展与表现。根据其物理-化学性质以及其在透析疗法或治疗过程中的行为，这些尿毒症滞留溶质(uremic retention solute)被细分为三个不同的组。
小的水溶性分子是分子量小于500道尔顿(D)的分子。实例是尿素和肌酐。这些物质容易通过透析去除。中等(或中档)分子是分子量为500D至15000D的分子，并可以采用高通量膜分离以提高的效率通过血液透析去除。
蛋白质结合分子最通常具有低分子量，但是因其蛋白质结合而被视为中等或高分子量分子。实例是有机阴离子如硫酸吲哚酚(IS)、3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)、硫酸对甲酚(PCS)、对甲酚和马尿酸(HA)。
在肾病患者体内，尿素在水中的浓度被认为在细胞内部和外部是相同的。当从细胞外的血浆水中经透析除去尿素时，产生了跨细胞的浓度差。这转而导致尿素扩散出细胞，并由此净化该细胞。细胞壁对尿素是高度可渗透的，并且可以经细胞膜快速传输。
但是，同样要从血液中除去的其它物质并不能那么容易地经膜传输。当需要人工肾操作(artifical renal procedure)，如上述透析操作时，还需要其它手段从血液中除去这些物质。这对有害物质适用。一个原因可能是这些物质主要位于细胞内部。该物质还可以结合蛋白质如白蛋白，保留在血浆中。因此，去除这些物质是一种挑战。蛋白质结合化合物是具有低分子量的分子，但是因其蛋白质结合而被视为中等或高分子量分子。它们最通常结合到分子量为66kD的白蛋白上。
大多数这些化合物是生物和生化活性的并具有高毒性活性，例如造成心脑血管损伤[1,2]。大多数这些化合物是有机阴离子，如硫酸吲哚酚(IS)、3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)、硫酸对甲酚(PCS)、对甲酚和马尿酸(HA)。这些化合物通过有机阴离子载体分子在身体中输送到各种组织。该化合物可以在身体里累积，例如在肾脏中，在包括内皮细胞、血管平滑肌细胞、成骨细胞以及中枢神经系统的组织中，造成不良的毒性作用[3]，这些化合物在尿毒症综合征中的作用被长期忽视，因为难以在尿毒血清中识别它们。
这些化合物的共同特征是它们难以被大多数目前可用的透析疗法清除。为了去除这些化合物，仅能去除它们的游离部分(free fraction)，因此需要在去除前将该化合物从蛋白质上除去。去除该蛋白质结合化合物(毒素)的一种可能性是刺激它们从结合蛋白质，如白蛋白上的解离。
去除蛋白质结合毒素的一个选项是采用竞争性结合，这可以将有害物质如尿毒症毒素从它们在蛋白质如白蛋白上的结合位点处置换。变构结合也被认为可用于置换有害物质。
另一选项是改变pH值和/或温度以影响白蛋白与尿毒症毒素之间的结合，并由此促进该化合物的解离。再一选项是上述的组合，由此采用竞争性或变构结合并改变pH值和/或温度以影响白蛋白与尿毒症毒素之间的结合。
人血清白蛋白(HSA)是血浆中最丰富的转运或载体蛋白质。该蛋白质包含三个不同的结构域(I、II和III)，每个域又分为两个结构域A和B。配体结合的高亲和力结合位点位于子域IIA和IIIA，也称为Sudlow位点I和位点II[4]。
存在于血浆中的白蛋白有助于调节渗透压和保持血管外液(extravascularfluids)的pH水平。此外，它是一种重要的细胞外抗氧化剂，并且是化合物如结合到其两个主要结合位点(即位点I和位点II)的各种内源性和外源性化合物(如脂肪酸、激素和引入的分子如药物)的载体蛋白质。还存在其它结合位点，例如此类结合金属。
白蛋白结合内源性与外源性化合物以及药物的能力在慢性肾衰竭中因尿毒症毒素的累积和与该血清蛋白质的结合而降低[5]。例如，由于CMPF对同一结合位点(位点I)的竞争性结合，胆红素在CKD患者体内对白蛋白的结合降低。
此外，蛋白质结合的尿毒症毒素与药物竞争白蛋白分子上的同一结合位点。尿毒症毒素抑制了许多药物对血清白蛋白的结合，例如硫酸吲哚酚抑制了结合至该结合位点(位点II)的某些药物如地西泮的白蛋白结合。CMPF是置换结合到该蛋白质的结合位点I的药物(例如华法林)的化合物。提高的药物浓度会导致对不同器官的提高的毒性作用。
本发明中包括的置换物质可以选自C5-C10-脂肪酸、或其衍生物、或其盐；和水杨酸、其衍生物或其盐；或其组合。
在本文中显示了C5-C10-脂肪酸或其盐具有作为置换物质的能力，由此具有比有害物质如对甲酚更高的对蛋白质的亲和力。
术语“C5-C10-脂肪酸”在本文中指的是具有包含C5-C10碳原子的直链或支链烷基链的脂肪酸。该碳链可以进一步被取代基取代，所述取代基选自C1-C3-烷基(甲基、乙基或丙基)、羟基(-OH)和-COOH。该名单并非穷举的。C5-C10-脂肪酸的实例是戊酸(缬草酸)、己酸(羊油酸)、庚酸(葡萄花酸)、辛酸(羊脂酸)、壬酸(天竺葵酸)和癸酸(羊蜡酸)。该脂肪酸还可以包括其盐；一个实例是该脂肪酸的钠盐。
在本发明的一个实施方案中，描述了C5-C10-脂肪酸、或其衍生物、或其盐作为置换物质以去除结合蛋白质的有害物质的用途。
脂肪酸的一个实例是辛酸及其钠盐——辛酸钠，辛酸也称为羊脂酸。其在人类母乳、椰油以及棕榈油中被发现。辛酸钠具有抗真菌效果，并用于治疗和护理白色念珠菌引起的真菌和酵母感染。由于辛酸具有短脂肪酸链，因此能容易地穿透细胞膜，其也被用作抗菌剂[6,7]。通过抑制肠上皮细胞分泌白介素-8并由此抑制其对肠道的炎症作用，辛酸钠还对患有克罗恩病的患者具有有用的效果[8]。
辛酸钠可以用作置换物质以置换硫酸对甲酚、对甲酚和硫酸吲哚酚对白蛋白Sudlow II结合位点的非共价结合[9]。研究中已经报道了辛酸钠以高亲和力在位点II处结合至主要结合位点。这种结合导致结合位点II的变构变化，这又导致了结合在该处的化合物的置换。其还可以以竞争性方式置换结合在该处的化合物。所述研究表明，高浓度的辛酸钠可以结合到白蛋白结合位点I但是具有低得多的结合亲和力，并由此以竞争方式置换结合到该位点的目标溶质[10]。
水杨酸是本文中例示的另一种置换物质，以及其衍生物和盐。水杨酸的盐例如是水杨酸钠，包括在本发明的试验中。水杨酸衍生物也包括在本发明中。衍生物的一个实例是乙酰水杨酸及其盐，如乙酰水杨酸钠。乙酰水杨酸也称为，其是一种弱酸，并属于非甾体抗炎药(NSAIDs)。但是，乙酰水杨酸在作用机理上不同于常见的NSAIDs。乙酰水杨酸是水杨酸的乙酰基衍生物。该物质用作止疼药，用作抗炎药以抑制炎症，并用做解热剂以减轻发热。该物质还可以有效地用作抗凝血剂。该物质还用于对抗癌症。
置换物质的组合是选自如下组中的两种或更多种的置换物质：C5-C10-脂肪酸、或其衍生物、或其盐；和水杨酸、其衍生物或其盐；或其组合。组合的实例是C5-C10-脂肪酸或其衍生物或其盐与水杨酸或其盐的组合。另一实例是C5-C10-脂肪酸或其衍生物或其盐与乙酰水杨酸或其盐的组合。再一实例是辛酸钠与水杨酸的钠盐的组合；和辛酸钠与乙酰水杨酸的钠盐的组合。另一实例是辛酸钠、水杨酸的钠盐和乙酰水杨酸的钠盐的组合。
术语“生物流体”在本文中指的是充当有害物质以及与之结合的蛋白质的载体的流体。要净化该生物流体中的这些有害物质，该生物流体可以是例如血液、血浆和腹腔液。该生物流体是体外生物流体。该生物流体名单并非穷举的。
本发明还提供了净化液。该净化液包含本文中所述的置换物质。该净化液意欲在肾脏治疗如透析治疗中添加。该净化液包含选自C5-C10-脂肪酸、或其衍生物、或其盐；和水杨酸、其衍生物或其盐；或其组合的置换物质。例如，该置换物质是C5-C10-脂肪酸、其衍生物、或其盐；水杨酸、其衍生物或其盐；或其组合。该净化液还包含生理上可接受的赋形剂和电解质。该净化液以生理学可接受的浓度包含不同的组分，并具有6.5至8的pH值。
用于从生物流体中去除有害分子的置换物质可以包括在系统中，例如用于处理生物流体的系统，如用于血液透析治疗的系统。该置换物质可以选自C5-C10-脂肪酸、或其衍生物、或其盐；和水杨酸、其衍生物或其盐；或其组合。
系统配置为从体外生物流体如血液或血浆中去除有害物质。该系统可以包含体外血液回路、流体回路和血液处理单元，所述血液处理单元包含过滤器系统，该过滤器系统包括将流体隔室与血液隔室分隔开的一个或多个半透膜，具有用于混合血液和净化液并引导该获得的混合物穿过所述血液隔室的装置，其中该净化液包含用于去除结合蛋白质的所述有害物质的置换物质。该置换物质选自C5-C10-脂肪酸或其盐；水杨酸、或其衍生物、或其盐；或其组合。
任选地，该系统装有附加的单元，在该单元中，生物流体例如血液分离为血液细胞的第一级分和血浆的第二级分。向该第二级分中加入置换物质以便去除有害物质。
该置换物质可以在透析器前，由此在任何透析机中的血液处理单元之前作为区域抗凝剂(regional anticoagulant)施用。或者，可以包括单独的血浆分离装置如血浆分离过滤器以便用水、置换物质或pH调节水单独处理血浆中存在的白蛋白以进一步提高去除的有害物质例如尿毒症毒素的量。
作为区域抗凝剂施用的优势应当是来自于水杨酸的抗凝血性质以及减少对施用肝素的需要的可能性。采用血浆分离装置的优点在于尿毒症毒素的去除可以通过大体积水和/或在具有或不具有置换及分子的情况下调节pH来促进。
已经显示，有害物质的去除应当在5至8、例如5至7的pH下发生。已经显示，在该pH范围内，有害物质的亲和力降低，并且置换物质的亲和力更强。合适的pH的实例是5、5.5、6、6.5、7、7.5和8。
有害物质的去除还优选在30至60℃、更优选35至50℃的温度下进行。合适的温度的实例是30、35、36、37、38、39、40、45、50、55和60℃。
该置换物质描述了实现结合蛋白质的有害物质的释放。这些物质从生物流体中的分离可以通过类似透析、电渗析、血浆置换等等的技术来进行。
当使用透析治疗期间加入的置换物质时，该有害物质或尿毒症毒素经由该系统中包括的半透膜从生物流体中分离。
在电渗析中，通过电力迫使离子物质穿过该膜。在血浆置换中，产生跨膜压力差，使得血浆(即血浆水和蛋白质)流过该膜至第二侧。
该有害物质还可以通过重复加入洗涤液(washing liquid)从生物流体中除去。该洗涤液是例如水或透析液，优选水。这尤其适于存在于血液中的血浆，并且也携带结合该有害物质的白蛋白。通过加入过量的水，一部分蛋白质结合的有害物质从蛋白质上除去，并显示游离于溶液中。以这种形式，其可以通过该流体的透析处理容易地除去。
蛋白质(白蛋白)根据周围液体的pH值而具有不同的构象。用水除去有害物质应当在pH 6-9下进行，优选在7至9的pH下，例如在pH 8下。
通过反复加入和除去水来去除有害物质的方法包括下列步骤：a)从血液中分离血浆；b)调节血浆的pH，例如通过加入碱，如氢氧化钠(NaOH)或施加低压以便令二氧化碳脱气；c)加入洗涤液，将pH调节到6至9，例如pH 8；d)洗涤；e)分离洗涤液，其中存在已经从蛋白质上去除的有害物质。
随后重复步骤c)至e)，直到在步骤e)的洗涤液中检测不到有害物质或检测到极少量有害物质。
该方法的优点在于在透析机中水价格低廉且容易获得。可以使用大量水而不涉及过多的处理问题。该方法可以与高温处理结合，如35至50℃，由此增强该净化效果。
实施例
仅出于例示的目的，而不对其范围作任何限制，下面的实施例确定了依据本发明的实施方案的多个参数。
尿毒症毒素的试验
研究了置换物质对蛋白质的竞争性和变构结合性质。更具体而言，研究了不同的置换物质置换结合牛血清白蛋白的对甲酚的能力，并描述在下列实施例中。作为有害物质，选择对甲酚并认为其代表了不同的尿毒症毒素。
材料与方法
离心分离在(Sartorius AG)中进行。是由两个隔室组成的单一管。上隔室和下隔室由半透膜隔开。施加离心分离以迫使溶剂穿过该膜进入下隔室，在上隔室中留下更浓缩的样品。
采用pH计Orion 420A进行pH测量。
标样与试剂：
牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich，纯度>96％)、对甲酚(有害物质-尿毒症毒素)、水杨酸钠(置换物质和抗凝血剂，纯度99.5％)、乙酰水杨酸(置换物质和抗凝血剂)和辛酸钠(置换物质，纯度99％)购自Sigma-Aldrich。
使用甲醇和Milli-Q水(均为HPLC级)。
通过向乙酰水杨酸(10克)中加入氢氧化钠(NaOH)(2摩尔/升)直到pH值达到7来制备乙酰水杨酸钠(乙酰水杨酸的盐)。将乙酰水杨酸和NaOH的溶液冷冻并放置在冷冻干燥机器中16小时以便令冷冻的NaOH升华，仅留下乙酰水杨酸钠粉末。
分析方法：HPLC
使用粒度为5μm的25cm×4.6mm SupelcosilTM LC-18柱。流动相A由Milli-Q水组成，流动相B是甲醇。该分析方法是无梯度的(isocratic)，使用50％的流动相A和50％的流动相B，流速为1毫升/分钟。柱温度为25℃，注射体积为20μL。通过使用二极管阵列检测器(DAD)对尿毒症溶质(对甲酚)进行定量。在280nm和254nm的波长下监控该检测器。对甲酚的最佳UV吸收发生在280nm处。三种不同浓度(0.005mg/ml、0.02mg/ml和0.04mg/ml)对甲酚的标准曲线用于所有对甲酚分析。
样品制备
对甲酚：通过在蒸馏水(Milli-Q)中溶解对甲酚来制备浓度为1mg/ml的储备溶液。工作标准溶液通过用Milli-Q水适当稀释该储备溶液来制备。制备三种不同浓度的对甲酚，并通过HPLC进行分析以评估对甲酚的保留时间和吸光度：
对甲酚的正常血液浓度：0.005mg/ml
对甲酚的尿毒症血液浓度：0.02mg/ml
对甲酚的最大尿毒症血液浓度：0.04mg/ml。
进行下列试验：
实施例A：对甲酚结合白蛋白(BSA)的试验
实施例B：在置换物质存在下对甲酚结合白蛋白(BSA)的试验
实施例C：pH对实施例B的样品的影响的试验
实施例D：温度和pH的影响的试验
实施例E：不同温度的试验
实施例F：对甲酚与两种置换物质的组合一起结合白蛋白的试验
实施例G：对甲酚与置换物质一起结合白蛋白的试验
实施例H：向BSA和对甲酚的混合物中加入透析液
实施例I：向BSA和对甲酚的混合物中加入水
实施例J：水的影响的试验
实施例K：在高温下水的影响的试验
实施例A：在不同pH值条件下对甲酚结合白蛋白
测试不同浓度下对甲酚结合蛋白质(牛血清白蛋白，BSA)的能力。BSA的浓度保持在正常血液中的水平(40mg/ml)。组分在水中混合并在(Sartorius AG)中在室温下在5700rpm下离心分离60分钟以除去蛋白质。
表1中显示了制备的样品。
表1：制备的样品的对甲酚浓度：
样品： BSA(mg/l) 对甲酚(mg/ml)
A1 40 0.005
A2 40 0.02
A3 40 0.04
A4 40 0.01
通过分别制备具有5、7和8的pH的含有40mg/mlBSA和0.02mg/ml对甲酚(上表的样品A2)的1毫升样品来制备样品。在适当情况下，通过向该溶液中加入氢氧化钠(NaOH)或盐酸(HCl)来调节pH。在离心分离和通过HPLC的分析之前测量样品的pH。
pH对对甲酚与BSA的结合的作用显示在表2中。
表2–在不同pH下测试的样品A2
pH 对甲酚的实测浓度(mg/l)
5 0.0002
7 0.0032
8 0.0037
在pH 5，基本未检测到游离的对甲酚，因此认为所有对甲酚结合到BSA。而在pH 7和8，检测到一定量的未结合对甲酚，由此断定在较高pH下对甲酚对BSA的结合被削弱。在pH 7和8下对甲酚对BSA的结合的弱化有可能是由于蛋白质在6至9的pH范围内发生的构象改变，发生了对甲酚与BSA之间范德华相互作用的断裂。由此，可以断定构象由N改变为B(由中性至碱)，更多的对甲酚在高pH值(尤其pH 8)下从白蛋白上解离。
实施例B：在置换物质存在下对甲酚结合白蛋白(BSA)的试验
通过在水中溶解BSA至类似血液的浓度(40mg/ml)来制备样品。加入对甲酚以获得尿毒症浓度(0.02mg/ml)，并以不同浓度加入置换物质(10、100和200mg/ml)。
该实施例中包括的置换物质是水杨酸钠、辛酸钠和乙酰水杨酸钠。
在分析前，在室温下将混合溶液在5700rpm下离心分离70分钟以除去蛋白质。通过向样品中加入NaOH将pH调节至7(生理pH)。将该样品注射到HPLC中。在室温下通过HPLC分析来测量对甲酚。
制备的样品显示在表3中。在表3中还给出了测得的对甲酚浓度(mg/ml)的结果。
表3：
水杨酸钠对于对甲酚与蛋白质(BSA)的结合具有竞争作用。可以断定，样品中使用的水杨酸钠的浓度越高，游离对甲酚的浓度也越高。这意味着水杨酸钠与对甲酚争夺结合位点(更具体为蛋白质的位点II)，效果在于抑制了对甲酚结合白蛋白。此外，水杨酸钠还可以结合白蛋白上的其它位点(例如位点I)并诱导位点II的区域中的变构变化，导致结合在此处的对甲酚被置换。因此，可以断定，水杨酸钠充当置换物质并能够从对甲酚在蛋白质上的结合位点处将其置换。
表3中样品B1a-B1c的结果表明，可以检测到游离对甲酚。当水杨酸钠浓度提高时，未结合的对甲酚的浓度提高。在所有样品中，BSA的浓度为40mg/ml，对甲酚的浓度为0.02mg/ml。pH保持在7。
此外，样品B2a-B2c的结果表明，由于存在从对甲酚在白蛋白上的结合位点处将其置换的辛酸钠，一定量的对甲酚从蛋白质上被释放。游离对甲酚的浓度随着辛酸钠浓度提高而提高。辛酸钠以与高于与位点I的亲和力结合到蛋白质的位点II。对甲酚可以直接置换，或可以在位点II区域中诱导变构变化，并且发生对甲酚从位点II的释放。在实施例B2c中发生沉淀。
此外，由样品B2a-B2c的结果还可以观察到，当辛酸钠浓度为10mg/ml和100mg/ml时检测到游离对甲酚。这里pH也保持在7。
以相应的方式，样品B3a-B3c的结果(由此为对甲酚和乙酰水杨酸钠)表明乙酰水杨酸钠在其与蛋白质的结合方面与对甲酚竞争。乙酰水杨酸钠的浓度越高，在样品中检测到越多的游离对甲酚。乙酰水杨酸钠还可以结合至其它位点并诱导位点II的变构变化。由此结果可以证实，乙酰水杨酸钠从对甲酚在白蛋白上的结合位点处将其置换。
样品B3a-B3c的结果表明，pH 7时当乙酰水杨酸钠的浓度为至少10至100mg/ml时，可以检测到游离对甲酚。
实施例C：pH对实施例B的样品的影响
研究了pH值对对甲酚与结合竞争物对牛血清白蛋白(BSA)的结合亲合力的影响。选择的pH为pH 5、6、8和9，通过加入氢氧化钠(NaOH)或盐酸(HCl)来调节该pH。该试验用下列置换物质进行：水杨酸钠、辛酸钠和乙酰水杨酸钠。结果显示并证实，pH是影响对甲酚和置换物质的亲和力的重要参数。在特定pH值下提高了结合竞争物对对甲酚的置换。pH对结合亲和力的作用与预期作用一致，因为白蛋白在6至9的pH范围内发生蛋白质的构象变化(由N至B型)。在pH 5处白蛋白以N型存在。结果显示在表4中。
表4：
在表4中显示了pH对水杨酸钠与对甲酚对BSA的结合的作用。未结合的对甲酚的量在低pH处，尤其在pH 5处提高。由此，更多对甲酚从其在BSA上的结合位点处被水杨酸钠置换。这可能取决于pH 5时的白蛋白构象，由此在其N型中，可以以更高的亲和力结合水杨酸钠。提高pH，水杨酸钠对BSA的结合亲和力降低，因为BSA发生构象变化(由N至B型)。可以断定，N型的BSA比其B型更强地结合水杨酸钠。在更低的pH，pH 4下，发生沉淀。在pH 8处，基本未观察到效果，可能是由于蛋白质的构象(B型)以较低的亲和力结合水杨酸钠。
此外，显示了对乙酰水杨酸钠的结果。当乙酰水杨酸钠的浓度为200mg/ml且pH 5时游离对甲酚的浓度最高。在pH 8时基本无法检测到对甲酚。
此外，在表4中显示了pH如何改变对甲酚和辛酸钠对BSA的结合亲和力的研究结果(样品B2a-B2c)。当存在辛酸钠时在具有低pH的溶液中显示出游离对甲酚浓度提高。提高pH时，未结合的对甲酚的量降低，对甲酚保持未结合到牛血清白蛋白(BSA)。这种效果最有可能是由于蛋白质在6至9的pH范围内的构象变化。在pH 6处，蛋白质为N型。假定蛋白质在该构象中结合更多辛酸钠，导致对甲酚由其在白蛋白上的结合位点被置换。在更高的pH下，高于6的pH值，白蛋白开始越来越多地以B型存在。在该pH下，结合亲合力对于辛酸钠而言较低。在pH 5处，观察到溶液沉淀。在pH 6处，采用100mg/ml和200mg/ml的辛酸钠浓度，在溶液中发生沉淀。
在表4(样品B3a-3c)中显示了乙酰水杨酸钠的相应结果。该结果表明，对甲酚和乙酰水杨酸钠对牛血清白蛋白的结合亲和力如何被不同pH改变。包含浓度为200mg/ml的乙酰水杨酸钠的溶液因沉淀而未包括在内。
显示了当存在乙酰水杨酸钠时，在低pH下从对甲酚在BSA上的结合位点处被更多地除去。当pH提高时，未结合对甲酚的量降低。这可能是由于N型白蛋白具有对水杨酸钠和辛酸钠的更高的结合亲和力。N型的白蛋白具有对乙酰水杨酸钠的更高的结合亲和力，这转而可以置换更多的对甲酚。当pH提高时，这种结合弱化，因为构象变为该蛋白质的B型。
此外，显示了当乙酰水杨酸钠浓度提高时，未结合的游离对甲酚的量增加。在所有受试样品中，BSA的浓度为40mg/ml，对甲酚的浓度为0.02mg/ml。
实施例D：温度和pH的影响
研究了在结合竞争物的存在下温度和pH的组合对对甲酚对牛血清白蛋白(BSA)的结合亲和力的影响。在50℃(加热柜)下离心分离之前调节样品中的pH。
关于温度与pH的影响进行的试验显示在表5中。
表5：
根据实施例A和C中获得的结果调节各样品的pH以便在所采用的浓度下最大化效果。
表6中显示了实施例D1至D4的结果。
研究了在特定pH值下随结合竞争物的浓度而改变的对甲酚实测浓度，还研究了温度对对甲酚和结合竞争物对牛血清白蛋白(BSA)的结合亲和力的作用。清楚地表现出温度的作用；与室温相比，在50℃温度下结合竞争物从对甲酚在白蛋白上的结合位点处将其更多的置换。
表6.高温和变化的pH的影响的试验
实施例E：不同温度下置换物质的组合
研究了两种不同的结合竞争物的组合的协同效应。测试了下列组合物：
表7
在室温下和在50℃的提高温度下测试了这些组合物以便研究温度对对甲酚与结合竞争物对牛血清白蛋白(BSA)的结合亲和力的影响。pH调节至pH 6(根据实施例C中获得的结果)。
两种结合竞争物的组合对从对甲酚在白蛋白上的结合位点处将其去除具有比单独作用于蛋白质结合位点的单一结合竞争物更好的效果。在所有样品中将pH调节至6，因为如前面提到的结果中解释的那样，在结合竞争物的存在下当pH降低时游离对甲酚的量提高。此外，当加热时，更多对甲酚从白蛋白上解离。
表7：显示了在两种置换物质的存在下对甲酚的实测量
在不存在结合竞争物的情况下基本未检测到游离对甲酚。
对于下面的实施例(F、G、H和I)，通过在蒸馏水(Milli-Q)(5毫克)中溶解对甲酚(5毫克)来制备浓度为1mg/ml的溶液(储备溶液)。由批次不同于在先制备(实施例A)的BSA制备该BSA溶液。该BSA的杂质可以在本BSA中推断。由该储备溶液制备不同浓度的对甲酚。
对甲酚的正常血液浓度：0.005mg/ml
对甲酚的尿毒症血液浓度：0.02mg/ml
对甲酚的最大尿毒症血液浓度：0.04mg/ml。
实施例F：置换物质的组合
两种不同的结合竞争物的组合用于研究该组合的性质。制造下列溶液：
该试验在37℃的温度和调节为6的pH值下进行。
实施例G：不同置换物质的试验
制备具有正常血液浓度40mg/ml的牛血清白蛋白、具有尿毒症浓度0.02mg/ml的对甲酚和10mg/ml的结合竞争物(水杨酸钠、辛酸钠和乙酰水杨酸钠)的溶液。制备包含置换物质组合的溶液(10mg/ml的水杨酸钠与10mg/ml的辛酸钠组合；10mg/ml的辛酸钠与10mg/ml的乙酰水杨酸钠组合)。样品的pH分别调节至pH 5、5.3、5.6和5.9。如上用HPLC测量各样品中置换的对甲酚的量。该结果显示在图1a-1e中。
这些实施例证实了其中使用另一种BSA的实施例A-E中进行的试验。
由实施例I和图1a-1e中显示的结果，可以做出与在先实施例中给出的相同结论。已经显示，通过改变pH可以改变结合亲和力。
实施例H：向BSA和对甲酚的混合物中加入透析液
将含有0.02mg/ml的对甲酚和40mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)的溶液离心()20分钟，随后取出0.5毫升并进行分析。随后，在离心机(Vivaspin)中向剩余的0.5毫升溶液(对甲酚和BSA)中加入0.5毫升透析液(SelectBag One，用37毫摩尔/升碳酸氢钠和103毫摩尔/升NaCl稀释)并离心20分钟，取出0.5毫升用于分析。重复该程序直到通过HPLC检测不到对甲酚。
对不含有加入的对甲酚的溶液重复相同的程序。该试验在pH 8和室温下进行。
结果显示在图2a中。
实施例I：向BSA和对甲酚的混合物中加入水
在pH 8下1毫升含有0.02mg/ml对甲酚和40mg/ml牛血清白蛋白的溶液在37℃(加热柜)的温度下离心20分钟，随后取出0.5毫升并进行分析。随后，在离心机(Vivaspin)中向剩余的0.5毫升溶液(对甲酚和BSA)中加入0.5毫升水(Milli-Q)并再次离心，直至取出0.5毫升用于分析。重复该程序20遍直到通过HPLC检测不到对甲酚。该pH调节至8。
该试验在pH 8和37℃下进行。
结果显示在图2b中。
实施例J：水的影响的试验，在pH 8下向BSA和对甲酚的混合物中加入水
在该实施例中研究了加入水对对甲酚对牛血清白蛋白的结合亲和力的影响，该实施例在室温下进行。将1毫升包含0.02mg/ml对甲酚和40mg/ml牛血清白蛋白的溶液离心()20分钟，取出0.5毫升溶液并进行分析。
向剩余的0.5毫升溶液(对甲酚和BSA)中加入0.5毫升水(Milli-Q品质)并再离心(在中)20分钟，随后再取出0.5毫升用于分析。该程序重复16遍，直到通过HPLC无法检测到对甲酚(计算量0.01989毫克)。这意味着几乎100％的加入的对甲酚从BSA上的结合位点被去除。水的加入通过破坏对甲酚与BSA之间的范德华相互作用而影响对甲酚对BSA的结合。此外，水在结合与未结合的对甲酚之间达到了平衡，导致在加入水之后，在调节新的平衡时一定量的结合的对甲酚从其结合位点处被去除。
根据实施例A中的结果选择和调节储备溶液(BSA和对甲酚)中的pH值以最大化该效果。
结果显示在图2c中。
实施例K：在高温下(pH 8)向蛋白质和对甲酚的混合物中加入水
在提高的温度下重复前面的试验。在50℃下将1毫升含有0.02mg/ml对甲酚和40mg/ml牛血清白蛋白(BSA)、pH 8的溶液离心()20分钟，直至取出0.5毫升并进行分析。随后向包含对甲酚和BSA的剩余0.5毫升溶液中加入0.5毫升水(Milli-Q)，离心20分钟，直至取出0.5毫升用于分析。该程序重复20遍，通过HPLC无法检测到对甲酚。将溶液中的pH调节至8，因为在该pH值下观察到最有效的结合亲和力(实施例A)。
在每次重复后测量对甲酚。对甲酚的实测量为0.027毫克，由此超出了对甲酚的加入量。由此断定，在水的作用下在高温下发生了样品的一定程度的降解。这还表明，蛋白质的污染物具有与对甲酚相同的保留时间，因为保留时间在使用5毫升后向更低的值移动。此外，这还可能由于体系中的集成故障(integration faults)。加入5毫升水后，认为大约100％的对甲酚被释放，其余部分为污染物。
结果显示在图2d中。
虽然已经结合目前认为最实际的实施例对本发明进行了描述，要理解的是，本发明不限于公开的实施方案，相反，意在覆盖包括在所附权利要求书的精神与范围内的各种修改与等同物。
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Claims (16)

1.选自C5-C10-脂肪酸、或其衍生物、或其盐；和水杨酸、其衍生物或其盐；或其组合的物质作为置换物质用于在体外生物流体中去除结合蛋白质的有害物质的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中该置换物质是C5-C10-脂肪酸、或其衍生物、或其盐。
3.根据权利要求1所述的用途，其中该置换物质是水杨酸、其衍生物或其盐。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中该有害物质包括对甲酚、硫酸对甲酚、硫酸吲哚酚、CMPF及其组合。
5.根据权利要求1所述的用途，其中该蛋白质是白蛋白。
6.根据权利要求1所述的用途，其中该体外生物流体选自血液；血浆；或腹腔液。
7.根据权利要求1所述的用途，其中该置换物质是C5-C10-脂肪酸、或其衍生物、或其盐；和水杨酸或其衍生物的组合；优选该置换物质是水杨酸钠和乙酰水杨酸钠中的一种或两种与辛酸钠(C8-脂肪酸盐)的组合。
8.选自C5-C10-脂肪酸、或其衍生物、或其盐；和水杨酸、其衍生物或其盐；或其组合的置换物质用于制备净化液的用途，所述净化液用于去除生物流体中结合蛋白质的有害物质。
9.去除体外生物流体中的有害物质的方法，包括：
a)在置换物质置换或替代结合蛋白质的有害物质的条件下将置换物质引入到生物流体中，由此在生物流体中产生其它的未结合的有害物质；和
b)从该生物流体中去除未结合的有害物质；
其特征在于所述置换物质选自C5-C10-脂肪酸、或其衍生物、或其盐，水杨酸、或其盐，或乙酰水杨酸、或其盐；或其组合。
10.根据权利要求9所述的方法，其中该置换物质是选自水杨酸或其钠盐、乙酰水杨酸或其钠盐、辛酸或其钠盐；或其组合中的一种或多种。
11.根据权利要求9或10的方法，其中所述步骤a)和步骤b)在30至60℃的温度下；优选在35至50℃的温度下进行。
12.根据权利要求9至11中任一项的方法，其中所述步骤a)和步骤b)在5至8的pH，优选在5至6的pH条件下进行。
13.根据权利要求9至12中任一项的方法，其中所述生物流体是血液；血浆；或腹腔液。
14.根据权利要求9至13中任一项的方法，其中所述步骤b)通过透析、电渗析或血浆置换中的任意一种方法来进行。
15.用于从体外生物流体中去除有害物质的净化液，包含一种或多种置换物质，所述置换物质选自C5-C10-脂肪酸、或其衍生物、或其盐，水杨酸或其盐，或乙酰水杨酸、或其盐；或其组合；该置换物质优选是选自C8-脂肪酸或其盐；水杨酸或其盐；乙酰水杨酸或其盐；或其组合中的一种或多种。
16.系统，其配置为从血液中去除有害物质，所述系统包含血液回路，流体回路和血液处理单元，所述血液处理单元包含一个或多个将流体隔室与血液隔室分隔开的半透膜，任选具有从血液中分离血浆的装置；具有将血液，或分离的血浆与净化液混合并引导所述混合物穿过所述血液隔室的装置，
其特征在于该净化液包含去除结合蛋白质的所述有害物质的置换物质，并且所述置换物质选自C5-C10-脂肪酸、或其衍生物、或其盐，和水杨酸、其衍生物或其盐，或其组合；优选选自C8-脂肪酸或其盐；水杨酸或其盐；乙酰水杨酸或其盐，和/或其组合。
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