CN104388541A - miR-1914*和miR-1915的用途 - Google Patents
miR-1914*和miR-1915的用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104388541A CN104388541A CN201410562511.2A CN201410562511A CN104388541A CN 104388541 A CN104388541 A CN 104388541A CN 201410562511 A CN201410562511 A CN 201410562511A CN 104388541 A CN104388541 A CN 104388541A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mir
- cell
- group
- hct116
- oxa
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
- C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及miR-1914*和/或miR-1915作为大肠癌化疗药物的耐药性标示物的应用,以及其在制备具有抑制大肠癌转移、侵袭、凋亡、增值功能的药物中的应用。本发明中的miR-1914*和miR-1915是存在于血浆中,可以检测,并且它们在大肠癌耐药患者血浆中成下调趋势,其具有相对的组织特异性,既与大肠癌一线化疗耐药有关,同时还影响患者预后。miR-1914*和miR-1915单独使用或联合使用在大肠癌一线化疗耐药中起较为重要的作用,尤其是联合使用效果更好。
Description
技术领域
本发明设计涉及一种microRNA的用途,属于生物技术领域。
背景技术
大肠癌(colorectal cancer,CRC)为结肠癌和直肠癌的总称,大肠癌是指大肠粘膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性病变,预后不良,死亡率较高。全世界范围内大肠癌的发病率男性处于恶性肿瘤的第三位。据国际癌症研究组织(IARc)提供的数据显示,亚洲地区,东亚死亡率为120.1/100,000。我国随着生活水平提高,饮食习惯改变,总体发病率也呈现上升趋势。上海地区近年来大肠癌发生率每年上升4.2%,由原来占恶性肿瘤的第7位上升至第3位。研究表明,肿瘤的发展程度是影响生存期的重要因素,随着肿瘤分期的不断进展,患者的5年生存率大幅的下降。然而,在我国仅有10%的患者初诊时处于T1期,大部分患者就诊时已经处于进展期,故其5年生存率徘徊在20%-50%之间。目前在我国临床大肠癌患者T3、T4晚期期患者较多,预后更差,因此尤其需要引起我国临床肿瘤医生的注意。
大肠癌治疗主要为以手术+化疗为主的综合性治疗。而手术患者中约50%的患者在术后5年内出现复发或转移。术前新辅助化疗可降低大肠癌分期、改善术式选择、提高近期疗效;术后化疗可抑制大肠癌复发、治疗肿瘤转移。结直肠癌辅助化疗始于20世纪50年代,经历探索、争论近30年,直至1988年Buyse等发表了第一个结直肠癌辅助化疗有效的荟萃(meta)分析报告,大家对结直肠癌辅助化疗的有效性才达成共识。10多年来,众多学者致力于结直肠癌辅助化疗的新药开发和新方案设计,其中较为常用的一线化疗为XELOX
,FOLFOX方案。可望降低分期,创造手术机会,提高术后生存率。化疗疗效取决于肿瘤对化疗药物的敏感程度,这由肿瘤自身的生物学特性决定。究其原因可能是由于肿瘤的多药耐药。随着近年来对结直肠癌多药耐药研究,给我们展示了结直肠癌治疗的新突破点,对于结直肠癌多药耐药逆转剂的开发应用,将使结直肠癌的治疗出现质的飞跃。
肿瘤的发生发展与细胞的分子网络异常有密切的关系,细胞从癌变到肿瘤的快速生长、侵袭和转移是一个多因素作用、多基因参与,经过多阶段变化累积起来的、极其复杂的病变过程。通过研究基因的改变以寻找肿瘤的发病原因和诊断及其预后方法是研究肿瘤的重要途径,而最近几年,作为非编码的microRNA对癌症的研究已成为焦点。
microRNAs在1993年首次被发现,长度18-25nt,具有较好的稳定性和易于检测的特点。microRNA在发育,细胞增殖、分化和凋亡等多种细胞径中都起了重要的调节作用。据推测microRNA可能调控至少30%的基因的表达况。microRNA在进化上高度保守,它们广泛存在于植物、线虫以及人类的细胞中它们能有效地抑制相关蛋白质的合成,导致靶mRNA的降解,或者以其他形式调节机制来抑制靶基因的表达,产生基因沉默。microRNA主要通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或阻碍其翻译。microRNA组织特异性和时序性,决定组织和细胞的功能特异性。最近的研究发现,microRNA表达与多癌症相关,大约50%得到注解的microRNAs在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性点(fragile site),这说明microRNAs在肿瘤发生过程中起至关重要的作用,这些microRNAs所起的作用类似于抑癌基因和癌基因的功能。目前在许多肿瘤中已经发现了比较特异性的microRNAs。正因为这些microRNA和临床结果、癌症预后密切相关,它们有望成为肿瘤诊断、靶向治疗及预后预测的新的生物标记物。
目前microRNA在肿瘤发生和发展过程中的生物学作用的研究已取得长足进步,但是还有许多问题有待于进一步解决,许多研究目前尚处于初步阶段。当前microRNAs已成为肿瘤研究中的又一个热点吸引了众多学者的关注。既往对 microRNAs 的研究主要集中于它们在细胞内的活动。 2008 年,Mitchell
等通过分离健康人血浆中的 18~24 个核苷酸的RNA,并发现 microRNAs 能以一种非常稳定的形式存在于人体血浆中,以保护其免受内源性 RNase 的降解。当前种种研究表明microRNA,瘤细胞基因表达模式与正常组织有明显的不同,可以通过检测肿瘤病人循环RNA 中的肿瘤特异的 mRNA 来进行肿瘤的诊断。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种大肠癌化疗药物的耐药性标示物。
本发明为解决第一个技术问题提出的一种技术方案是:miR-1914*和/或miR-1915作为大肠癌化疗药物的耐药性标示物的应用。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种具有抑制大肠癌转移、侵袭、凋亡、增值功能的药物。
本发明为解决第二个技术问题提出的一种技术方案是:miR-1914*和/或miR-1915、含有miR-1914*的编码基因和/或miR-1915的编码基因的重组载体、含有miR-1914*的编码基因和/或miR-1915的编码基因的重组病毒或含有miR-1914*的编码基因和/或miR-1915的编码基因的重组病毒载体在制备具有抑制大肠癌转移、侵袭、凋亡、增值功能的药物中的应用。
本发明要解决的第三个技术问题是提供一种新的大肠癌耐药蛋白。
本发明为解决第二个技术问题提出的一种技术方案是:NFIX作为大肠癌耐药蛋白的应用。
本发明具有积极的效果:
(1)本发明使用基因芯片技术筛选出miR-1914*和miR-1915两个microRNA。经过多组大量的验证,表明miR-1914*和miR-1915是存在于血浆中,可以检测,并且它们在大肠癌耐药患者血浆中成下调趋势,从而可以作为大肠癌化疗药物的耐药性标示物,可以制成试剂盒,用于区分耐药大肠癌与化疗敏感大肠癌。
(2)本发明证实了miR-1914*和miR-1915能够影响耐药大肠癌细胞的耐药性,使其对化疗药物敏感。且miR-1914*和miR-1915共同作用于耐药大肠癌细胞要强于单个microRNA对耐药大肠癌细胞的影响。
(3)本发明证实了miR-1914*和miR-1915在体内也能影响耐药大肠癌的耐药性,且对大肠癌细胞的转移,侵袭,凋亡,增值产生影响。从而miR-1914*和/或miR-1915,或者含有miR-1914*的编码基因和/或miR-1915的编码基因的重组载体、重组病毒、重组病毒载体可以制备具有抑制大肠癌转移、侵袭、凋亡、增值功能的药物。
(4)本发明证实了miR-1914*和miR-1915具有相对的组织特异性,既与大肠癌一线化疗耐药有关,同时还影响患者预后。miR-1914*和miR-1915单独使用或联合使用在大肠癌一线化疗耐药中起较为重要的作用,尤其是联合使用效果更好。
(5)本发明证实了miR-1914*和miR-1915的共同靶基因为NFIX,miR-1914*和miR-1915主要通过NFIX影响耐药大肠癌中的耐药蛋白,NFIX是新的大肠癌耐药蛋白。
附图说明
图1是实施例1中的某个样本取RNA水溶液行1%的琼脂糖凝胶电泳图;
图2是实施例1中血浆miR-1914*在四期大肠癌一线化疗有效组、四期大肠癌一线化疗耐药组中表达的散点图;
图3是实施例1中血浆miR-1915在四期大肠癌一线化疗有效组、四期大肠癌一线化疗耐药组中表达的散点图;
图4是实施例2中对质粒表达载体(pcDNA-copGFP vector)进行酶切线性化处理的原理示意图;
图5是实施例2中对质粒表达载体(pGL3-promoter vector, E1761, Promega)进行酶切线性化处理的原理示意图;
图6是实施例2中转染miR-1914*和miR-1915后对耐药细胞凋亡的各组比较图表;
图7是实施例2中NFIX、Pgp、BCL-2、MDR1、Beta actin在五组细胞组中的表达水平电泳图;
图8是实施例2中NFIX、Pgp、BCL-2、MDR1、Beta actin在九组细胞组中的表达水平电泳图;
图9是实施例3中各组瘤体的照片;
图10是实施例3中各组裸鼠成瘤,注射药物后肿瘤比较抑制率分析图表;
图11是实施例3中裸鼠瘤体内的NFIX、CyclinD1、VEGFC,P53、Survivin蛋白的改变影响电泳图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述,有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中,若非特意表明,所用的试剂均为分析纯,所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件,或按照制造商所建议的条件。除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。统计结果中的“*”表示p<0.05,“**”表示p<0.01。一个RNA前体的双臂分别加工产生miRNA,则根据克隆实验,在表达水平较低的miRNA命名时在末尾加“*”。
实施例
1
(人结直肠癌化疗耐药与敏感血浆
microRNA
的差异表达)
一、实验准备。
1、研究对象。
选取复旦大学附属肿瘤医院大肠外科进行原发病灶切除术Ⅳ期大肠癌患者,患者术前未进行放化疗,术后进行了规范标准的一线XELOX方案化疗。结直肠癌组织参照全国结直肠癌协作组结直肠癌诊治规范以及 AJCC/UICC 的 TNM 分期标准行诊断、分级和分期。研究对象共100例,共分为2组:四期大肠癌耐药组(n=57)、四期大肠癌有效组(n=43),具体情况如表1所示。
表1 大肠癌患者临床资料
注:浆膜下层 (ss), 穿透浆膜层
(se), 侵入邻近器官 (si)
2、主要试剂。
microRNA芯片(Agilent human miRNA (8*60K) V16.0 芯片)、microRNA 标志杂交试剂盒购自illumina 公司。mirVanaTM PARISTM(专用于抽提血的miRNA
) (Cat#AM1556, Ambion, Austin, TX, US),miRNA扩增和逆转录使用cDNA Synthesis
Kit(EXIQON, Denmark),Master Mix(EXIQON,
Denmark)。
3、主要仪器。
microRNA
芯片扫描仪,杂交仪,杂交旋转烘箱购自 illumina 公司,ABI 7900型荧光定量 PCR 仪。NanoDrop 1000核酸测定仪,Eppendorf
5810R冷冻离心机。
二、实验方法。
1、实验分组。
本实施例的实验共分为两部分,第一部分为microRNA芯片分为大肠癌化疗耐药组和有效组各3例。第二部分为大样本RT-PCR验证阶段,分为2组,分别为大肠癌化疗耐药组、大肠癌化疗有效组。大肠癌组临床资料如表1所示。
化疗后评估标准 治疗反应依据RECIST (version1.0)每9周进行临床和CT检查,部分反应(PR)和完全反应(CR)都归为治疗有效组。稳定(SD)和进展(PD)归为治疗耐药组,所有CT检查都由同一检查者评估。
2、样本 RNA 的提取与标记。
2.1、血浆的分离
从各实验对象抽取外周静脉血5ml(在知情同意的前提下,获取患者和志愿者的标本)抗凝管保存,820g,4℃,离心10分钟。离心后管内分为两层,上层为血浆,下层为血液中的各种细胞,吸取上层血浆, 16000g,4℃,离心10分钟,小心吸取上清到新的离心管中,置于-80℃保存备用。
2.2、总 RNA 抽提及纯化
采用mirVanaTM PARISTM并且根据生产厂商提供的标准操作流程进行样品的total RNA抽提,抽提所得total
RNA经Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent
technologies, Santa Clara, CA, US)电泳质检合格后备用。
2.3、样品RNA的标记
验样品RNA采用Agilent
miRNA芯片配套的试剂盒,miRNA Complete Labeling and Hyb
Kit(Cat#5190-0456, Agilent technologies, Santa Clara, CA, US),按照标准操作流程的标记部分对样品中的miRNA分子进行荧光标记。
2.4、芯片杂交
按照Agilent miRNA芯片配套提供的标准操作流程和配套试剂盒,miRNA Complete Labeling and Hyb
Kit(Cat#5190-0456, Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)的杂交部分,进行样品的杂交实验。在滚动杂交炉中,Hybridization Oven(Cat#G2545A, Agilent
technologies, Santa Clara, CA, US),55℃,20rpm,滚动杂交20小时。杂交完成后在洗缸staining dishes (Cat#121, Thermo Shandon, Waltham,
MA, US)中洗片,洗片所用的试剂为 Gene Expression Wash Buffer Kit
(Cat#5188-5327, Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)。
2.5、芯片杂交
芯片结果采用Agilent Microarray Scanner(Cat#G2565BA,Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)进行扫描,用Feature Extraction software 10.7 (Agilent technologies,
Santa Clara, CA, US)读取数据,软件设置Scan
resolution=5μm, PMT 100%,5% 最后采用Gene Spring
Software 11.0(Agilent technologies, Santa Clara, CA, US) 进行归一化处理,所用的算法为Quantile。
2.6、荧光定量实时聚合酶链反应(RT-PCR)
挑选差异表达的 microRNA中的2个miRNAs(miR-1915,miR-1914*)进行定量 RT-PCR 的验证,microRNA 的 RT-PCR 方法参照cDNA Synthesis Kit,引物由EXIQON公司合成。采用 microRNA 16 作为内标。按试剂盒说明书进行操作。反应体系如表2所示。反应条件如表3所示。反应完成后,把加好样品的384孔板放在 ABI 7900型荧光定量 PCR 仪中进行反应。
表2 反应体系组分表
表3 反应条件表
三、统计分析和结果判定。
正态分布数据用均数±标准差( ±s表示)。组间比较使用t检验。非正态分布组间比较实用K检验。所有统计与分析均采用统计软件包SPSS19.0。
1、总 RNA 和 microRNA 提取质量的分析。
每份样本总 RNA 的 A260/A280 比值在 1.75-2.00,如图1所示,电泳结果显示每份样品总 RNA均有清晰的 28s 和 18s 条带,RNA 完好无降解,质量符合 microRNA 芯片的质量要求。
2、microRNA 在四期大肠癌耐药组和敏感组的差异表达。
在四期大肠癌患者耐药组和敏感组中各挑选3例取血浆进行芯片杂交,结果进行统计分析后显示,其中有5个有显著性差异(差异倍数5倍以上,P<0.05)。分别是:hsa-miR-33b*,hsa-miR-3676,hsa-miR-3156,hsa-miR-1914*,hsa-miR-1915。其中hsa-miR-1914*,hsa-miR-1915差异较其他差异性microRNA尤其的大,具体结果如表4所示。
表4 对一线化疗(希罗达+奥沙利铂)耐药组和敏感组比较表达差异表
3、差异表达 microRNA 的定量
RT-PCR 验证结果。
如图2和图3所示,根据芯片结果miR-1914*和miR-1915明显表达异常,进一步采用定量 PCR在大样本中进行验证,验证共分为2组共100例:四期大肠癌一线化疗有效组(43例),四期大肠癌一线化疗耐药组(57例)。并采用miR-16
进行归一化。microRNA 定量 PCR 扩增曲线和溶解曲线均为单一峰,说明 PCR 扩增特异性好,PCR 结果显示:大肠癌有效组血浆miR-1914*为16.98±21.53,大肠癌有效组血浆miR-1915为23.96±30.82,大肠癌耐药组血浆miR-1914*为1.38±1.23,大肠癌耐药组血浆miR-1915为10.85±17.09。
4、耐药大肠癌血浆miR-1914*和miR-1915为下调microRNA。
通过PCR结果比较,大肠癌耐药组与有效组比较有统计学意义(P<0.05)。就此可以表明血浆miR-1914*和miR-1915在耐药大肠癌中为下调microRNA,血浆miR-1914*和miR-1915具有组织相对特异性。miR-1914*和miR-1915的核酸序列可以在NCBI (美国国立生物技术信息中心)的GenBank(DNA序列数据库)中查询得到。
实施例
2
(
miR-1914*
和
miR-1915
的体外实验及靶基因功能)
一、耐药细胞株建立和选用。
1、采用现有的耐药细胞株培养方法,采用中科院细胞所提供的LoVo、SW620、HCT-116细胞株进行培养,分别采用药物5-FU和奥沙利铂(Oxaliplatin)对各细胞株进行诱导,5-Fu和Oxaliplatin的起始浓度均为0.01ug/ml,细胞每传代3次,药物浓度升高1倍,分别为:
0.01/0.02/0.04/0.08/0.16/0.32/0.64/1.28/2.56/5.12/10.24/20.48/40.96。
2、采用CCK-8检测细胞IC50。
3、分析比较耐药株及其亲本细胞株对两种化疗药物IC50的变化。
4、使用real time PCR对耐药细胞株中的miRNA含量进行检测。
检测结果显示:Lovo、SW620、HCT116细胞株中miR-1914*的含量分别为:1±0.15,1±0.22,1±0.24。Lovo、SW620、HCT116耐药细胞株miR-1914*的含量分别为:0.69±0.18,0.64±0.13,0.69±0.29,各组亲本与耐药组比较无统计学意义(P>0.05)。Lovo、SW620、HCT116细胞株miR-1915的含量分别为:1±0.18,1±0.16,1±0.14。Lovo、SW620、HCT116耐药细胞株miR-1915的含量分别为:0.37±0.10,0.25±0.08,0.08±0.01,各组亲本与耐药组比较有统计学意义(P<0.05)。
由于HCT116细胞株亲本和耐药组比较其miRNA1915含量差异较大约有3倍差距。结合各细胞株对5-FU+奥沙利铂后IC50比较后选定HCT116/5-Fu/Oxa为研究用细胞株。
二、miR-1914*和miR-1915重组表达载体的构建。
1、根据miR-1914*和miR-1915的核苷酸序列信息设计并合成引物(DSL级)。
2、采用现有的提取技术提取人基因组的DNA,采用琼脂糖凝胶电泳检测人基因组DNA的质量。
3、采用现有的PCR扩增技术进行PCR扩增,PCR产物取5ul进行2%琼脂糖凝胶电泳,检测扩增条带大小,切胶回收目的片段。
4、如图4所示,对质粒表达载体(pcDNA-copGFP
vector)以及回收的PCR片段进行酶切线性化处理。产物使用0.5% 琼脂糖凝胶电泳,目的片段酶切后产物使用2% 琼脂糖凝胶电泳,进行切胶回收。切胶后使用UNIQ-10柱式DNA 胶回收试剂盒回收酶切产物,回收产物使用紫外分光光度计测定浓度,-20℃保存待用。
5、将退火后稀释产物和经过线性化处理的载体连接。
6、转化。取-70℃保存的DH5α感受态细胞,冰浴放置5-10分钟,使之冰中融化;将5ul连接产物加入感受态细胞,用移液枪缓慢混匀,冰浴放置30分钟;将混合物快速放入42℃水浴中进行热击,90秒,取出后冰浴2分钟;将转化产物加入900ul的SOC培养基中,37℃和150转/分钟条件下摇床培养1小时;收集菌液,分100ul和900ul涂布LB(Amp抗性)平板,37℃培养过夜。
7、PCR鉴定阳性克隆。使用无菌牙签挑取3个单菌落,使用载体多克隆位点两端的引物进行PCR扩增检测阳性菌落。
8、测序鉴定。首先,挑取PCR检验阳性菌落于3ml LB液体培养基中,37℃和200转/分钟条件下摇床培养过夜;然后,使用Mini
Plasmid Purification Kit Ver.2.0提取质粒;最后,使用载体多克隆位点的上游引物将质粒DNA送测序。
三、miR-1914*-luciferase和miR-1915-luciferase
报告基因表达载体构建。
1、根据miR-1914*和miR-1915的核苷酸序列信息设计并合成miR-1914*的野生型引物对和突变型引物对,以及miR-1915的野生型引物对和突变型引物对。
2、采用现有的提取技术提取人Total RNA,采用现有的逆转录技术制备cDNA。
3、采用现有的PCR扩增技术进行PCR扩增。
4、如图5所示,对质粒表达载体(pGL3-promoter
vector, E1761, Promega)进行酶切线性化处理。
5、PCR产物酶切及切胶回收。
6、转化。取-70℃保存的DH5α感受态细胞,冰浴放置10分钟,使之冰中融化;将10ul连接产物加入感受态细胞,用移液枪缓慢混匀,冰浴放置30分钟;将混合物快速放入42℃水浴中进行热击,90秒,取出后冰浴2分钟;将转化产物加入900ul的SOC培养基中,37℃和150×g条件下摇床培养1小时;收集菌液,分100ul和900ul涂布LB(Amp抗性)平板,37℃培养过夜。
7、PCR鉴定阳性克隆。每组样品挑取2个单菌落,使用载体多克隆位点两端的引物进行PCR扩增检测阳性菌落。
8、序列分析。对miR-1914*-luciferase和miR-1915-luciferase报告基因表达载体构建序列分析序列结果与设计结果一致。
四、质粒转染及荧光素酶活性检测。
1、去内毒素质粒DNA的制备。使用QIAGEN plasmid midi
kit(Qiagen,12145)试剂盒进行不含内毒素质粒的提取,紫外分光光度检测纯度和浓度。
2、细胞转染。
挑选生长状况良好的P3代293细胞(中科院细胞所提供),在10cm培养皿(Costar)生长密度达到70%时,使用胰酶消化(15050-057,Invitrogen)的方法制备细胞悬液,接种细胞到96孔板(Costar),每孔5×103个细胞,使用500ul完全培养基[使用DMEM(Invitrogen
Cat. #11995073)+10%FBS(GIBCO, 16000-044)],37℃和5%CO2浓度下过夜培养。
正常培养24小时后观察,贴壁细胞密度为75%,细胞梭型,中央发亮,适合使用Lipofectmaine TM 2000(Invitrogen,1668027)转染试剂进行转染实验。吸出旧培养基,每孔添加2ml新鲜的DMEM+10%FBS的完全培养基。
转染实验分组(n=3):①293细胞;②293细胞+pmiR1914*/1915;③293细胞+pGL3-WT;④293细胞+pGL3-MT;⑤293细胞+pmiR1914*/1915
+ pGL3-WT;⑥293细胞+pmiR1914*/1915
+ pGL3-MT。
转染的条件和步骤是取12支2ml离心管(Corning,USA),进行如表5所示的操作(n=3)。
表5 质粒转染的条件和步骤表
转染后24小时后显微镜(IX71-A12FL/PH,Olympus)下观察,细胞状态良好,中央饱满。荧光视场下观察,通过绿色荧光参照,转染效率大约为70%;对细胞进行换液,使用2ml新鲜的DMEM+10%FBS的完全培养基。转染后48小时后镜下观察:细胞略有收缩,培养液中细胞碎片增加。荧光视场下观察,通过绿色荧光参照,转染效率大约为80%。最后收集细胞。
3、荧光素酶活性检测。使用promega公司的双荧光素酶检测系统(E1980,Promega)和荧光素酶检测仪(GloMax 96微孔板发光检测仪,Promega)进行检测。使用海肾荧光素酶(Renilla Luciferase)作为参照,对萤火虫荧光素酶(Firefly
Luciferase)进行均一化处理。
六组实验293、293+pmiRNA、293+pGL-WT、293+pGL-MT、293+pGL-WT+pmiRNA、293+pGL-MT+pmiRNA,所对应的检测结果分别是miR-1914*的含量为:1±0.07,0.97±0.24,12.25±3.01,12.32±2.36,3.25±1.21,11.86±3.17;miR-1915的含量为:1±0.19,0.94±0.18,12.22±1.69,12.65±2.10,1.86±0.43,10.68±1.78。miR-1914*和miR-1915表达载体共转染组与单独转染组比较有统计学意义。
五、重组慢病毒颗粒的包装和生产
1、复苏P2代液氮保存的293
TN(Producer Cell Line)细胞一支。
2、进行细胞传代培养和状态调整。
3、细胞接种后24小时,镜下观察,细胞贴壁密度约为80%,细胞梭型,中央发亮,形态饱满,适合转染实验。即使用慢病毒包装质粒混合物和miRNA1914*及miRNA1915重组质粒共转染293TN细胞,转染前细胞换液,使用添加2%FBS的新鲜DMEM培养基,以10cm培养皿为标准,质粒用量如下:Lentivirus
Package plasmids mix (500ng/ul),20ul;Lenti- miRNA1914*/lenti- miRNA1915 plasmid DNA (500ng/ul),4ul;转染试剂用量每10cm培养皿为40ul。
4、转染后24小时,使用新鲜配制含2%FBS的DMEM培养基对细胞进行换液处理。
5、转染后48小时,镜下观察:细胞液发黄,贴壁细胞密度约为90%,细胞扁平,贴壁状态较好。收集细胞上清,5000×g离心5min,去掉细胞碎片沉淀,然后使用0.45μm的PVDF膜过滤上清液,冰浴过夜保存。
6、病毒滴度的测定。
7、病毒滴度的计算。
ifu/ml(感染单位/ml): 具有感染能力的假病毒颗粒的相对浓度;
MOI(感染复数): 在所有被感染的宿主细胞中,平均每个细胞感染病毒的病毒颗粒数或基因组数。
假设:取了体积为V(μl)的病毒原液进行十倍稀释,在加入了第A次十倍稀释后(即稀释倍数为10A)的病毒稀释液的空中看到了B个带有荧光的细胞,则病毒的滴度计算公式为:病毒滴度=(B/V)*10A荧光倒置显微镜观察copGFP表达记录。
六、HCT116/5-Fu/Oxa细胞病毒感染及基因干预后细胞相关指标检测。
1、确定耐药肠癌细胞(HCT116/5-Fu/Oxa)株慢病毒感染最佳MOI值。
2、重组慢病毒(Lv-miRNA1914*及Lv-miRNA1915)感染HCT116/5-Fu/Oxa细胞后miRNA相对含量检测。
细胞分组、培养、病毒感染条件如表6所示。
表6 细胞分组、培养、病毒感染条件表
通过电镜观察5组病毒转染后的细胞株,将miR-1914*和miR-1915转入HCT116/5-Fu/Oxa后在72小时有明显呈现,96小时候明显增多,表明病毒转染有效,从而明确miR-1914*和miR-1915在耐药细胞株HCT116/5-Fu/Oxa中对耐药的影响。
五组病毒转染后的细胞株中miR-1914*含量依次为:1±0.10,0.94±0.11,5.15±0.38,1.25±0.25,4.97±0.72。各组与细胞对照组比较,HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-miRNA1914*和HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-miRNA1914*+Lv-miRNA1915有显著性统计学意义(P<0.01)。各组中miR-1915含量依次为:1±0.26,1.01±0.07,1.17±0.26,4.36±0.11,4.31±0.77。各组与细胞对照组比较,HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-miRNA1915和HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-miRNA1914*+Lv-miRNA1915有显著性统计学意义(P<0.01)。
3、基因干预后细胞对化疗药物敏感性检测。
对各组细胞进行5-FU和奥沙利铂化疗药物处理终末浓度为10ug/mL,CCK-8检测细胞活性,分别于0小时、24小时、48小时后经行检测并进行数据分析。
化疗药物处理后的HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-miRNA1914*,HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-miRNA1915,HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-miRNA1914*+Lv-miRNA1915组其细胞活性在24h后开始明显减弱,48h后更为明显,HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-miRNA1914*+Lv-miRNA1915较HCT116/5-Fu/Oxa +Lv-miRNA1914*和HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-miRNA1915活性减低明显,如表7所示。表明miR-1914*和miR-1915转染后能明显降低耐药大肠癌细胞株HCT116/5-Fu/Oxa的细胞活性,影响其对5-FU和奥沙利铂的耐药性。
表7 耐药大肠癌细胞株HCT116/5-Fu/Oxa转染后细胞活性检测表
4、基因干预后细胞周期检测。
对各组细胞进行处理,用流式细胞仪(FACS Calibur,BD)进行检测,检测时间点为48h。以了解miR-1914*和miR-1915对大肠癌耐药细胞株细胞周期增值的影响。
HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-miRNA1914*组和HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-miRNA1915组耐药细胞主要停留在G1期。与对照组比较有统计学意义(P<0.05),在S期耐药细胞明显减少有显著统计学意义(P<0.01)。HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-miRNA1914*+Lv-miRNA1915组耐药细胞主要停留在G1期,而G2期和S期细胞明显减少,有统计学意义(P<0.05),如表8所示。表明miR-1914*和miR-1915对耐药大肠癌细胞株HCT116/5-Fu/Oxa有抑制作用,增强大肠癌细胞对化疗药物敏感性,尤以miR-1914*+miR-1915为甚,对整个细胞核的合成过程都有影响。
表8 HCT116/5-Fu/Oxa转染miR-1914*和miR-1915后细胞周期表
5、细胞凋亡检测。
对各组细胞进行处理,采用双染试剂盒:Annexin V : FITC Apoptosis Detection Kit
II (Cat: 556570, BD) 处理凋亡检测细胞样本,然后用流式细胞仪(FACS
Calibur,BD)进行检测,检测时间点为48h。
如图6所示,计算各组细胞凋亡为:HCT116/5-Fu/Oxa组7.03±2.67,HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-Control组6.80±1.97,HCT116/5-Fu/Oxa
+Lv-miRNA1914*组22.85±6.41,HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-miRNA1915组55.65±9.25,HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-miRNA1914*+Lv-miRNA1915组85.83±11.14。各组与空白对照组比较有统计学意义(P<0.05)。HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-miRNA1914*+Lv-miRNA1915组细胞凋亡较其他组最高,HCT116/5-Fu/Oxa +Lv-miRNA1914*组低于HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-miRNA1915组,表明miR-1914*和miR-1915与大肠癌细胞耐药成正相关。
6、Western blotting检测耐药相关蛋白含量。
检测时间点为病毒感染后96h,
具体步骤如下:
(1)细胞总蛋白的抽提。
离心法收集细胞沉淀(约2×107个),使用dPBS洗细胞两次;每组细胞加入1ml的M-PER试剂(M-PER Mammalian
Protein Extraction Reagent ,78501,Pierce,使用前在M-PER试剂中加入蛋白酶抑制剂),使用1ml移液器反复吹打,直至液体变得黏稠;4℃条件下 10000×g 离心5分钟;收集上清液,进行总蛋白浓度检测。
(2)使用BCA法进行总蛋白定量。采用23227 Pierce BCA Protein Assay Kit, 250T试剂盒。
(3)进行SDS-PAGE电泳。
(4)转膜。
(5)杂交。
抗体使用信息及条件如表9所示,具体步骤如下:
① PVDF膜用溶解有5% 脱脂奶粉的TBST封闭:常温封闭2小时,摇床缓慢混匀;
②将封闭的膜用TBST冲洗两遍, 5分钟×2;
③加入一抗,4 ℃ 过夜;
④TBST洗膜:10min,三次;
⑤加入二抗,室温反应1小时;
⑥TBST洗膜:10min,三次。
表9 抗体使用信息及条件表
(6)化学发光试剂检测。采用Pierce®
ECL Western Blotting Substrate, 32106试剂盒。
通过生物信息学方法在TargetScan 和
miRanda信息库中寻找miR-1914*和miR-1915的靶基因,同时结合耐药大肠癌蛋白芯片的结果,寻找可能与大肠癌化疗耐药有关的蛋白。
使用western blot法检测各细胞组蛋白变化情况,其中,除了NFIX,还选择了现有已知的与耐药相关的Pgp、BCL-2、MDR1、KI67、CAP-G、beta actin,beta actin作为参照。通过对各细胞组进行蛋白的测定NFIX、Pgp、BCL-2、MDR1,在HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-miRNA1914*,HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-miRNA1915,HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-miRNA1914*+Lv-miRNA1915中较对照组,有明显降低,如图7所示。从而推断miR-1914*和miR-1915对耐药大肠癌细胞的耐药有影响,NFIX是miR-1914*和miR-1915共同作用的靶基因。
7、NFIX的相对含量检测,载体构建,荧光素酶,序列分析,质粒的包装、转染。其方法与miR-1914*和miR-1915相同。
实验分为9组,分别是:
(1) HCT116/5-Fu/Oxa;
(2) HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-Control;
(3) HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-NFIX;
(4) HCT116/5-Fu/Oxa+miRNA1914*;
(5) HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-Control+miRNA1914*;
(6) HCT116/5-Fu/Oxa+ Lv-NFIX+miRNA1914*;
(7) HCT116/5-Fu/Oxa+miRNA1915;
(8) HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-Control+miRNA1915;
(9) HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-NFIX+miRNA1915;
构建NFIX载体后,将NFIX转入HCT116/5-Fu/Oxa后在72小时有明显呈现,96小时候明显增多,表明病毒转染有效。
将miR-1914*、miR-1915和NFIX转入耐药大肠癌细胞株HCT116/5-Fu/Oxa后, 使用western blot法检测各研究组蛋白变化情况,通过对各组进行蛋白的的测定,可以得到(4) HCT116/5-Fu/Oxa+miRNA1914*组,(5) HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-Control+miRNA1914*组中Pgp、BCL-2、MDR1耐药蛋白的含量要远低于(6)
HCT116/5-Fu/Oxa+ Lv-NFIX+miRNA1914*组。而(6)
HCT116/5-Fu/Oxa+ Lv-NFIX+miRNA1914*组,(7)
HCT116/5-Fu/Oxa+miRNA1915组Pgp、BCL-2、MDR1耐药蛋白的含量要远低于(9) HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-NFIX+miRNA1915组,如图8所示。
观察NFIX对耐药大肠癌细胞株HCT116/5-Fu/Oxa对化疗敏感性是否有变化,进行5-FU和奥沙利铂化疗药物处理终末浓度为10ug/mL,检测细胞活性,分别于0小时、24小时、48小时后经行检测。各组在24h后开始变化,48h后变化明显,其中(3)HCT116/5-Fu/Oxa+Lv-NFIX组细胞活性最高,(7)HCT116/5-Fu/Oxa+miRNA1915组高于(6)HCT116/5-Fu/Oxa+ Lv-NFIX+miRNA1914*组,该3组细胞活性高于其他组。从而推断NFIX影响大肠癌耐药细胞的耐药,与大肠癌对5-FU和奥沙利铂耐药有关。
上述NFIX与大肠癌耐药细胞和miR-1914*、miR-1915的研究表明,NFIX是由miR-1914*、miR-1915调控,是miR-1914*、miR-1915共同靶基因,miR-1914*、miR-1915主要是通过NFIX对耐药细胞产生耐药。
上述实验结果通过统计学方法进行分析。正态分布数据用均数±标准差( ±s表示)。组间比较使用t检验。所有统计与分析均采用统计软件包SPSS19.0。
实施例
3
(
miR-1914*
和
miR-1915
的体内实验)
一、实验准备。
1、细胞株。
自行诱导的HCT116/5-Fu/Oxa(与实施例2相同)。
2、动物。
裸鼠30只,纯BALB/C (nu/mu)品系,体重18~20g,全部为雄性,4-6周龄,由复旦大学医学院动物实验室中心提供,严格在SPF条件下饲养,自由摄取水分和食物,各实验均在无菌超净工作台中进行。
二、实验步骤。
1、移植瘤裸鼠模型的建立和观察。
取对数生长期的HCT116/5-FU/OXA及其转基因细胞株,胰酶消化法制备细胞悬,使用胎牛血清重悬细胞,调整细胞浓度至107个/mL,每只裸鼠于左前肢腋下皮下注射0.1mL, 共30只。接种后15天可观察到皮下肿瘤形成(约3×3mm),从接种后第15天开始,每3天给药一次(80mg/kg)。
给药途径:尾静脉注射药物浓度(各30uL,两组药物使用终浓度调整至50ug/uL
给药次数:各注射6次(18天,每3天给药一次,两组药物间隔6小时)
观察指标及观察时间:
最后一次给药后48小时,先对小鼠称重,然后以颈椎离断法处死全部小鼠。处死后分离肿瘤并称重并计算肿瘤重量抑制率:
抑制率(%)=[1-(实验组肿瘤重量/空白对照组平均肿瘤重量)]×100%
2、病理组织学免疫组化检测。
(1)处死裸鼠后留取肿瘤组织用4%多聚甲醛固定后,行病理组织切片。
(2)脱蜡和水化。
脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
具体步骤是:组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟;无水乙醇中浸泡五分钟;95%乙醇中浸泡五分钟;75%乙醇中浸泡五分钟。
(3)抗原修复。
(4)免疫组化染色SP法。
具体步骤是:脱蜡、水化;PBS洗2-3次各5分钟;3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上,室温静置10分钟;PBS洗2-3次各5分钟;抗原修复;PBS洗2-3次各5分钟;滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟,甩去多余液体;滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时;4℃过夜后需在37℃复温45分钟;PBS洗3次每次2分钟;滴加Ⅱ抗45-50μl,室温静置或37℃1小时;Ⅱ抗中可加入0.05%的tween-20;PBS洗3次各5分钟;DAB显色5-10分钟,在显微镜下掌握染色程度;PBS或自来水冲洗10分钟;苏木精复染2分钟,盐酸酒精分化;自来水冲洗10-15分钟;脱水、透明、封片、镜检。
3、聚丙烯酰胺凝胶电泳(western blotting)
(1)裸鼠处死后,取50mg肿瘤组织匀浆后离心,取上清液移植瘤细胞1x106用PBS液漂洗3次后加入预冷至40C的50μl裂解缓冲液,冰上作用20min,40C,12000r/min离心20min,上清液保存于-200C.采用BCA法测定蛋白浓度。
(2)SDS—PAGE电泳。
配制10%的聚丙烯酞胺凝胶,室温下电泳2h,以标准低分子量蛋白作为参照。
具体步骤如下:
①按垂直平板凝胶制框备用。
②按比例配制分离胶后小心沿一侧加入凝胶框内,注入正丁醇封面,待凝(约30而30min)。
③除去正丁醇,0.5Mtris-HCl(PH6.8)缓冲液冲洗凝胶表面2-3次,滤纸吸干表面的水分。
④按比例配制浓缩胶,沿一侧注入凝胶框,放入梳子,待凝,提取蛋白和标准分子质量的蛋白各20μl,加入还原缓冲液20ml稀释,1000C水煮5min使其变性,取出待用。
⑤凝胶除去梳子,表面用电泳缓冲液冲洗2~3次,小心加满电泳缓冲液,沿梳孔依次加入标准蛋白和细胞提取蛋白,接通电源开始电泳。控制电压浓缩胶60V,分离胶160V。
⑥待指示染料到达凝胶前沿,停止电泳,小心取出凝胶,蒸馏水洗涤凝胶表面。
⑦切去浓缩胶,将分离胶剪去一小角作标记,浸泡在转移缓冲液中。
(3)免疫印迹。
将凝胶置于硝酸纤维素膜上,将蛋白质分子转移至膜,电泳条件:40C,温流250mA,3h。
具体步骤如下:
①将滤纸、硝酸纤维索滤膜剪成与分离胶同样大小和形状后,浸泡在转移缓冲液中15min,硝酸纤维素滤膜事先浸入甲醇中平衡25s。
②打开塑料支撑物,把阴极板平放在屯转移装置上,将预湿的纤维板水平放在阴极板上,依次再放入滤纸、分离胶、硝酸纤维素膜、滤纸,确保各层间均有良好的接触,用玻璃棒在表面滚动排除里面的气泡后,盖上一块预湿的纤维板,合拢塑料支撑物并以滑钮固定,形成一个“三明治”样的装置。
③将“三明治”样的装置和预先冻有冰块的冷却装置插入电转移装置中,加入转移缓冲液。接通电源,调定电压为100V,电流为250mA,转移3h后关闭电源。
④取出硝酸纤维素膜,用铅笔做好标记后,将其剪成小条。
⑤将转有标准分子质量蛋白和细胞提取蛋白的小条放入丽春使用液中5min,蛋白可被染色,水中脱色至丽春红颜色消失。
⑥将转有细胞提取蛋白的膜用5%脱脂奶粉封闭2h,用PBS洗三次,每次10min。
⑦将膜与一抗4oC孵育8-12h,PBS缓冲液洗膜3次,每次l0min。
⑧将膜与二抗室温孵育lh,然后用PBS缓冲液洗膜3次,每次10min。
⑨暗室中将膜进行ECL发光检测,x光片曝光,直至显影出理想条带,定影。
三、实验结果。
本实验数据为计量资料,采用T检验,检验水准a=0.05。结果均以±s形式给出。所有实验数据均用SPSS19.0统计软件包在计算机上进行。
1、肿瘤生长情况。
30只裸鼠随机分为5组:HCT116/5-Fu/Oxa组,HCT116/5-Fu/Oxa -Lv-Con组,HCT116/5-Fu/Oxa
-Lv-miR1914*组,HCT116/5-Fu/Oxa -Lv-miR1915组,HCT116/5-Fu/Oxa -Lv-miR1914*+miR1915组,每组又分为两小组各3只为注射盐水对照组和注射药物组(5-FU+奥沙利铂)。实验期间各组裸鼠均存活,且未出现明显的异常,精神状况,大小便及饮食情况均正常。均在接种部位均有移植瘤生长细胞接种于裸鼠右腋部皮下后,可见皮下移植瘤逐渐体积增,早期为椭圆形,表面光滑,后期为不规则形,有的表面可见有结节,含血管丰富。
切除各组裸鼠肿瘤后计算各组瘤体抑制率,各组分别为:HCT116/5-Fu/Oxa组2.93±3.07,HCT116/5-Fu/Oxa -Lv-Con组3.93±1.83,HCT116/5-Fu/Oxa-Lv-miR1914*组14.16±5.32,HCT116/5-Fu/Oxa -Lv-miR1915组22.91±6.63,HCT116/5-Fu/Oxa
-Lv-miR1914*+miR1915组38.66±8.83,其中转染miR-1914*组与对照组比较有统计学意义(P<0.05),转染和miR-1915组和miR-1914*+miR-1915组与对照组比较有显著统计学意义(P<0.01),且要高于HCT116/5-Fu/Oxa组和
HCT116/5-Fu/Oxa -Lv-Con组(都在5%以下),如图9和10所示。表明miR-1914*和miR-1915能明显改变耐药大肠癌细胞HCT116/5-Fu/Oxa对化疗药的敏感性。
2、miR-1914*和miR-1915对耐药细胞生长的影响
使用western blot法检测各组瘤体内对肿瘤生长、侵袭、凋亡、抑癌基因的改变进行检测。分别选取NFIX、CyclinD1、VEGFC,P53、Survivin检测。研究结果表明miR-1914*和miR-1915对各蛋白有明显影响作用,起到抑制肿瘤生长周期,抑制侵袭和凋亡,对抑癌基因具有促进作用,如图11所示。从而证明了miR-1914*和miR-1915在体外实验,能影响耐药大肠癌细胞HCT116/5-Fu/Oxa对化疗药耐药的影响。通过对肿瘤抑制率的比较,明确了miR-1914*和miR-1915能增强耐药大肠癌细胞对化疗的敏感性,在化疗药物影响下抑制肿瘤的生长。
3、NFIX、CyclinD1、VEGFC,Survivin在各瘤体中的表达水平。
通过免疫组化的方法观察NFIX、CyclinD1、VEGFC、Survivin在各瘤体中的表达水平,证实了miR-1914*和miR-1915能明显改变大肠癌瘤体内的NFIX、CyclinD1、VEGFC、Survivin与western blot结果类似,从而证实miR-1914*和miR-1915影响耐药大肠细胞HCT116/5-Fu/Oxa对化疗的耐药性,从而对化疗药物敏感,影响肿瘤细胞生长、侵袭、凋亡、抑癌基因的改变。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (7)
1.miR-1914*作为大肠癌化疗药物的耐药性标示物的应用。
2.miR-1915作为大肠癌化疗药物的耐药性标示物的应用。
3.miR-1914*和miR-1915联合使用作为大肠癌化疗药物的耐药性标示物的应用。
4.miR-1914*、含有miR-1914*的编码基因的重组载体、含有miR-1914*的编码基因的重组病毒或含有miR-1914*的编码基因的重组病毒载体在制备具有抑制大肠癌转移、侵袭、凋亡、增值功能的药物中的应用。
5.miR-1915、含有miR-1915的编码基因的重组载体、含有miR-1915的编码基因的重组病毒或含有miR-1915的编码基因的重组病毒载体在制备具有抑制大肠癌转移、侵袭、凋亡、增值功能的药物中的应用。
6.miR-1914*和miR-1915、含有miR-1914* 的编码基因和miR-1915的编码基因的重组载体、含有miR-1914*的编码基因和miR-1915的编码基因的重组病毒或含有miR-1914*的编码基因和miR-1915的编码基因的重组病毒载体在制备具有抑制大肠癌转移、侵袭、凋亡、增值功能的药物中的应用。
7. NFIX作为大肠癌耐药蛋白的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410562511.2A CN104388541B (zh) | 2014-10-21 | 2014-10-21 | miR‑1914*和miR‑1915的用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410562511.2A CN104388541B (zh) | 2014-10-21 | 2014-10-21 | miR‑1914*和miR‑1915的用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104388541A true CN104388541A (zh) | 2015-03-04 |
CN104388541B CN104388541B (zh) | 2017-07-04 |
Family
ID=52606498
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410562511.2A Expired - Fee Related CN104388541B (zh) | 2014-10-21 | 2014-10-21 | miR‑1914*和miR‑1915的用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104388541B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107058318A (zh) * | 2017-03-03 | 2017-08-18 | 郑州铁路职业技术学院 | 与长春新碱耐药性相关的microRNA分子miR‑6847‑5p及其应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101657547A (zh) * | 2006-07-13 | 2010-02-24 | 俄亥俄州立大学研究基金会 | 用于诊断和治疗结肠癌相关疾病的基于微小rna的方法和组合物 |
WO2013093635A2 (en) * | 2011-10-21 | 2013-06-27 | Hospital Clinic De Barcelona | Plasma micrornas for the detection of early colorectal cancer |
-
2014
- 2014-10-21 CN CN201410562511.2A patent/CN104388541B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101657547A (zh) * | 2006-07-13 | 2010-02-24 | 俄亥俄州立大学研究基金会 | 用于诊断和治疗结肠癌相关疾病的基于微小rna的方法和组合物 |
WO2013093635A2 (en) * | 2011-10-21 | 2013-06-27 | Hospital Clinic De Barcelona | Plasma micrornas for the detection of early colorectal cancer |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
KENNETH KW TO: "MicroRNA: a prognostic biomarker and a possible druggable target for circumventing multidrug resistance in cancer chemotherapy", 《TO JOURNAL OF BIOMEDICAL SCIENCE》 * |
崔大岺 等: "Hsa-mir-1915通过抑制BCL2表达促进结直肠癌细胞LS174T凋亡", 《2011医学科学前沿论坛第十二届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集》 * |
潘树芳 等: "microRNAs调控消化系肿瘤多药耐药的研究进展", 《世界华人消化杂志》 * |
胡劲松 等: "MicroRNA在晚期大肠癌一线化疗疗效中的预测作用", 《中国癌症杂志》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107058318A (zh) * | 2017-03-03 | 2017-08-18 | 郑州铁路职业技术学院 | 与长春新碱耐药性相关的microRNA分子miR‑6847‑5p及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104388541B (zh) | 2017-07-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106939333B (zh) | miRNA标志物在制备筛查叶酸缺乏群体的宫颈上皮内瘤变试剂中的应用 | |
CN105126120B (zh) | 长非编码rna h19与癌症铂类化疗药物耐药相关性 | |
Chen et al. | Long noncoding RNA (lncRNA) FOXD2-AS1 promotes cell proliferation and metastasis in hepatocellular carcinoma by regulating MiR-185/AKT axis | |
CN110452907A (zh) | 靶向长链非编码rna ddx11-as1的aso、试剂盒及在肝癌治疗中的应用 | |
De Ruyck et al. | A let-7 microRNA polymorphism in the KRAS 3′-UTR is prognostic in oropharyngeal cancer | |
CN109593848A (zh) | 一种肿瘤相关序列、长链非编码rna及其应用 | |
CN107519193A (zh) | 食管鳞癌早期分子诊断标志物及其应用 | |
CN108220446B (zh) | Linc01356作为分子标志物在胃癌中的应用 | |
CN109750104A (zh) | Abhd6在非小细胞肺癌诊断、预后、治疗产品中的应用 | |
CN104232648B (zh) | 一种靶向脂肪酸合成酶的调控因子及其应用 | |
CN116103403B (zh) | 一种用于卵巢癌诊断和预后判断的生物标志物及其应用 | |
CN106167822A (zh) | 一种长链非编码rna及其应用 | |
CN104388541B (zh) | miR‑1914*和miR‑1915的用途 | |
CN110317878A (zh) | 一种用于膀胱癌诊治监测的长链非编码rna及其应用 | |
CN105603117B (zh) | miR-3613用于区分肺鳞癌转移与非转移的miRNA标志物 | |
CN104774966A (zh) | 肺腺癌miRNA标记物 | |
CN111778333B (zh) | 测定edar表达水平的试剂的应用和试剂盒 | |
CN103948941A (zh) | miR-146a-5p在非小细胞肺癌细胞系中的应用 | |
CN103320500A (zh) | MicroRNA-29a通过KLF4促进结直肠癌远处转移的方法 | |
CN113502329A (zh) | 检测腺苷受体a2b表达量的试剂在制备肺腺癌的诊断和/或预后试剂盒中的应用 | |
CN106399485A (zh) | 一种在舌鳞癌癌旁组织中高表达的基因及其应用 | |
CN102453759B (zh) | 一种miRNA在肿瘤诊断和预后判断中的应用 | |
CN103667295B (zh) | 一种抑制FOXC1基因表达的siRNA及其应用 | |
CN105385781B (zh) | Lce3e在诊治口腔癌中的应用 | |
CN107435073A (zh) | mir‑3613及其成熟miRNA的新用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170704 Termination date: 20171021 |