CN104387253A - α–生育醌在治疗糖尿病或肥胖症药物中的应用 - Google Patents

α–生育醌在治疗糖尿病或肥胖症药物中的应用 Download PDF

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李佳
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刘定权
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Abstract

本发明涉及一种化合物α–生育醌的用途。该化合物是从总状蕨藻中采用提取、减压浓缩、萃取、硅胶柱色谱法以及凝胶柱色谱法纯化而得到的α–生育醌。经初步的活性筛选试验证明：该化合物对蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（PTP1B）具有显著抑制活性，因此可用来制备PTP1B抑制剂，也可用于制备治疗糖尿病、肥胖症及其并发症的药物。

Description

α–生育醌在治疗糖尿病或肥胖症药物中的应用
技术领域
本发明涉及α–生育醌为对蛋白络氨酸磷酸酯酶1B具有明显抑制作用的活性成分，从而它可用于制备治疗糖尿病、肥胖症及其并发症的药物。
背景技术
总状蕨藻 Caulerpa racemosa (Forsskål) J. Agardh系绿藻门 (Chlorophyta) 绿藻纲 (Chlorophyceae) 管藻目(Siphonales) 蕨藻科 (Caulerpaceae) 蕨藻属（Caulerpa）海洋植物，主要分布于热带和亚热带海域，生长在潮间带以下的岩石、珊瑚礁上或者中、低潮带的沙地上。在我国海域也有广泛分布，主要集中于福建东山、台湾、海南、西沙、广东沿海。国内外研究表明，总状蕨藻中含有倍半萜类、二萜类、甾体类、甘油酯类、芳香类、酰胺类及生物碱类等成分 (Alarif, W. M. et al, Clean: Soil, Air, Water, 2010, 38(5-6), 548–557；Wang, H. et al, Botanica Marina, 2007, 50(3), 185–190; Ayyad, S.-E. N. et al, Alexandria Journal of Pharmaceutical Sciences, 1994, 8(3), 217–219; Anjaneyulu, A. S. R. et al, Journal of Natural Products, 1992, 55(4), 496–499)。其中多数萜类化合物含有天然界罕见的1,4-二乙酰氧基（醛基）丁二烯结构片断，而生物碱类则为结构奇特的双吲哚类化合物。现代药理学研究表明，从总状蕨藻中发现的次级代谢产物经常表现出很强的抗菌、抗炎、抗病毒、杀虫、抗肿瘤及毒鱼等多样的生物活性（Anjaneyulu, A. S. R. et al, Phytochemistry, 1991, 30(9), 3041-3042; Anjaneyulu, A. S. R. et al, Journal of the Indian Chemical Society, 1991, 68(8), 480; Capon, R. J. Phytochemistry, 1983, 22(6), 1465-1467; Nielsen, P. G. et al, Phytochemistry, 1982, 21(7), 1643–1645; Doty, M. S. et al, Nature, 1966, 211(5052), 990）。
发明内容
本发明在于提供一种化合物α–生育醌及其制备方法和用途。该化合物是从总状蕨藻中采用提取、减压浓缩、萃取、硅胶柱色谱法以及凝胶柱色谱法纯化而得到的α–生育醌，其结构是由理化常数测定及波谱数据分析而确定的。经药理试验研究表明，该化合物对蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（PTP1B）具有显著抑制活性。
因此，本发明的一个目的是提供一种从总状蕨藻中制备化合物α–生育醌的方法。
本发明的另一个目的是提供化合物α–生育醌的用途。具体地说，该化合物在制备蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B) 抑制剂的药物中的应用，进一步在制备治疗糖尿病、肥胖症及其并发症的药物中的应用。
根据本发明的第一个目的，本发明提供一种从总状蕨藻中采用提取、减压浓缩、萃取、硅胶柱色谱法以及凝胶柱色谱法制备化合物α–生育醌的方法，具体步骤如下：
1）制备提取物浸膏
将冷冻的总状蕨藻（C . racemosa）常温下解冻，用乙醇按常规渗漉提取三次，每次渗漉1天，得提取液，将提取液减压浓缩回收乙醇，得粗浸膏；
2）分离纯化
(1) 将上述粗浸膏分散于水中成混悬液，将混悬液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取三次，所得萃取液浓缩分别得到石油醚提取浸膏、乙酸乙酯提取浸膏和正丁醇提取浸膏；
(2) 将乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱层析，以石油醚/丙酮梯度洗脱，根据TLC显色合并相似流份得到5个组分A、B、C、D、E；其中组分C即石油醚/丙酮体积比8:2和7:3洗脱部分依次经Sephadex LH-20凝胶柱层析以二氯甲烷/甲醇洗脱、硅胶柱层析以石油醚/二氯甲烷体积比为6:4—4:6梯度洗脱，得到化合物α–生育醌，化学名为α-tocopherolquinone，化学结构式为：
在上述制备方法中，在制备提取物浸膏步骤中，所述提取采用的乙醇为95%乙醇。
在上述制备方法中，在分离纯化步骤中，所述Sephadex LH-20凝胶柱层析中用的二氯甲烷/甲醇洗脱浓度为体积比1:1。
根据本发明的第二个目的，本发明提供了α–生育醌在制备蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B (PTP1B) 抑制剂、糖尿病药物、肥胖症药物的用途。
本发明对所得结α–生育醌进行了体外PTP1B抑制试验，结果表明该化合物对PTP1B 有明显的抑制活性。因此，可用来制备PTP1B抑制剂，用于治疗糖尿病、肥胖症及其并发症。
附图说明
图1：PTP1B抑制活性测试原理。
具体实施方式
实施例1 α–生育醌的制备
(1) 将冷冻的中国总状蕨藻（C . racemosa）（采自广东湛江沿海）5 kg（干重）常温下解冻，用30 L 95%乙醇渗漉提取三次，每次渗漉24小时，合并提取液；
(2) 将上述提取液在温度≤45℃减压浓缩回收乙醇，得粗浸膏350g；将该粗浸膏分散于水中成混悬液，将混悬液依次用石油醚（1.5L）、乙酸乙酯（1.5L）和正丁醇（1L）分别萃取三次，所得萃取液减压浓缩分别得到石油醚提取浸膏（38g）、乙酸乙酯提取浸膏（160g）和正丁醇提取浸膏（120g）；
(3) 将乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱层析，以石油醚/丙酮梯度洗脱，根据TLC显色合并相似流份得到5个组分（A-E）；其中组分C即石油醚/丙酮体积比8:2和7:3洗脱部分依次经Sephadex LH-20凝胶柱层析（以二氯甲烷/甲醇体积比1:1洗脱）、硅胶柱层析（以石油醚/二氯甲烷体积比为6:4—4:6梯度洗脱），得到化合物α–生育醌。
实施例2
PTP1B抑制活性的测试：
测试原理：见图1。利用分子生物学手段 在大肠杆菌系统表达人源蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（hPTP1B)催化结构域，经纯化后的hPTP1B重组蛋白能水解底物对硝基苯磷酸 (p-Nitrophenyl phosphate，pNPP)的磷脂键，得到黄色可溶产物对硝基苯酚(p-Nitrophenol)，该产物在410nm处有很强的光吸收，因此可以直接检测410nm处光吸收的变化及观察酶的活性变化以及化合物对酶活性的抑制情况。
标准的测活体系：10mM Tris.Cl三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐)，pH 7.6，10mM pNPP，2％DMSO，100nM hPTP1B。
观察指标：动态测定波长为410 nm处的光吸收，时间为3分钟，其动力学曲线一级反应的斜率作为酶的活性指标。
试验方法：用于筛选的蛋白酪氨酸磷酸酯酶PTP1B 是从大肠杆菌中表达并纯化的GST融合蛋白。采用紫外适用底物对硝基苯磷酸（pNPP），观察不同浓度对重组酶的活性的抑制作用，以初步评价化合物的药用效果。临用前将样品溶于DMSO 配成适当浓度， 3 倍稀释，7 个稀释度，设置三复孔，取2μL 样品溶液加入96 孔板，然后加入88μL assay mix (assay buffer，pNPP，H2O)，再加入10μL PTP1B。将96 孔板置于VERSAmax上动态检测波长为410nm 处检测光吸收值，时间为3 分钟。
实验结果的评判与解释：
筛选结果是化合物浓度为20μg/ml 时对酶活性的百分抑制率，抑制率高于50％时，按常规筛选(将抑制率高于50％的被检测化合物稀释成不同的浓度，依上述测试方法进行反应，所有试验均设置复孔)得出IC50，阳性对照正钒酸钠的IC50为2μM。
实验结果：α–生育醌对PTP1B酶抑制活性的IC50为3.85μM。
实验结论：通过分子生物学试验，可以看出α–生育醌对蛋白络氨酸酯酶1B（PTP1B）具有较好的抑制活性，从而可用于制备糖尿病、肥胖症及其并发症的药物中，为了改善性能还可以进一步的添加常用的药用辅料方便制成更易接受的药物形式。

Claims (1)

1. α–生育醌在制备蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B抑制剂、糖尿病药物、肥胖症药物中的应用。
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Citations (2)

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Title
PENG YANG ET AL.: "Bioactive constituents from the green alga Caulerpa racemosa", 《BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY》 *

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